一种蛙类动物胚胎的孵育方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811503947.9 (22)申请日 2018.12.10 (71)申请人 广东工业大学 地址 510060 广东省广州市越秀区东风东 路729号大院 (72)发明人 许燕滨 赵建彬 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 张春水 唐京桥 (51)Int.Cl. A01K 67/02(2006.01) (54)发明名称 一种蛙类动物胚胎的孵育方法 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 尤其涉及一种蛙 类动物胚胎的孵育方法。 本发明提供了。

2、一种蛙类 动物胚胎的孵育方法， 包括以下步骤： 步骤1、 获 取蛙类动物的胚胎； 步骤2、 按照每50ml MBS胚胎 培养液放置0-300颗所述胚胎的比例将所述胚胎 置于90mm培养皿中， 在24-27条件下孵育形成 蝌蚪。 本发明提供的蛙类动物胚胎的孵育方法具 有简单高效、 操作简单， 实用性强的优点， 能够应 用于人工养殖和环境生态修复领域， 符合人与自 然和谐相处， 可应用于人工养殖， 环境生态健康 等领域， 有一定的应用前景。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 109258575 A 2019.01.25 CN 109258575 A 1.一种蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特。

3、征在于， 包括以下步骤： 步骤1、 获取蛙类动物的胚胎； 步骤2、 按照每50mL MBS胚胎培养液放置0-300颗所述胚胎的比例将所述胚胎置于培养 皿中， 在24-27条件下孵育形成蝌蚪。 2.根据权利要求1所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 所述培养皿设有琼脂 层， 所述琼脂层的制备方法为： 将琼脂粉与水配成溶液， 加热得到琼脂溶液， 在无菌室条件 下用所述琼脂溶液润洗培养皿， 凝固得到所述琼脂层。 3.根据权利要求1所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 所述MBS胚胎培养液 包括NaCl、 Hepes、 NaHCO3、 KCl、 MgSO4、 Ca(NO3)2和CaCl。

4、2。 4.根据权利要求1所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 所述步骤1包括如下 步骤： 步骤一、 将一对性成熟的蛙类动物进行第一次注射人绒毛膜促性腺激素， 间隔24-28h 后， 对所述一对性成熟的蛙类动物进行第二次注射人绒毛膜促性腺激素， 在黑暗条件下， 所 述一对性成熟的蛙类动物自然抱对产卵， 吸取未处理胚胎溶液； 步骤二、 将所述未处理胚胎溶液在L-半胱氨酸溶液中消除卵膜， 然后进行润洗得到蛙 类动物的胚胎。 5.根据权利要求4所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 所述第一次注射人绒 毛膜促性腺激素的添加量为20-30IU； 所述第二次注射人绒毛膜促性腺激素的添加量为 。

5、160-180IU。 6.根据权利要求4所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 步骤二中， 所述L-半 胱氨酸溶液的质量百分比为3， 所述L-半胱氨酸溶液的pH为7.9-8.1。 7.根据权利要求4所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 步骤二中， 所述L-半 胱氨酸溶液与所述未处理胚胎溶液的体积比为1： 20。 8.根据权利要求4所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 步骤二中， 所述润洗 具体为采用所述MBS胚胎培养液润洗6-7次， 所述MBS胚胎培养液的PH为7.3-7.5。 9.根据权利要求1至8任意一项所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 还包括 步骤3， 。

6、步骤3为： 将步骤2的所述蝌蚪静置在26-27中2-3h， 使其适应外界环境。 10.根据权利要求9所述的蛙类动物胚胎的孵育方法， 其特征在于， 步骤3之后还包括步 骤4， 步骤4为将步骤3的蝌蚪置于有水的培养盒中培养， 其中， 所述水的溶解氧为85以上。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109258575 A 2 一种蛙类动物胚胎的孵育方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 尤其涉及一种蛙类动物胚胎的孵育方法。 背景技术 0002 随着现代工业技术的发展， 环境污染问题日益突出， 导致全球气候变暖、 森林资源 锐减、 生物多样性减少等， 原有健康的生物链结构被破坏， 很。

7、多动物面临灭绝的危险。 当下， 人与自然和谐相处、 和谐发展是社会的主旋律。 因此， 除了治理环境污染问题外， 还要通过 人工养殖技术来提高生物产量满足市场的需求， 减少人为的肆意捕杀， 还要做出相应的有 效措施， 来帮助生物链修复。 两栖动物是生物链中重要的一环， 起到承上启下的作用。 蛙类 动物的产卵量惊人， 每次传代有上千颗卵， 甚至不止， 但是卵的自然孵化率很低， 自然畸形 率较高， 加上农药的滥用以及工业废水的超标排放， 更是让蛙类动物的繁衍雪上加霜， 最终 存活下来可能也就5-10， 许多蛙类动物已经灭绝。 有文献表明， 酰胺类除草剂乙草胺、 丁 草胺、 丙草胺均能不同程度降低蛙类。

8、动物胚胎的孵化率， 增加其畸形率， 最终导致存活率下 降。 其他污染物如阿特拉津， 双酚AF和全氟化合物等也是如此。 可见， 保护濒临灭绝蛙类动 物刻不容缓， 环境污染与生态健康问题不容忽视。 研究一种产率高且存活率高的蛙类动物 胚胎孵育方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明的目的是提供一种产率高且存活率高的蛙类动物胚胎孵育方 法。 0004 本发明提供了一种蛙类动物胚胎的孵育方法， 包括以下步骤： 0005 步骤1、 获取蛙类动物的胚胎； 0006 步骤2、 按照每50ml MBS胚胎培养液放置0-300颗所述胚胎的比例将所述胚胎置于 90mm培养皿。

9、中， 在24-27条件下孵育形成蝌蚪。 0007 更为优选， 步骤2中， 按照每50ml MBS胚胎培养液放置250-300颗所述胚胎的比例 将所述胚胎置于90mm培养皿中， 在24-27条件下孵育形成蝌蚪。 0008 需要说明的是， 步骤2中， 在24-27条件下孵育形成蝌蚪的期间剔除受精不成功 的胚胎、 死胚和畸形胚， 以及适当更换培养液。 0009 更优选的， 步骤2中， 孵育的温度为26。 0010 需要说明的是， 所述MBS胚胎培养液为0.1MBS胚胎培养液， 所述5MBS胚胎培养 液的配方如下表所示， 先配置5MBS胚胎培养液作为储存液， 使用时， 按照比例关系稀释成 0.1MBS。

10、胚胎培养液使用。 0011 5MBS胚胎培养液(pH7.4)配方 说 明 书 1/6 页 3 CN 109258575 A 3 0012 0013 作为优选， 所述培养皿设有琼脂层， 所述琼脂层的制备方法为： 将琼脂粉与水配成 溶液， 加热得到琼脂溶液， 在无菌室条件下用所述琼脂溶液润洗培养皿， 凝固得到所述琼脂 层。 0014 具体的， 琼脂层的制备方法为： 将琼脂粉与水按1-1.5的比例配成溶液， 微波炉 自动翻热2min后， 在无菌室条件下用该溶液润洗培养皿， 凝固得到薄薄琼脂层。 0015 需要说明的是， 所述培养皿设有琼脂层能避免受精卵直接黏贴在培养皿上面， 影 响胚胎的孵育。 00。

11、16 作为优选， 所述琼脂粉与水的质量百分比为1-1.5。 0017 更优选的， 所述琼脂粉在水的质量百分比为1.2。 0018 作为优选， 所述培养液包括NaCl、 Hepes、 NaHCO3、 KCl、 MgSO4、 Ca(NO3)2和CaCl2。 0019 作为优选， 所述步骤1包括如下步骤： 0020 步骤一、 将一对性成熟的蛙类动物进行第一次注射人绒毛膜促性腺激素， 间隔24- 28h后， 对所述一对性成熟的蛙类动物进行第二次注射人绒毛膜促性腺激素， 在安静黑暗条 件下， 所述一对性成熟的蛙类动物自然抱对产卵， 吸取未处理胚胎溶液； 0021 步骤二、 将所述未处理胚胎溶液在L-半胱。

12、氨酸溶液中消除卵膜， 然后进行润洗得 到蛙类动物的胚胎。 0022 作为优选， 所述第一次注射人绒毛膜促性腺激素的添加量为20-30IU； 所述第二次 注射人绒毛膜促性腺激素的添加量为160-180IU。 0023 更优选的， 所述第一次注射人绒毛膜促性腺激素的添加量为20IU； 所述第二次注 射人绒毛膜促性腺激素的添加量为160IU。 0024 更优选的， 第一次注射人绒毛膜促性腺激素与所述第二次注射人绒毛膜促性腺激 素的间隔时间为25h。 0025 作为优选， 步骤二中， 所述L-半胱氨酸溶液的质量百分比为3， 所述L-半胱氨酸 溶液的pH为7.9-8.1， 优选为8.0。 0026 作为。

13、优选， 步骤二中， 所述L-半胱氨酸溶液与所述未处理胚胎溶液的体积比为1： 20。 0027 作为优选， 所述消除卵膜的时间为2-3min， 优选为2.5min。 0028 作为优选， 步骤二中， 所述润洗具体为采用MBS胚胎培养液润洗6-7次， 所述胚胎培 说 明 书 2/6 页 4 CN 109258575 A 4 养液的PH为7.3-7.5， 优选为7.4。 0029 其中， 润洗的MBS胚胎培养液为0.1MBS胚胎培养液。 0030 作为优选， 还包括步骤3， 步骤3为： 将步骤2的所述蝌蚪静置在26-27中2-3h， 使 其适应外界环境。 0031 作为优选， ， 步骤3之后还包括步。

14、骤4， 步骤4为将步骤3的蝌蚪置于有水的培养盒中 培养， 其中， 所述水的溶解氧为85以上。 0032 更为优选， 所述水的溶解氧为90。 0033 具体的， 本发明的蛙类动物胚胎的孵育方法， 包括以下步骤： 0034 1、 胚胎获取方式： 选用一对性成熟的热带爪蛙放入繁殖培养盒中， 采用人工注射 人绒毛膜促性腺激素(HCG)的方法诱导产卵。 每只爪蛙进行2次皮下注射， 第一次注射20-30 单位HCG， 间隔24-28h再注射160-180单位HCG。 第二次注射后将繁殖培养盒放进恒温培养箱 中， 并设置关灯状态， 温度为24-27， 使爪蛙在黑暗安静条件下自然抱对产卵。 4-5h后用 0.。

15、5ml吸管收集受精卵， 然后将吸取的受精卵液体放进100ml烧杯里面， 用事先制备好的pH 为7.9-8.1的3的L-半胱氨酸溶液， 在烧杯中按1： 20的比例添加L-半胱氨酸溶液， 然后手 摇受精卵消膜， 用时2-3min， 再用pH为7.3-7.5的0.1MBS胚胎培养液润洗6-7次， 获得胚 胎， 其中， 5MBS胚胎培养液通过稀释制备得到0.1MBS胚胎培养液。 0035 2、 胚胎孵育方法： 将0.1MBS胚胎培养液倒进附有1-1.5琼脂糖的90mm消毒培 养皿中， 按照每50mL培养液放置250-300颗胚胎的比例将胚胎置于含有培养液的培养皿中， 在恒温培养箱中进行孵育， 温度设为。

16、24-27。 孵育1天后， 利用纤细柔软的东西将受精不成 功的卵剔除掉(圆滑有规则的卵则受精成功， 肿大不规则的卵则为受精不成功)， 然后重新 放回培养箱。 孵育过程中要留意将死胚和畸形胚剔除掉， 水质太浊时要更换培养液。 孵育4 天后可形成蝌蚪， 此时将培养皿从培养箱中取出， 并静置在26-27的外界环境中2-3h， 使 其适应环境， 然后再将其放进盛有溶液氧85以上自来水的塑料培养盒中培养。 0036 需要说明的是， 步骤2中， 将0.1MBS胚胎培养储存液放置在恒温培养箱中， 使储 存液与培养皿中培养液的水温一致， 这样才可以给胚胎换液， 否则将影响胚胎孵化、 发育， 严重时将导致全部死。

17、亡。 换培养液的量： 只换一半培养液， 不能将全部培养液一次性更换， 而且还要注意换液时尽可能轻轻的， 避免损伤胚胎。 0037 需要说明的是， 所述蛙类动物为热带爪蛙， 热带爪蛙是模式生物， 具有一定的代表 性， 其胚胎获取方式与孵育条件， 能够符合大部分蛙类动物。 0038 本发明提供了一种产率高且存活率高的蛙类动物胚胎的孵育方法， 该方法有助于 蛙类动物的繁衍、 人工养殖、 科学研究等。 本发明的孵育方法包括以下步骤： 步骤1、 获取蛙 类动物的胚胎； 步骤2、 按照每50mL培养液放置250-300颗胚胎的比例将胚胎置于含有培养 液的培养皿中， 在24-27条件下孵育形成蝌蚪， 期间剔。

18、除受精不成功的胚胎、 死胚和畸形 胚。 0039 本发明发现温度对胚胎的孵育十分重要， 孵育的温度在24-27下， 胚胎孵育成蝌 蚪的发育优良， 孵化时间会稍微提前， 孵化率正常区间内； 胚胎在培养皿的密度对胚胎孵育 也极其重要， 胚胎的密度(每50ml的培养液含有0-300颗卵)， 该密度范围可以使得胚胎正常 孵化， 而且有利于下一步挑胚胎环节。 0040 综上所述， 本发明公开的蛙类动物胚胎的孵育方法具有唯一性， 创新性， 能够有效 说 明 书 3/6 页 5 CN 109258575 A 5 提高蛙类动物胚胎的孵化率， 存活率， 降低畸形率， 可以给现实生活中蛙类动物的人工养殖 提供技术。

19、参考， 也可以通过该方法针对性的保护濒临灭绝的蛙类动物， 是一种环境友好的 蛙类传代方法， 符合人与自然和谐相处的要求。 同时， 本发明提供的蛙类动物胚胎的孵育方 法具有简单高效、 操作简单， 实用性强的优点， 能够应用于人工养殖和环境生态修复领域， 符合人与自然和谐相处， 可应用于人工养殖， 环境生态健康等领域， 有一定的应用前景。 附图说明 0041 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 0042 图1为本发明实施例1提供的热带爪蛙的胚胎的实物图。 具体实施方式 0043 本发明提供了一种蛙类动物胚胎的孵育方法。

20、， 用于解决现有技术中蛙类动物胚胎 孵育的存活率低、 畸形率高的技术缺陷。 0044 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0045 其中， 以下实施例所用原料均为市售或自制。 0046 实施例1 0047 本发明实施例提供了一种热带爪蛙的胚胎获取方式与热带爪蛙的胚胎孵育方法， 其步骤是： 0048 1、 胚胎获取方式： 选用一对性成熟的热带爪蛙放入繁殖培养盒中， 采用人工注射 。

21、人绒毛膜促性腺激素(HCG)的方法诱导产卵。 每只爪蛙进行2次皮下注射， 第一次注射20单 位的HCG， 间隔24-28h再注射160单位的HCG。 第二次注射后将热带爪蛙放进繁殖培养盒中， 将繁殖培养盒放进恒温培养箱中， 并设置关灯状态， 温度为26， 使爪蛙在黑暗安静条件下 自然抱对产卵。 大概4.5h后用0.5ml吸管收集受精卵， 然后放进100ml烧杯里面， 用事先制备 好的pH为8.0的质量百分比为3的L-半胱氨酸溶液， 在100ml烧杯中按1： 20的体积比例添 加L-半胱氨酸溶液， 然后手摇受精卵消膜， 用时2.5min， 再用pH为7.4的0.1MBS胚胎培养 液润洗6次， 获。

22、得热带爪蛙的胚胎， 涂图1所示。 0049 2、 胚胎孵育方法： 将0.1MBS培养液倒进附有1.2琼脂糖的培养皿中， 按照每 50mL培养液放置25颗胚胎的比例将步骤1的热带爪蛙的胚胎置于含有培养液的培养皿中， 在恒温培养箱中进行孵育， 温度设为26。 孵育1天后， 利用纤细柔软的东西将受精不成功 的卵剔除掉(圆滑有规则的卵则受精成功， 肿大不规则的卵则受精不成功)， 然后重新放回 培养箱。 孵育过程中将死胚和畸形胚剔除掉， 水质太浊时也要适当更换培养液。 孵育4天后 形成蝌蚪， 此时将培养皿从培养箱中取出， 并静置在26-27的室内中2-3h， 使其适应环境， 然后再将其放进盛有溶解氧为9。

23、0自来水的塑料培养盒中培养。 0050 其中， 先配置5MBS胚胎培养液作为储存液， 使用时， 按照比例关系稀释成0.1 MBS胚胎培养液使用， 5MBS胚胎培养液(PH为7.4)配方如下表所示。 说 明 书 4/6 页 6 CN 109258575 A 6 0051 5MBS胚胎培养液(pH7.4)配方 0052 0053 实施例2 0054 本发明实施例提供了在不同温度下胚胎孵育的孵育情况， 具体步骤如下： 0055 设置三组实验组， 三组实验组按照实施例1的方法孵育热带爪蛙胚胎， 区别在于， 步骤2在胚胎孵育时， 胚胎置于培养皿后置于恒温培养箱孵育， 孵育温度分别设置为23， 26， 2。

24、9， 观察蝌蚪的发育情况、 孵化时间和孵化率， 结果如表1所示。 从表1可知， 由于胚 胎具有个体差异， 因此胚胎的孵化时间和孵化率会在一个区间内动态范围内波动， 孵化温 度在26时， 其胚胎的发育情况、 孵化时间和孵化率最佳， 温度较低和较高都影响胚胎的发 育、 延长孵化时间和降低孵化率。 0056 表1 0057 实验组发育情况孵化时间孵化率 温度(23)胚胎发育缓慢96-98h91.02-95.37 温度(26)胚胎发育良好94-96h90.63-95.83 温度(29)胚胎发育紊乱94-96h80.52-88.17 0058 实施例3 0059 本发明实施例提供了在不同密度下胚胎孵育的。

25、孵育情况， 具体步骤如下： 0060 设置三组实验组， 三组实验组按照实施例1的方法孵育热带爪蛙胚胎， 区别点在 于， 步骤2在胚胎孵育时， 每50mL培养液分别放置150颗卵、 250颗卵、 400颗卵置于培养皿后 置于恒温培养箱孵育， 孵育密度分别设置为150， 250， 400检测蝌蚪的发育情况、 孵化时间和 畸形率， 结果如表1所示。 从表2可知， 由于胚胎具有个体差异， 因此胚胎的孵化时间和孵化 率会在一个区间内动态范围内波动， 孵育密度为每50mL培养液含有150颗卵时， 其胚胎的发 育情况、 孵化时间和孵化率最佳， 孵育密度为每50mL培养液含有250颗卵和400颗卵时， 其胚 。

26、胎的孵化时间较慢和畸形率较高。 从资源利用和培养箱空间角度， 优选孵育密度为每50ml 培养液含250颗卵。 0061 表2 0062 发育情况孵化时间畸形率 说 明 书 5/6 页 7 CN 109258575 A 7 密度(150颗卵)胚胎发育稍快94-96h8.33-13.54 密度(250颗卵)胚胎发育良好95-96h9.33-15.54 密度(400颗卵)胚胎发育缓慢96-98h14.73-30.47 0063 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 109258575 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 9 CN 109258575 A 9 。