一种杏黄兜兰的无性繁殖方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811089552.9 (22)申请日 2018.09.18 (71)申请人 广西壮族自治区林业科学研究院 地址 530000 广西壮族自治区南宁市邕武 路23号 (72)发明人 陈宝玲 龚建英 唐庆 王华新 林茂 陈尔 唐遒冥 孙利娜 苏莉花 龙定建 (74)专利代理机构 深圳市兴科达知识产权代理 有限公司 44260 代理人 袁士林 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法 (57)摘要 本发明属于植物组。

2、织培养技术领域， 尤其是 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法。 一种杏黄兜兰的 无性繁殖方法， 包括如下步骤： (1)外植体的获得 和处理； (2)外植体采集； (3)外植体表面消毒； (4)诱导培养； (5)丛生芽诱导； (6)增殖培养； (7) 壮苗生根培养； (8)试管苗移栽。 与已有技术相 比， 本发明方法具有外植体取材简便、 易得、 量 大、 不破坏母株， 组培流程简单可行， 成苗周期 短， 产品一致性高， 整体品质标准可控等优点， 是 实现杏黄兜兰商品化生产的一种简便、 快速、 有 效的繁殖方法。 权利要求书2页 说明书7页 CN 109258463 A 2019.01.25 CN 109。

3、258463 A 1.一种杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)外植体的获得和处理： 在10月份时， 选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株， 移入温 室中培养， 诱导走茎分蘖生长； 移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消 毒3min， 将栽培基质装入栽培容器中； 种植时根部深埋， 露出茎基部； 温室保持日温28， 夜 温18， 湿度60-65， 遮阴度50-60， 隔7-10d浇1次无菌水； (2)外植体采集： 5-6个月后， 待杏黄兜兰植株分蘖生长出3-5条走茎时即可作为外植体 备用材料； 从花盆里取出整株杏黄兜兰， 选择长8-10cm、 直径3-4mm的。

4、走茎10条， 要求走茎生 长健壮， 苞片粉白色且紧密贴合茎段； 将选好的走茎在流水下冲洗60min， 之后取出， 用软毛 刷蘸取质量分数为0.1的洗洁精溶液清洗5min， 清理干净走茎表面污物后， 选取顶端幼嫩 的3-4个节段作为外植体； (3)外植体表面消毒： 在超净工作台上， 将选取好的外植体置入75的酒精中浸泡30s， 无菌水漂洗2-3次后取出， 在无菌培养皿中， 用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 然后在走茎 的单个节间上， 用手术刀以 “T” 字形划割法， 环切去除该节段上苞片的3/4， 该条走茎的每个 节间依次处理完成后， 置入0.1的升汞中消毒1min， 用灭菌后的镊子取出， 置入无。

5、菌水中 漂洗3-4次， 用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 再用同样的环切方法去除节间上剩余的1/4 苞片， 环割时勿划伤节处具隐芽的区域， 之后将外植体再次置入0.1的升汞中消毒40s， 取 出后置入无菌水中漂洗3-4次； (4)诱导培养： 在无菌培养皿上， 用无菌滤纸吸干外植体表面的水分， 切除走茎接触消 毒液的一端4-5mm， 然后将走茎切段， 要求每段保留1个节， 节上部保留1/3节段， 下部保留2/ 3节段， 将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入诱导培养基表面， 拧紧瓶盖， 置入温度25 培养室避光培养60d； (5)丛生芽诱导： 待步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽长至1-2cm长时， 。

6、将侧芽切下， 转接入 丛生芽诱导培养基中， 然后置入日温25， 夜温15的培养室继续培养45d， 每天光照12h， 光照强度1000lx； (6)增殖培养： 将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶， 清理干净根部附着的培养 基， 2-3株/丛转接入增殖培养基中， 光照培养45d； 培养温度25， 每天光照12h， 光照强度 1000lx； (7)壮苗生根培养： 将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基中光照培养 90d； 培养温度25， 每天光照12h， 光照强度2000lx； (8)试管苗移栽： 将杏黄兜兰具3cm高的完整植株从培养室转移到具自然光的温室中炼 苗10天， 然后将。

7、其从培养瓶中取出， 洗净根部附着的培养基， 以80多菌灵可湿性粉剂1000 倍液浸泡植株8min后， 自然阴干， 采用口径为5的透明营养钵移栽， 3-5株/杯， 将其移栽至 栽培基质中； 移栽场地保持良好的通风， 移栽后第1个月遮阴度80-85， 湿度控制在85- 90。 2.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述的栽 培基质采用泥炭： 树皮： 锯末： 木炭： 羊粪(V/V)3:3:2:1:1混合均匀， 树皮、 锯末、 羊粪均经 过充分腐熟， 使用前经121高压灭菌20min。 3.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(1)中所。

8、述的栽 培容器采用口径12.5cm， 高13cm的瓦盆， 使用前在500-800倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 109258463 A 2 进行容器消毒。 4.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述的诱 导培养基为1/2MS+6-BA 0.8-1.5mg/L+NAA 0.2-0.8mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.5g/L+蔗糖 20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 5.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(5)中所述的丛 生芽诱导培养基： 1/2MS+BA 0.05-0.1。

9、5mg/L+NAA 0.02-0.08mg/L+蛋白胨1.5g/L+苹果汁 15-30mL/L+土豆汁20-40mL/L+香蕉汁60-80mL/L+活性炭1g/L+蔗糖30-40g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 6.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(6)中所述的增 殖培养基： 1/2MS+TDZ 0.08-0.15mg/L+2， 4-D 2-4mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉汁80-120mL/L+蔗 糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 7.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(7)中所述的壮 苗生根培养基1/2MS。

10、+6-BA 0.8-1.5mg/L+NAA 0.08-0.15mg/L+活性炭1-3g/L+蛋白胨1.0g/ L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 8.根据权利要求1所述的杏黄兜兰的无性繁殖方法， 其特征在于， 步骤(8)中所述的栽 培基质为碎松树皮： 火山岩： 木炭(V/V)4:2:1混合均匀， 基质粒径为1-1.5cm， 碎松树皮需 充分腐熟后使用。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 109258463 A 3 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 尤其是一种杏黄兜兰的无性繁殖方法。 背景技术 0002 兜兰属隶属于兰科杓。

11、兰亚科(Cypripedioideae)， 以花形奇特、 花色丰富、 艳丽， 花 期长著称， 观赏价值和经济价值极高。 杏黄兜兰是兜兰属中罕见的纯黄色花种类， 是兜兰属 最具观赏价值的种类之一， 曾多次获国际金奖， 和硬叶兜兰并称兜兰中的 “金童玉女” 。 0003 然而， 由于巨大的市场价值， 以及自然生境遭到破坏， 近年来杏黄兜兰野生资源已 经濒临灭绝， 而市场的需求与日俱增， 因此， 杏黄兜兰的人工快速繁育及产业化栽培生产已 经迫在眉睫。 0004 目前， 兜兰属植物规模化生产发展较慢。 究其原因， 兜兰是一种原始的兰科植物， 受其生物学特性的影响， 兜兰尤其是原生种的组培苗增殖速度过慢。

12、， 生长周期长， 不易建立 可控的组培技术体系， 生产力低下。 首先， 无性繁殖困难， 由于杏黄兜兰等大多数兜兰叶基 生于短茎， 外植体选择较难， 外植体消毒十分困难， 而且母株个体稀少， 因此， 多年来， 常规 的以茎尖作为外植体的无性繁殖成功率极低， 且易浪费整株母株； 再次， 类似于其他兜兰生 产， 现有技术仍以有性繁殖手段繁育杏黄兜兰组培苗。 然而， 杏黄兜兰不仅种子萌发十分困 难， 萌发率低下， 而且实生苗后代极易出现性状分离， 难以保持母株的优良性状， 产品缺少 一致性， 导致整体品质标准和市场推广遇到障碍， 因此， 实现商品化生产的难度较大。 现有 技术未能解决杏黄兜兰在产业化栽。

13、培生产中存在的技术瓶颈。 0005 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。 发明内容 0006 针对目前杏黄兜兰有性繁殖产品商品性差及无性繁殖成功率低下的问题， 本发明 提供一种杏黄兜兰的无性繁殖方法， 即利用走茎快速繁殖杏黄兜兰无菌苗的方法， 来建立 杏黄兜兰无性繁殖技术体系， 解决生产中组培苗生长缓慢、 产品不一致的问题， 提高杏黄兜 兰种苗的繁殖效率和生产力， 满足大规模种植杏黄兜兰优良品种的需要。 0007 本发明是通过以下技术方案来实现的： 0008 一种杏黄兜兰的无性繁。

14、殖方法， 包括如下步骤： 0009 (1)外植体的获得和处理： 在10月份时， 选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株， 移 入温室中培养， 诱导走茎分蘖生长； 移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸 泡消毒3min， 将栽培基质装入栽培容器中； 种植时根部深埋， 露出茎基部； 温室保持日温28 ， 夜温18， 湿度60-65， 遮阴度50-60， 隔7-10d浇1次无菌水； 0010 (2)外植体采集： 5-6个月后， 待杏黄兜兰植株分蘖生长出3-5条走茎时即可作为外 植体备用材料； 从花盆里取出整株杏黄兜兰， 选择长8-10cm、 直径3-4mm的走茎10条， 要求走 茎生长健壮， 。

15、苞片粉白色且紧密贴合茎段； 将选好的走茎在流水下冲洗60min， 之后取出， 用 说 明 书 1/7 页 4 CN 109258463 A 4 软毛刷蘸取质量分数为0.1的洗洁精溶液清洗5min， 清理干净走茎表面污物后， 选取顶端 幼嫩的3-4个节段作为外植体； 0011 (3)外植体表面消毒： 在超净工作台上， 将选取好的外植体置入75的酒精中浸泡 30s， 无菌水漂洗2-3次后取出， 在无菌培养皿中， 用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 然后在 走茎的单个节间上， 用手术刀以 “T” 字形划割法， 环切去除该节段上苞片的3/4， 该条走茎的 每个节间依次处理完成后， 置入0.1的升汞中消毒1。

16、min， 用灭菌后的镊子取出， 置入无菌 水中漂洗3-4次， 用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 再用同样的环切方法去除节间上剩余的 1/4苞片， 环割时勿划伤节处具隐芽的区域， 之后将外植体再次置入0.1的升汞中消毒 40s， 取出后置入无菌水中漂洗3-4次； 0012 (4)诱导培养： 在无菌培养皿上， 用无菌滤纸吸干外植体表面的水分， 切除走茎接 触消毒液的一端4-5mm， 然后将走茎切段， 要求每段保留1个节， 节上部保留1/3节段， 下部保 留2/3节段， 将切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入诱导培养基表面， 拧紧瓶盖， 置入温 度25培养室避光培养60d； 0013 (5)丛生芽诱。

17、导： 待步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽长至1-2cm长时， 将侧芽切下， 转 接入丛生芽诱导培养基中， 然后置入日温25， 夜温15的培养室继续培养45d， 每天光照 12h， 光照强度1000lx； 0014 (6)增殖培养： 将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶， 清理干净根部附着的 培养基， 2-3株/丛转接入增殖培养基中， 光照培养45d； 培养温度25， 每天光照12h， 光照强 度1000lx； 0015 (7)壮苗生根培养： 将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基中光照 培养90d； 培养温度25， 每天光照12h， 光照强度2000lx； 0016 (8)试管苗。

18、移栽： 将杏黄兜兰具3cm高的完整植株从培养室转移到具自然光的温室 中炼苗10天， 然后将其从培养瓶中取出， 洗净根部附着的培养基， 以80多菌灵可湿性粉剂 1000倍液浸泡植株8min后， 自然阴干， 采用口径为5的透明营养钵移栽， 3-5株/杯， 将其移 栽至栽培基质中； 移栽场地保持良好的通风， 移栽后第1个月遮阴度80-85， 湿度控制在 85-90。 0017 作为优选， 步骤(1)中所述的栽培基质采用泥炭： 树皮： 锯末： 木炭： 羊粪(V/V)3: 3:2:1:1混合均匀， 树皮、 锯末、 羊粪均经过充分腐熟， 使用前经121高压灭菌20min。 0018 作为优选， 步骤(1)。

19、中所述的栽培容器采用口径12.5cm， 高13cm的瓦盆， 使用前在 500-800倍的高锰酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。 0019 作为优选， 步骤(4)中所述的诱导培养基为1/2MS+6-BA0.8-1.5mg/L+NAA 0.2- 0.8mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 0020 作为优选， 步骤(5)中所述的丛生芽诱导培养基： 1/2MS+BA0.05-0.15mg/L+ NAA0.02-0.08mg/L+蛋白胨1.5g/L+苹果汁15-30mL/L+土豆汁20-40mL/L+香蕉汁60-80mL/L +活性炭1g/。

20、L+蔗糖30-40g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 0021 作为优选， 步骤(6)中所述的增殖培养基： 1/2MS+TDZ 0.08-0.15mg/L+2， 4-D 2- 4mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉汁80-120mL/L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 0022 作为优选， 步骤(7)中所述的壮苗生根培养基1/2MS+6-BA0.8-1.5mg/L+NAA 0.08- 0.15mg/L+活性炭1-3g/L+蛋白胨1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 说 明 书 2/7 页 5 CN 109258463 A 5 0023 作为优选， 步。

21、骤(8)中所述的栽培基质为碎松树皮： 火山岩： 木炭(V/V)4:2:1混 合均匀， 基质粒径为1-1.5cm， 碎松树皮需充分腐熟后使用。 0024 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0025 (1)与已有技术相比， 本发明方法具有外植体取材简便、 易得、 量大、 不破坏母株， 组培流程简单可行， 成苗周期短， 产品一致性高， 整体品质标准可控等优点， 是实现杏黄兜 兰商品化生产的一种简便、 快速、 有效的繁殖方法。 0026 (2)本发明方法走茎诱导率高， 走茎粗壮； 外植体灭菌率达76， 外植体诱导率达 50以上， 单芽平均诱导丛生芽1.5-3.3个， 平均增殖倍数2.07-3。

22、.4倍， 平均生根数2-4.5 条， 最快240d即可出瓶移栽， 移栽成活率均在88以上。 具体实施方式 0027 下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述， 但应当理解本发明的保 护范围并不受具体实施方式的限制。 0028 除非另有其它明确表示， 否则在整个说明书和权利要求书中， 术语 “包括” 或其变 换如 “包含” 或 “包括有” 等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分， 而并未排除其它元 件或其它组成部分。 0029 实施例1 0030 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法， 包括如下步骤： 0031 (1)外植体的获得和处理 0032 在10月份， 选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株，。

23、 移入温室中培养， 诱导走茎分蘖 生长。 移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min， 栽培基质采用泥 炭： 树皮： 锯末： 木炭： 羊粪(V/V)3:3:2:1:1混合均匀， 树皮、 锯末均经过充分腐熟， 使用前 经121高压灭菌20min； 栽培容器采用口径12.5cm， 高10cm的瓦盆， 使用前在500倍的高锰 酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。 保持温度28， 湿度60， 遮阴度50， 隔7d浇1次无 菌水。 5个月后， 每盆母株分蘖生长出3-4条浅紫色走茎， 长度8-9cm， 直径3-3.5mm。 0033 (2)外植体采集 0034 从花盆里小心取出整株。

24、杏黄兜兰， 选择长8-9cm、 直径3mm的走茎10条， 要求走茎 生长健壮， 苞片紧密贴合茎段。 将选好的走茎在流水下冲洗60min， 之后取出， 用软毛刷蘸取 质量分数为0.1的洗洁精溶液清洗5min， 清理干净走茎表面污物后， 选取整条走茎作为外 植体。 0035 (3)外植体表面消毒 0036 在超净工作台上， 将选取好的外植体置入75的酒精中浸泡30s， 无菌水清洗3次 后取出， 在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 然后在走茎的单个节间上， 用手 术刀以 “T” 字形划割法小心环切去除苞片， 注意勿划伤节处具隐芽的区域， 再置入0.1的 升汞中消毒1.5min后取出， 置入。

25、无菌水中漂洗7次。 0037 (4)诱导培养 0038 在无菌培养皿上， 用无菌滤纸吸干外植体表面的水分， 切除走茎接触消毒液的一 端4mm， 然后将走茎切段， 要求每段保留1个节， 节上部保留1/3节段， 下部保留2/3节段， 将切 割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面， 拧紧瓶盖， 置入温度25培养室。 诱导 说 明 书 3/7 页 6 CN 109258463 A 6 培养基为1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂 4.9g/L， pH5.6。 避光培养60d后， 污染率达42， 诱导率为21.8。 0。

26、039 (5)丛生芽诱导 0040 将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下， 转接入丛生芽诱导培养基： 1/2MS+BA 0.05mg/L+NAA0.02mg/L+蛋白胨1.5g/L+苹果汁15mL/L+土豆汁20mL/L+香蕉汁60mL/L+活性 炭1g/L+蔗糖30g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6， 置入日温25， 夜温15的培养室， 每天光照12h， 光照强度1000lx。 继续培养45d后每个单芽可诱导丛生芽1.5-2.7个， 芽较皱缩， 长度1-2cm。 0041 (6)增殖培养 0042 将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶， 清理干净根部附着的培养基， 2株/丛 转接入。

27、增殖培养基： 1/2MS+TDZ 0.08mg/L+2,4-D 2mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉汁80mL/L+蔗糖 20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 温度25， 每天光照12h， 光照强度1000lx。 培养45d后平均每瓶 丛生芽增殖2.07倍， 无变异。 0043 (7)壮苗生根培养 0044 将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2MS+6-BA0.8mg/L+ NAA0.08mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 温度25， 每天 光照12h， 光照强度2000lx。 培养90d后组培苗生根2-3.。

28、5条， 株高2-3cm， 叶片较绿。 0045 (8)试管苗移栽 0046 将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天， 然后将其从培养瓶中取出， 洗净根部附着的培养基， 采用口径为5的透明营养钵移栽， 3 株/杯。 0047 栽培基质为碎松树皮： 木炭(V/V)3:1混合均匀， 基质粒径1cm， 碎松树皮需充分 腐熟后使用。 移栽场地保持良好的通风， 移栽后第1个月遮阴度80， 湿度控制在85， 移栽 成活率88.5。 0048 实施例2 0049 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法， 包括如下步骤： 0050 (1)外植体的获得和处理 0051 在10月份， 选择生长旺。

29、盛的杏黄兜兰植株为母株， 移入温室中培养诱导走茎分蘖。 移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min， 栽培基质采用泥炭： 树 皮： 锯末： 木炭： 羊粪(V/V)3:3:2:1:1混合均匀， 树皮、 锯末、 羊粪均经过充分腐熟， 使用前 经121高压灭菌20min； 栽培容器采用口径12.5cm， 高13cm的瓦盆， 使用前在500倍的高锰 酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。 种植时根部深埋， 微露出茎基部。 保持日温28， 夜温 18， 湿度65， 遮阴度60， 隔10d浇1次无菌水。 6个月后， 每盆杏黄兜兰母株分蘖生长出 4-5条粉白色走茎， 长度9-10cm，。

30、 直径3.5-4mm。 0052 (2)外植体采集 0053 从花盆里小心取出整株杏黄兜兰， 选择长9-10cm、 直径3.5-4mm的走茎10条， 要求 走茎生长健壮， 苞片粉白色且紧密贴合茎段。 将选好的走茎在流水下冲洗60min， 取出后用 软毛刷蘸取质量分数为0.1的洗洁精溶液清洗5min， 清理干净走茎表面污物后， 选取顶端 幼嫩的4个节段作为外植体。 0054 (3)外植体表面消毒 说 明 书 4/7 页 7 CN 109258463 A 7 0055 在超净工作台上， 将选取好的外植体置入75的酒精中浸泡30s， 无菌水清洗3次 后取出， 在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水。

31、分， 然后在走茎的单个节间上， 用手 术刀以 “T” 字形划割法小心环切去除该节段上3/4的苞片， 该条走茎的每个节间依次处理完 成后， 将整条走茎置入0.1的升汞中消毒1min， 无菌水中漂洗3次后， 用无菌滤纸吸干走茎 表面的水分， 再用同样的环切方法小心去除节间上剩余的1/4苞片， 环割时注意勿划伤节处 具隐芽的区域， 之后将外植体再次置入0.1的升汞中消毒40s， 用灭菌后的镊子取出， 置入 无菌水中漂洗4次取出。 0056 (4)诱导培养 0057 在无菌培养皿上， 用无菌滤纸吸干外植体表面的水分， 切除走茎接触消毒液的一 端5mm， 然后将走茎切段， 要求每段保留1个节， 节上部保。

32、留1/3节段， 下部保留2/3节段， 将切 割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面， 拧紧瓶盖， 置入温度25培养室培养。 诱导培养基为1/2MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.5g/L+蔗糖20g/L+琼 脂4.9g/L， pH5.6。 避光培养60d后， 污染率23.7， 诱导率为51.9。 0058 (5)丛生芽诱导 0059 将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下， 转接入丛生芽诱导培养基： 1/2MS+BA 0.15mg/L+NAA0.08mg/L+蛋白胨1.5g/L+苹果汁30mL/L+土豆汁40mL/L+香蕉汁80mL/L+活性 。

33、炭1g/L+蔗糖40g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6， 置入日温25， 夜温15的培养室继续培养， 每天 光照12h， 光照强度1000lx。 继续培养60d后， 每个单芽可诱导丛生芽2-3个， 芽饱满有光泽， 长度2-2.9cm。 0060 (6)增殖培养 0061 将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶， 清理干净根部附着的培养基， 3株/丛 转接入增殖培养基： 1/2MS+TDZ 0.15mg/L+2,4-D 4mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉汁120mL/L+蔗糖 20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 温度25， 每天光照12h， 光照强度1000lx。 培养50d后平均。

34、每瓶 丛生芽增殖2.83倍， 未见变异。 0062 (7)壮苗生根培养 0063 将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2MS+6-BA1.5mg/L+ NAA0.15mg/L+活性炭3g/L+蛋白胨1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 温度25， 每天 光照12h， 光照强度2000lx。 培养90d后， 组培苗生根3.5-4条， 株高2.8-3.5cm， 叶片平展有光 泽。 0064 (8)试管苗移栽 0065 将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养室转移到具自然光的温室中炼苗10天， 然后将其从培养瓶中取出， 洗净根部附着的培养基， 以80多菌灵。

35、可湿性粉剂1000倍液浸 泡植株8min后， 自然阴干， 采用口径为5的透明营养钵移栽， 5株/杯。 0066 栽培基质为碎松树皮： 火山岩： 木炭(V/V)4:2:1混合均匀， 基质粒径1.5cm， 碎松 树皮需充分腐熟后使用。 移栽场地保持良好的通风， 移栽后第1个月遮阴度85， 湿度控制 在90， 移栽成活率达93.5。 0067 实施例3 0068 一种杏黄兜兰的无性繁殖方法， 包括如下步骤： 0069 (1)外植体的获得和处理 说 明 书 5/7 页 8 CN 109258463 A 8 0070 在10月份， 选择生长旺盛的杏黄兜兰植株为母株， 移入温室中培养， 诱导走茎分蘖 生长。

36、。 移栽前用800倍的高锰酸钾溶液对杏黄兜兰母株整株浸泡消毒3min， 栽培基质采用泥 炭： 树皮： 锯末： 木炭： 羊粪(V/V)3:3:2:1:1混合均匀， 树皮、 锯末均经过充分腐熟， 使用前 经121高压灭菌20min； 栽培容器采用口径12.5cm， 高10cm的瓦盆， 使用前在500倍的高锰 酸钾溶液中浸泡30min进行容器消毒。 保持温度28， 湿度63， 遮阴度55， 隔8d浇1次无 菌水。 5.5个月后， 每盆母株分蘖生长出4条粉白色走茎， 长度9cm， 直径3.5mm。 0071 (2)外植体采集 0072 从花盆里小心取出整株杏黄兜兰， 选择长9cm、 直径3.5mm的走。

37、茎10条， 要求走茎生 长健壮， 苞片紧密贴合茎段。 将选好的走茎在流水下冲洗60min， 之后取出， 用软毛刷蘸取质 量分数为0.1的洗洁精溶液清洗5min， 清理干净走茎表面污物后， 选取顶端幼嫩的3个节 段作为外植体。 0073 (3)外植体表面消毒 0074 在超净工作台上， 将选取好的外植体置入75的酒精中浸泡30s， 无菌水清洗3次 后取出， 在无菌培养皿中用无菌滤纸吸干走茎表面的水分， 然后在走茎的单个节间上， 用手 术刀以 “T” 字形划割法小心环切去除苞片， 注意勿划伤节处具隐芽的区域， 再置入0.1的 升汞中消毒1min， 无菌水中漂洗3次后， 用无菌滤纸吸干走茎表面的水分。

38、， 再用同样的环切 方法小心去除节间上剩余的1/4苞片， 环割时注意勿划伤节处具隐芽的区域， 之后将外植体 再次置入0.1的升汞中消毒40s， 用灭菌后的镊子取出， 置入无菌水中漂洗4次取出。 0075 (4)诱导培养 0076 在无菌培养皿上， 用无菌滤纸吸干外植体表面的水分， 切除走茎接触消毒液的一 端4.5mm， 然后将走茎切段， 要求每段保留1个节， 节上部保留1/3节段， 下部保留2/3节段， 将 切割好的单个茎段下部1/2部分竖直插入培养基表面， 拧紧瓶盖， 置入温度25培养室。 诱 导培养基为1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1g/L+蛋白胨1.5g/L。

39、+蔗糖20g/L+琼脂 4.9g/L， pH5.6。 避光培养60d后， 污染率达23， 诱导率为55.3。 0077 (5)丛生芽诱导 0078 将步骤(4)诱导的杏黄兜兰侧芽小心切下， 转接入丛生芽诱导培养基： 1/2MS+BA 0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蛋白胨1.5g/L+苹果汁20mL/L+土豆汁30mL/L+香蕉汁70mL/L+活性 炭1g/L+蔗糖40g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6， 置入日温25， 夜温15的培养室， 每天光照12h， 光照强度1000lx。 继续培养45d后每个单芽可诱导丛生芽2.5-3.3个， 芽饱满有光泽， 长度 2.3-3cm。 00。

40、79 (6)增殖培养 0080 将步骤(5)诱导的杏黄兜兰丛生芽去除黄叶， 清理干净根部附着的培养基， 3株/丛 转接入增殖培养基： 1/2MS+TDZ 0.1mg/L+2,4-D 3mg/L+蛋白胨1g/L+香蕉汁100mL/L+蔗糖 20g/L+琼脂4.9g/L， pH5.6。 温度25， 每天光照12h， 光照强度1000lx。 培养45d后平均每瓶 丛生芽增殖3.4倍， 无变异。 0081 (7)壮苗生根培养 0082 将步骤(6)增殖的幼芽以2株/丛转接入壮苗生根培养基1/2MS+6-BA1mg/L+ NAA0.1mg/L+活性炭2g/L+蛋白胨1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂4.。

41、9g/L， pH5.6。 温度25， 每天光 照12h， 光照强度2000lx。 培养90d后组培苗生根3.5-4.5条， 株高3-4cm， 叶片平展有光泽。 说 明 书 6/7 页 9 CN 109258463 A 9 0083 (8)试管苗移栽 0084 将杏黄兜兰具3厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天， 然后将其从培养瓶中取出， 洗净根部附着的培养基， 以80多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸 泡植株8min后， 自然阴干， 采用口径为5的透明营养钵移栽， 4株/杯。 0085 栽培基质为碎松树皮： 木炭(V/V)3:1混合均匀， 基质粒径1.5cm， 碎松树皮需充 分。

42、腐熟后使用。 移栽场地保持良好的通风， 移栽后第1个月遮阴度83， 湿度控制在88， 移 栽成活率97。 0086 按照实施例1、 实施例2、 实施例3中的方案分别对杏黄兜兰进行组织培养， 调查、 统 计单芽平均诱导丛生芽、 单芽平均增殖倍数、 单芽平均生根数和移栽成活率。 0087 表1丛生芽增殖系数和成苗率测定 0088 0089 从表1可知， 按照实施例1-3中的技术方案进行组织培养， 本发明的实施例1-3中方 法的杏黄兜兰走茎诱导率高， 走茎粗壮； 外植体灭菌率达76， 外植体诱导率达50以上， 单芽平均诱导丛生芽1.5-3.3个， 平均增殖倍数2.07-3.4倍， 平均生根数2-4.5条， 最快240d 即可出瓶移栽， 移栽成活率均在88以上。 0090 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式， 并且很显然， 根据上述教导， 可以进行很多改变 和变化。 对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用， 从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。 说 明 书 7/7 页 10 CN 109258463 A 10 。