技术领域
本发明涉及一种植物的快速繁殖方法，更具体地，涉及一种杠柳快速繁殖方法，属植物繁殖技术领域。
背景技术
杠柳(Periploca sepium Bunge)又名羊奶条、羊角桃，其根皮又称为北五加皮、香加皮，属萝摩科杠柳属，是广泛分布于东北、西北、华北地区，以及河南、湖南、湖北和江西等省区的灌木。杠柳具有耐旱耐盐碱、保持水土、牲畜不啃食等特性，且在山顶、山麓，黄土丘陵区以及采伐迹地上均可以生长，因此常被作为造林困难地和植被退化地区人工造林的先锋树种。此外，杠柳的根皮可入药，治疗关节炎症，还可以做杀虫药。随着杠柳的药理作用和经济价值不断为人们所发掘，其市场需求量日益增加。然而由于过度采挖，毁林开荒，杠柳的生境遭到破坏，数量急剧减少。而且在自然条件下，杠柳结果很少，萌蘖苗数量有限，分株繁殖速度慢且受时间影响较大，限制了杠柳的大量快繁。
杠柳的繁育方法多样，常见的有种子繁育、扦插繁育、分株繁育。近年来，我国对杠柳的研究多注重于对其根、茎化学成分和杠柳在环境胁迫下的生理生态策略，即杠柳的药理作用、经济价值和生态作用的研究，而对其系统的繁殖技术的研究较少。如：《不同生长期杠柳各部位活性成分的累积变化》(张春艳,李国辉,等.中草药,2012,43(12):2508-2511)对一年内不同生长期的杠柳各部位活性成分的积累变化进行研究，确定杠柳提取药物成分的最佳部位及其最佳采收期；《杠柳毒苷体外抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞增殖的实验研究》(丁菲菲,张晓静,邓雁如.药物评价研究,2014,37(1):30-33)通过实验研究证明杠柳毒苷对人乳腺癌MDA-MB-468细胞和肝癌HepG2细胞的增殖有抑制作用；史清华初步研究并提取了杠柳根皮中所含有的化学成分，探索其杀虫活性，《杠柳根皮化学成分及杀虫活性的初步研究》(史清华,马养民,秦虎强.西北农业学报,2005,14(6):141-144)、《杠柳杀虫活性成分的进一步分离》(李任丰.西北农林科技大学,2016)对杠柳成分进行了进一步分离，结果表明杠柳根皮提取物对粘虫有一定胃毒活性。
因杠柳结果少，种子不易采集；分株繁育速度慢，《杠柳的繁殖与应用调查》(张显国,宗月香.河北林业科技,2011,(6):30-32)对杠柳的种子和分株繁殖只进行了简单说明，重点进行扦插繁殖试验，结果表明春季扦插成活率和生根率低，雨季扦插成活率较高，可达90％以上，这说明杠柳扦插繁殖有季节性限制。《杠柳繁殖技术及对土壤理化性质影响的研究》(李文娟.河北农业大学,2013)对杠柳的繁殖技术进行了科学系统的研究，研究结果表明，成活率最高的是分株育苗的繁殖方法，但此方法繁殖数量有限，在资源有限的情况下浪费材料，不适合大量繁殖。露天扦插的成活率也较高，但此方法对扦插材料的要求较为严格，且对养护管理的要求异常严格。播种育苗对覆土厚度及土壤湿度要求非常严格，且最高成活率也只有60％左右。《杠柳育苗试验初报》(韩恩贤,韩刚,刘卫星.陕西林业科技,2003,(2):19-20)研究结果表明，杠柳采取播种育苗，5～6天即可发芽出土。但覆土厚度超过1cm，发芽率明显降低。
目前，有关杠柳的组织培养的研究报道较少。只有张坚等进行了较为系统的研究，如《杠柳细胞悬浮培养体系中蔗糖浓度与氮源的考察》(张坚,高文远,王娟.中国药学杂志.2011,46(2):98-101)、《诱导子Ag+,La3+对杠柳不定根生长及杠柳毒苷积累影响的研究》(张坚,高文远,王娟,肖培根.中国中药杂志.2011,36(1):11-15)、《杠柳细胞悬浮培养体系的建立及有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的测定》(张坚,高文远,王娟等.天津中医药,2010,27(2):163-165)、《杠柳组培苗的诱导及其次生代谢产物杠柳毒苷动态积累的研究》(张坚,高文远,李兴林等.中国中药杂志,2010,35(18):2392-2394)建立了杠柳不定根悬浮培养体系和细胞悬浮培养体系；《外源性激素对药用植物杠柳胚轴快繁的影响》(张坚,高文远,李兴林.中国药学杂志,2010,45(20):1539-1543)研究了外源性激素对杠柳胚轴快繁的影响，建立了以杠柳胚轴为外植体的组培快繁体系。《太子参、杠柳和甘草不定根培养的研究》(尹双双.天津大学,2013)利用组织培养培养技术，进行了杠柳不定根诱导与增殖研究，建立了杠柳不定根液体培养体系。前述研究报道的研究目均是获得杠柳根系中的有效成分杠柳毒苷等次生代谢产物，所以并未对其外植体材料的消毒方式进行系统的研究，也未对诱导和增殖培养过程中可能影响组培苗生长的因素如培养基种类、蔗糖浓度、光照条件等进行研究。且所有相关文献中均未对杠柳已生根组培苗进行驯化移栽进行研究。
《滇杠柳茎段和顶芽组织培养及植株再生研究》(刘志飞，高洁，牛亚慧，石磊，陈涛涛.中药材.第34卷第11期2011年11月:1656-1660)建立了滇杠柳(Periploca forrestii Schlt)茎段和顶芽快速繁殖体系，为其推广种植提供可行性。其方法为：利用植物组织培养技术，将滇杠柳茎段和顶芽插入含有不同浓度6-BA(6-苄基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)和2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)的MS培养基中培养，诱导其成为完整植株。结果与结论:顶芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L，其中芽的诱导率可达到86.29％；茎段诱导的最佳培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，芽的诱导率可达到56.67％；增殖的最佳培养基配方都为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，增殖系数达到2.10；生根培养基最好为1/2MS+IBA(吲哚丁酸)0.5mg/L，生根率达到53.33％。
由于杠柳(Periploca sepium Bunge)与滇杠柳(Periploca forrestii Schlt)属于杠柳属的不同种，并且生物学习性也存在很大的差异(《中国植物志》中国科学院中国植物志编辑委员会编.北京:科学出版社,1977,63:272.)，前述滇杠柳茎段和顶芽组织培养及植株再生技术不能适用于杠柳的大量繁殖。因此，必须针对杠柳进行专属的繁殖体系研究，使其大量繁殖具有可行性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷提供一种杠柳快速繁殖方法。该杠柳快速繁殖方法具有繁殖效率高、扩增系数高等优点。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种杠柳快速繁殖方法，该方法将杠柳带芽茎段作为外植体材料进行组织培养。
上述杠柳快速繁殖方法，所述组织培养包括消毒处理、诱导培养、增殖培养、生根培养和驯化移栽。
上述杠柳快速繁殖方法，所述杠柳带芽茎段取材自5月、7月或9月，优选5月。
上述杠柳快速繁殖方法，所述消毒处理，5月取材的杠柳带芽茎段消毒方式为，75％酒精1min+8％次氯酸钠15min；或，7月取材的杠柳带芽茎段的消毒方式为：75％酒精30s+10％次氯酸钠20min；或，9月取材的杠柳带芽茎段的消毒方式为：75％酒精30s+0.1％升汞10min。
上述杠柳快速繁殖方法，所述诱导培养，诱导培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，光照强度为2500lx，光照时间为16h/d。
上述杠柳快速繁殖方法，所述增殖培养，增殖培养基为MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.3mg/+蔗糖30g/L，光照强度为3000lx。
上述杠柳快速繁殖方法，所述生根培养，生根培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖25g/L。
上述杠柳快速繁殖方法，所述驯化移栽，移栽基质为1/2泥炭+1/2蛭石，闭瓶炼苗5d并开瓶炼苗5d。
本发明为了在短时间内获得大量优良苗木、扩大繁殖以满足市场需求，利用植物组织培养技术，以杠柳带芽茎段作为外植体，对杠柳茎段组培快繁技术进行了较为系统的研究，包括消毒处理、诱导培养、增殖培养、生根培养和驯化移栽五个植物离体快繁的主要阶段，主要研究结果如下：(1)采用75％酒精与不同浓度的升汞和次氯酸钠组合消毒剂消毒，以杠柳带芽茎段作为外植体材料的组织培养的最佳取材时期为5月份，其污染率和死亡率均最低，且成活率最高，达84.44％。(2)在诱导培养中，适宜的培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30mg/L，适宜的光照强度为2500lx，光照时间为16h/d，此培养条件下诱导率达93.33％。在增殖培养中，杠柳茎段增殖适宜的培养基配方为MS+6-BA 2mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30mg/L，适宜的光照强度为3000lx，此培养条件下增殖率达96.56％，增殖系数达6.28。(3)杠柳组培苗适宜的生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖25g/L，此培养条件下生根率达91.67％，且用诱导苗进行直接生根效果更好。(4)1/2泥炭+1/2蛭石的基质是杠柳组培苗适宜的移栽基质组合，此移栽基质下成活率达78.89％。闭瓶炼苗5d+开瓶炼苗5d效果理想。本发明所述杠柳快速繁殖方法解决了杠柳繁育速度慢、繁殖数量有限、成活率低等问题，能够在短时间内获得大量优良苗木、扩大繁殖以满足市场需求，具有很高的社会意义和经济意义。
附图说明
图1升汞对5月取材的杠柳茎段消毒效果。
图2升汞对7月取材的杠柳茎段消毒效果。
图3升汞对9月取材的杠柳茎段消毒效果。
图4次氯酸钠对5月取材的杠柳茎段消毒效果。
图5次氯酸钠对7月取材的杠柳茎段消毒效果。
图6次氯酸钠对9月取材的杠柳茎段消毒效果。
图7 MS培养基浓度对组培苗生根率的影响。
图8 1/4MS组培苗状态。
图9 IBA浓度对杠柳组培苗生根的影响。
图10不同基质下杠柳组培苗移栽成活率。
图11本发明所述杠柳快速繁殖方法技术路线
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
试验例本发明所述杠柳快速繁殖方法的研究
1材料与方法
1.1试验地概况
本试验采用杠柳作为外植体材料，实验材料采于河北省保定市莲池区河北农业大学西校区试验田。该地属平原区，地势平坦，地理坐标为东经115°30′，北纬38°50′。本地区春季多风，较干燥；夏季炎热，雨水较多；秋季凉爽少雨；全年无霜期6个月左右(4月中旬至10月中旬)。该实验田的土壤类型为石灰性潮褐土，土质主要由粘质砂土和砂质粘土构成。
1.2试验材料
1.2.1不同取材时期杠柳茎段的消毒试验材料
生长健壮，无病害、虫害和伤痕的当年生杠柳枝条是作为本次组织培养外植体的基本条件。在此基础上选取生长势相近的，长40cm左右的枝条，去掉叶片、枝条顶端幼嫩和基部过熟部位，将剩余部分剪成2cm左右带芽小茎段。
取材时间：分别于2016年5月中旬、7月中旬、9月中旬份取材。
1.2.2诱导培养材料
杠柳带芽茎段经过消毒处理后，将无污染、生长良好的茎段作为试验材料在无菌操作下转移到诱导培养基进行直接诱导培养，即：使带芽茎段由腋芽直接萌发成苗，不经过诱导外植体材料经过脱分化形成愈伤组织这一过程。
1.2.3增殖培养材料
利用茎段进行直接增殖是指，杠柳带芽茎段经过消毒处理后，将无污染、生长良好的茎段作为试验材料在无菌操作下转移到增殖培养基进行培养，利用叶腋部分的腋芽(或侧芽)培养，直接获得芽苗或丛生苗，即：杠柳带芽茎段不需经过愈伤组织分化出苗的过程，从而建立杠柳带芽茎段直接高效的快繁途径。
1.2.4生根培养材料
当试管苗长到4～5cm高时，选取生长势良好的新苗从基部切下，在无菌操作下转移到生根培养基进行培养。
1.2.5驯化移栽材料
选择生根培养后生长良好，根系发达的杠柳组培苗作为移栽材料，将其移栽至盛有基质(已灭菌)的营养钵中进行移栽试验。
1.3试验设计与方法
1.3.1不同取材时期杠柳茎段的消毒试验
1.3.1.1外植体处理
操作方法：(1)用自来水冲洗采回茎段30min左右，除去尘土等杂质；加洗涤剂，用软毛刷仔细刷洗，用自来水漂洗60min；(2)在无菌条件下(经过灭菌处理的超净工作台内)将培养材料放入75％的乙醇溶液中，消毒30s左右；注意：此步骤适用于升汞和次氯酸钠消毒效果试验，和正交试验中需要使用乙醇的消毒处理；(3)用无菌水将经过乙醇消毒的外植体材料冲洗干净；(4)按照试验设计方式进行消毒，消毒完成后，再用无菌水冲洗5遍左右，直至洗去残留，在无菌纸上吸取水分后，将外植体接种在经高压灭菌的MS培养基(每升培养基含蔗糖30g，琼脂7g，pH值为6.8±0.1)中，然后放入培养室进行培养。培养温度为(23±2)℃，光照强度为2500lx，光照时间16h/d，相对湿度70％～80％。
1.3.1.2升汞消毒效果试验
使用升汞作为消毒剂，分别对5月、7月和9月中旬取材的杠柳带芽茎段进行消毒处理。升汞浓度设：0.05％、0.1％、0.2％，消毒时间分设为5min、10min、15min。
试验设9个处理，每个处理接种60个杠柳带芽茎段，重复3次。接种3周后统计并计算其污染率、死亡率及存活率，下同。
1.3.1.3次氯酸钠消毒效果试验
使用次氯酸钠作为消毒剂，分别对5月、7月和9月取材的杠柳带芽茎段进行消毒处理。次氯酸钠浓度设：6％、8％、10％，消毒时间分设为10min、15min、20min。
1.3.1.4正交试验
采用3因素、3水平正交试验设计筛选出杠柳带芽茎段在不同时期的最佳消毒方式。3因素为：0.1％升汞消毒时间、8％次氯酸钠消毒时间和10％过氧化氢消毒时间，按照L9(34)进行设计排列(见表1)。该实验共9个处理，每个处理接种30个外植体，重复3次。接种3周后，统计该试验方式下杠柳带芽茎段的污染率、死亡率和存活率。
表1试验设计
1.3.2诱导与增殖培养
1.3.2.1不同蔗糖浓度对杠柳侧芽诱导的影响
将经过消毒处理的杠柳带芽茎段在无菌操作下接种到含有蔗糖20、25、30、35和40g/L的MS基本培养基中，共5组处理，每组处理接种外植体30个，培养15天之后观察记录不同蔗糖浓度下杠柳茎段的诱导率、芽体颜色及健壮程度，比较短期内何种蔗糖浓度能够促进茎段快速萌芽并保证芽体质量，借以筛选出杠柳带芽茎段诱导培养适宜的蔗糖浓度。
1.3.2.2不同光照条件对杠柳侧芽诱导的影响
将经过消毒处理的带芽茎段无菌操作接种到MS基本培养基，然后放在不同光照条件下进行培养，光照条件共设3个光照强度：2000，2500和3000lx，每个光照强度设定3组光照时间，分别为13，16和19h/d，共9组处理，每组处理接种外植体30个。培养15天后观察记录杠柳茎段诱导率，分析光照条件对杠柳侧芽诱导的影响。
1.3.2.3不同激素组合对杠柳侧芽诱导和增殖的影响
一般来讲，以带芽茎段作为外植体进行诱导培养时一般不需要添加外源生长素，就可以获得良好的诱导效果。本试验将无菌茎段在无菌操作下转移至MS基本培养基中，生长调节剂采用不同浓度的6-BA、IBA和NAA组合，设计3因素3水平的正交试验(实验设计见表2)，另设不添加激素的基本MS培养基作为对照处理。
每个处理接种30个外植体，重复3次(下同)。接种3周后观察记录其诱导率、净增株高、新生叶片数、叶色(叶色分为翠绿色、鲜绿色和黄绿色三个等级，分别用+++、++和+代表)和愈伤组织的有无，借以筛选出杠柳带芽茎段诱导培养适宜的激素及浓度组合。
在增殖培养中，外源激素的有无、种类、以及浓度对外植体的增殖效果影响很大。按照表3对经过消毒处理的无污染带芽茎段进行增殖培养，接种4周后观察记录不同处理下的增殖情况，研究激素种类、浓度，以及不同浓度激素组合对杠柳茎段增殖的影响。
表2诱导培养试验设计
表3增殖培养试验设计
1.3.2.4不同蔗糖浓度对杠柳侧芽增殖的影响
因杠柳在增殖培养中为了获得良好的增殖效果需要添加外源激素，本试验以在试验1.3.2.3中对杠柳侧芽增殖效果较好的培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)作为此次蔗糖浓度试验的增殖培养基。将经过消毒处理的杠柳带芽茎段在无菌操作下接种到含有蔗糖10、20、30和40g/L的上述培养基中，共5组处理，每组处理接种外植体30个，重复3次。接种4周后观察记录，研究不同蔗糖浓度对杠柳茎段增殖率和增殖系数的影响。
1.3.2.5不同光照条件对杠柳侧芽增殖的影响
将经过消毒处理的带芽茎段无菌操作接种到增殖培养基中(培养基配方同蔗糖浓度对增殖影响的试验)，然后放在不同光照强度下进行培养，光照条件共设4个光照强度：1000，2000、3000和4000lx，光照时间为16h/d。培养4周后观察记录杠柳组培苗生长状况，分析光照条件(包括光照时间和光照强度)对杠柳组培苗生长状况的影响。
1.3.3生根培养
1.3.3.1 MS浓度试验
将高度为5～6cm左右的生长健壮的无菌苗分别接入只改变大量元素浓度的MS、3/4MS、1/2MS、1/4MS基本培养基中进行生根培养，每种培养基含IBA 0.5mg/L，其他成分不变。每处理接种20个杠柳组培苗，重复3次，接种30d后统计生根率，分析MS培养基(大量元素)浓度变化对生根率的影响。
1.3.3.2 IBA浓度对杠柳组培苗生根的影响
以1/2MS培养基作为生根培养的基本培养基，设计IBA浓度为0.0、0.3、0.5、0.7、1.0mg/L，培养基其他成分不变。试验共5个处理，每个处理接种20个组培苗，重复3次。接种30d后计算生根率、平均根条数和根长，分析不同IBA浓度对杠柳组培苗生根率和根生长状况的影响。
1.3.3.3不同蔗糖浓度对杠柳组培苗生根的影响
在无菌操作下将试管苗接种到含有蔗糖15、20、25、和30g/L的1/2MS培养基中，每种培养基含IBA 0.5mg/L，其他成分不变。每处理接种20个杠柳组培苗，接种30d后统计生根率。
1.3.3.4组培苗状态对生根的影响
将用于生根的组培苗分为经诱导后直接进行生根处理和经增殖后进行生根处理(即单株苗与丛生苗)两种状态，以1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖25g/L作为生根培养基进行培养，每处理接种20个杠柳组培苗。接种30d后统计生根率并进行直观分析，分析两种苗用于生根培养对生根率和组培苗生长状况的影响。
1.3.4驯化移栽
1.3.4.1驯化时间的筛选
将杠柳组培苗的驯化分为闭瓶驯化和开瓶驯化两个阶段。将杠柳组培苗从组培室转移到炼苗室在自然光照下闭口放置5d，然后逐渐打开瓶盖进行开瓶驯化。开瓶驯化时间设4个处理，分别为0d、3d、5d和7d。每个处理移栽30株已生根组培苗，试验重复3次。移栽3周后统计不同驯化时间处理下的移栽成活率。
1.3.4.2移栽基质的筛选
移栽基质为泥炭、蛭石和园土的不同组合，共设4个处理，分别为：1/2泥炭+1/2蛭石；1/2泥炭+1/2园土；1/2园土+1/2蛭石；1/3泥炭+1/3园土+1/3蛭石。每个处理移栽30株，重复3次。移栽3周后统计不同处理下的杠柳组培苗移栽成活率。
1.4培养条件
在杠柳带芽茎段的诱导、增殖和生根培养中，如无特殊说明，下文所提到的基本培养基均为每升含有琼脂7g，蔗糖30g，pH值为6.8±0.1的MS(生根为1/2MS)培养基，培养温度为(23±2)℃，在光照强度为2500lx下培养16h/d，相对湿度70％～80％。驯化移栽的培养条件为：移栽1～3天光照强度不宜过高，控制在5000～8000lx左右，后期逐步增强光照度。湿度控制在80％左右，随时观察移栽苗的生长状况，及时调控培养箱内温度和湿度。
1.5数据统计与分析
在外植体消毒试验中，采用Microsoft Excel统计污染率、死亡率、存活率；在杠柳带芽茎段的诱导、增殖、生根培养和驯化移栽试验中，采用Microsoft Excel统计杠柳带芽茎段在不同试验处理下的诱导率、增殖率、增殖系数、生根率和移栽成活率，数据利用DPS统计分析软件进行方差分析，Duncan法进行多重比较。具体指标统计公式如下：
污染率(％)＝(污染外植体数/接种外植体总数)×100％ (1)
死亡率(％)＝(死亡不污染外植体数/接种外植体总数)×100％ (2)
存活率(％)＝(萌芽不污染外植体数/接种外植体总数)×100％ (3)
诱导率(％)＝(诱导出芽外植体数/接种外植体总数)×100％ (4)
茎段增殖率(％)＝(增殖成功茎段数/接种茎段总数)×100％ (5)
茎段增殖系数(％)＝(增殖所得芽总数/增殖成功茎段总数)×100％ (6)
生根率(％)＝(生根外植体数/接种外植体总数)×100％ (7)
移栽成活率(％)＝(移栽成活苗数/移栽苗总数)×100％ (8)
2结果与分析
2.1不同取材时期杠柳茎段的消毒试验
2.1.1升汞对5月、7月和9月取材的杠柳茎段消毒效果
2.1.1.1升汞对5月取材的杠柳茎段消毒效果
升汞对5月取材的杠柳茎段消毒效果如图1所示。其中a、b和c分别代表使用不同浓度升汞消毒不同时间后外植体存活率、污染率和死亡率的变化趋势。由a可以看出，随着消毒时间的增长，0.05％浓度下的存活率呈上升趋势，且在5～10min出上升明显；0.1％浓度下的存活率在5～10min处呈上升趋势，在10～15min处呈下降趋势；0.2％浓度下的存活率整体呈下降趋势；0.1％浓度下消毒10min存活率最高，为83.33％。从b可以看出，各浓度下的存活率均随着消毒时间的增长而下降，污染率0.2％<0.1％<0.05％，其中0.2％的浓度消毒15min污染率最低，为3.89％。从c可以看出，随着消毒时间的增长，0.1％和0.2％浓度下的死亡率均呈上升趋势，0.2％浓度下死亡率最高，而0.05％浓度下的死亡率呈先下降后上升的趋势。
2.1.1.2升汞对7月取材的杠柳茎段消毒效果
升汞对7月取材的杠柳茎段消毒效果如图2所示。由a、b和c可以看出，随着消毒时间的增长，0.05％和0.1％浓度下的存活率均呈现上升趋势，而0.2％浓度下的存活率并没有显著的变化；各浓度下的污染率都较高，且0.05％>0.1％>0.2％。这可能是由于在7月份，0.05％和0.1％浓度在短时间内不能杀死外植体所含菌类，造成较高的污染率，而随着消毒时间的增长，弥补浓度的不足，使污染率有所下降。0.2％浓度下的死亡率随消毒时间的增长呈整体上升的趋势，这可能是由于高浓度长时间的消毒处理对外植体造成损伤导致死亡率上升；0.1％和0.05％浓度下的死亡率均呈先降低后上升的趋势，其中0.05％浓度下消毒10min死亡率最低，为3.33％。从存活率指标来看，浓度为0.1％和0.2％的升汞消毒10min对7月份取材的杠柳带芽茎段的消毒效果较好，存活率均为57.78％。
2.1.1.3升汞对9月取材的杠柳茎段消毒效果
升汞对9月取材的杠柳茎段消毒效果如图3所示。a、b和c分别代表存活率、污染率和死亡率。由图3可以看出，0.05％和0.1％浓度下的存活率均在消毒时间为10min时达到最高，分别为66.11％和67.22％；0.2％浓度升汞在消毒时间为5min时存活率最高。各浓度下的污染率均随消毒时间的增长而降低，0.05％<0.1％<0.2％。十月份的死亡率与5月份和7月份相比整体较大，0.1％和0.2％浓度均随消毒时间的增长显著提高，其中0.2％浓度消毒15min死亡率高达32.78％；0.05％浓度下死亡率的变化趋势与5月份和7月份相同，呈先下降后上升的趋势，10min<5min<15min，其中消毒时间为10min时死亡率为7.22％。
2.1.2次氯酸钠对5月、7月和9月取材的杠柳茎段消毒效果
2.1.2.1次氯酸钠对5月取材的杠柳茎段消毒效果
次氯酸钠对5月取材的杠柳茎段消毒效果如图4所示。由a、b和c可知，利用不同浓度的次氯酸钠对5月份对杠柳带芽茎段进行不同时间的消毒处理，其结果差异很大。随着消毒时间的增长，各个浓度消毒处理下污染率均呈下降趋势，死亡率与之相反，呈上升趋势，其中10％浓度的次氯酸钠消毒20min污染率最低，为3.89％，6％浓度下消毒10min污染率最高，为42.22％。不同浓度下，随着消毒时间的增长，杠柳茎段的成活率均在消毒时间为15min时达到最高，其中浓度为8％的成活率最高，为83.89％。当消毒时间延长至20min，成活率反而有所下降。浓度为6％、8％和10％的次氯酸钠均在消毒时间为15min时达到最高的存活率和最低的污染率。这说明延长消毒时间虽有利于减轻外植体的污染率，但也可能因为消毒时间过长会对外植体造成毒害或损伤，增加死亡率，从而影响成活率。
2.1.2.2次氯酸钠对7月取材的杠柳茎段消毒效果
次氯酸钠对7月取材的杠柳茎段消毒效果如图5所示。由a、b和c可以看出，不同于5月份取材的杠柳成活率，七月份取材的外植体在不同浓度次氯酸钠的消毒处理下均在消毒时间为20min时达到最大值。其中10％浓度下消毒处理的成活率最高，为64.74％；污染率最低，为23.33％，但其死亡率同时也最高，为20.56％。随着消毒时间的增长，各浓度下的污染率均呈下降趋势，在存活率均呈上升趋势的同时，死亡率也呈上升的趋势。消毒时间一定时，存活率10％>8％>6％，污染率6％>8％>10％，死亡率10％>8％>6％。这说明七月份取材的外植体存在消毒困难的现象，增加消毒剂的浓度和增长消毒时间并不能保证其成活率的提高。以存活率为标准判断，10％次氯酸钠在消毒时间为20min的消毒效果最好。
2.1.2.3次氯酸钠对9月取材的杠柳茎段消毒效果
次氯酸钠对9月取材的杠柳茎段消毒效果如图6所示。由a、b和c可以看出，在消毒时间为15min时各浓度的存活率均达到最大值，死亡率最低，其中次氯酸钠浓度10％时消毒效果较好，存活率最高为61.11％。随着消毒时间的增长，次氯酸钠浓度为6％的存活率呈上升趋势；当消毒时间从15min增长到20min时，8％浓度下存活率基本保持不变，10％浓度下存活率明显下降。造成其存活率降低的原因是死亡率的提高。随着消毒时间的增长，各浓度下的死亡率均呈先缓慢下降后上升的趋势，且与4月份和7月份相比，死亡率整体上升。其中10％浓度下死亡率在消毒时间为20min时达到最大，为51.11％。
2.1.3正交试验消毒效果
不同消毒处理对不同取材时期污染率的影响结果见表4。从表4可以看出，相同的消毒处理下，不同取材时期的消毒效果明显不同。7月份取材的污染率整体偏高，而5月份取材的污染率较低。处理3和处理4在不同月份下的污染率均为处理4<处理3，说明两种药剂混合后消毒其污染率要低于使用单一消毒剂。
处理7和处理9对5月取材的外植体消毒后污染率显著低于其他处理，分别为1.11％和3.33％，而处理1的消毒效果最差，显著高于去其他处理且污染率达到62.22％。处理7对7月取材的外植体消毒后污染率显著低于其他处理，为17.78％。9月取材污染率与七月份相比整体有所下降，处理4和7消毒后污染率较低分别为12.22％和10.00％。
表4不同取材时期污染率
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
不同消毒处理对不同取材时期存活率的影响结果见表5。从表5可以看出，相同的消毒处理下，不同取材时期的消毒效果明显不同。从整体来看，存活率5月>9月>7月。处理3和处理4对5月取材的外植体消毒效果最好，显著高于其他消毒处理，其存活率分别为84.44％和83.33％。7月取材的外植体经消毒处理后成活率明显低于5月，其中处理4对7月取材的外植体消毒后成活率高于其他消毒处理，为51.11％。9月份取材的外植体经处理4消毒后存活率显著高于除处理5以外其他处理，其存活率为61.11％。
表5不同取材时期存活率
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
2.2诱导与增殖培养
2.2.1不同蔗糖浓度对杠柳侧芽诱导的影响
由表6可知，不同蔗糖浓度下杠柳带芽茎段在接种15天后的发芽率及芽体质量不同。在杠柳茎段诱导期，随着蔗糖浓度的增加，杠柳带芽茎段发芽率呈上升趋势，当在蔗糖浓度为30g/L的浓度下发芽率最高，为80.00％，且诱导出的杠柳茎段的芽体质量最好。当蔗糖浓度为20g/L时发芽率最低，这可能是因为在组织培养中，外植体没有自养能力，需要从培养基中吸收能量，较低的蔗糖浓度不能满足杠柳茎段萌芽所需的能量，因此其发芽率很低。蔗糖浓度继续增加到35、40g/L时，其发芽率反而呈下降趋势，这可能是由于蔗糖浓度过大会影响植物细胞对养分的吸收，造成当蔗糖浓度为35和40g/L时杠柳茎段发芽率降低。40g/L时芽体质量最差，不利于后期培养。通过比较证明，当培养基中所含蔗糖浓度为30g/L时，可促进芽体的萌发并使其生长健壮，对杠柳茎段的芽诱导阶段的培养效果较为理想。
表6不同蔗糖浓度对芽诱导的影响
2.2.2不同光照条件对杠柳侧芽诱导的影响
由表7可知，不同的光照条件对杠柳带芽茎段的诱导率的影响有很大不同，当光照强度为2000lx时，随着光照时间增长，杠柳带芽茎段的诱导率也随之增大，并在光照强度为2500lx,光照时间为16h/d的光照条件下，杠柳带芽茎段的诱导率达到最高，为80.00％，而在光照强度为2000lx,光照时间为13h/d的光照条件下，其诱导率最低，为46.67％。当光照强度为2500lx和3000lx时，随着光照时间的增长，其诱导率在光照时间为16h/d达到最大值，分别为83.33％和75.00％，光照时间增长到19h/d时，诱导率反而下降。这可能是由于当光照强度过低时，通过光照时间的延长能在一定程度上弥补光照强度的不足，使诱导率有所增加，而当光照强度可以满足植物生长发育的需求时，光照时间过长反而会影响植物的生长，降低诱导率。
表7不同光照条件下杠柳带芽茎段诱导率
2.2.3不同浓度的激素组合对芽诱导的影响
由表8可以看出，不同浓度的激素组合对杠柳带芽茎段的诱导情况有很大不同。不同处理下的诱导率均存在显著性差异，其中处理5诱导率最高，为93.33％，且显著高于其他处理；诱导芽净增株高也显著高于其他处理，为7.46cm；新增叶片数量也最多，为15.27片，叶色为翠绿色，无愈伤组织的形成。处理1诱导率为86.67％，显著高于除处理5以外的其他处理，净增株高为7.38cm，叶色为鲜绿色，无愈伤组织。处理9诱导率最低，为25.56％，且显著高于其他各组处理；静增株高显著低于除处理3以外的其他处理,为3.25cm，有愈伤组织；处理3诱导率仅高于处理3，为33.33％，且显著低于除处理3以外的其他各组处理；静增株高和新增叶片数分别为2.58cm和3.53片，叶色为黄绿色，有愈伤组织的形成。对照组(MS)的诱导率仅次于处理5，为87.78％净增株高为6.31cm,显著高于处理2、3、8、9；新增叶片数为9.90片，叶色为鲜绿色，无愈伤组织的形成。实验发现，在杠柳带芽茎段的直接诱导过程中，产生愈伤组织的茎段诱导率明显低于无愈伤组织产生的茎段。这可能是由于愈伤组织的产生抑制了腋芽萌发，也可能是因为愈伤组织的产生于激素浓度的组合有关，即激素水平影响芽体的诱导，而愈伤组织只是其外在表现形式。
通过比较发现适量的6-BA对杠柳带芽茎段的诱导具有积极作用，而高浓度的NAA对杠柳芽诱导具有抑制作用，随着NAA浓度的增大，诱导率呈降低的趋势。这可能是由于生长素和细胞分裂素的比值，也可能是受杠柳本身内源激素的影响。
表8不同激素组合对芽诱导的影响
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
2.2.4不同浓度的激素组合对杠柳侧芽增殖的影响
从表9可以看出，当细胞分裂素(6-BA)浓度一定且生长素NAA和IBA浓度相同时，增殖系数处理2＞处理1，处理4＞处理3，处理6＞处理5，即：接种于添加IBA的培养基的杠柳侧芽增殖系数均高于NAA，且组培苗的生长状况也较好。这说明相同浓度生长素对杠柳侧芽增殖效果IBA优于NAA。此外，细胞分裂素和生长素比值不同，增殖效果也不同。当细胞分裂素和生长素比值为10时(处理1、2、5、6)增殖系数较低，组培苗较弱且生长较慢；比值为7.5(处理3、4)和6.7(处理7)时，增殖系数较高，分别为4.46、5.79和6.29，且组培苗生长势良好。这说明杠柳侧芽增殖适宜的细胞分裂素与生长素比值范围为6.5～7.5。其中MS+6-BA2mg/L+IBA0.3mg/L为最佳增殖培养基，增殖系数为6.29，组培苗枝干较粗壮且生长较快。
表9不同激素组合对芽增殖的影响
2.2.5不同蔗糖浓度对杠柳侧芽增殖的影响片浓绿
从表10可以看出，当蔗糖浓度在10～30g/L范围内时，随着蔗糖浓度的增加，杠柳侧芽的增殖率和增殖系数均呈逐渐增加的趋势。从增殖率来看，蔗糖浓度为30g/L时最高，为96.56％；当蔗糖低于30g/L，增殖率减少，在10g/L和20g/L浓度下分别为17.78％和43.33％，40g/L浓度较30g/L浓度下增值率有所降低，为75.56％。从增殖系数来看，当蔗糖浓度为30g/L最高，10g/L最低，分别为6.28和3.57。40g/L蔗糖浓度下虽然增值率仍较高，但增殖系数较低，为3.86。这说明蔗糖浓度过低可能无法满足杠柳侧芽增殖所需能量，但浓度过高同样会对其增殖产生不利影响。
表10蔗糖浓度对杠柳侧芽增殖的影响
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
2.2.6不同光照条件对杠柳侧芽增殖的影响
从表11可以看出，不同光照强度下杠柳组培苗的生长状况有很大差异。3000lx光照强度下组培苗生长状况最好，表现在增殖较好，增殖的苗体健壮且无玻璃化。光照强度为4000lx时，组培苗虽然也没有玻璃化现象，但整体的生长势有所降低，且增殖苗茎节变短，后期生长缓慢。光照强度低于2000lx不利于杠柳侧芽增殖，无增殖或增殖较少，苗体脆弱且有玻璃化现象。这说明适宜的光照强度是杠柳侧芽增殖苗正常生长的必要条件，光照强度不足不能完成正常增殖和生长，过高也会对增殖苗的生长产生不利影响。
表11不同光照强度下杠柳组培苗的生长状况
2.3生根培养
2.3.1 MS培养基浓度对杠柳组培苗生根率的影响
由图7可知，MS培养基浓度不同，对杠柳组培苗生根的影响不同。当MS培养基(大量元素)浓度在1～1/2时，随着其浓度的降低，组培苗生根率呈上升趋势，并在1/2MS处达到最高，为90％；当MS浓度继续降低至1/4时，生根率反而下降至25％；MS和3/4MS处的生根率分别为50％和60％。且在试验中发现，1/4MS处理中出现植株叶色发黄脱落现象，如图8所示。这说明杠柳组培苗生根培养中，适当降低大量元素浓度可以提高组培苗的生根能力，MS培养基中大量元素浓度为1/2时杠柳组培苗生根率最高或过低都不利于根系的生长。
2.3.2 IBA浓度对杠柳组培苗生根的影响
从表12和图9可以看出，IBA浓度的变化对杠柳组培苗生根情况有很大影响。当IBA浓度从0.0mg/L上升至0.5mg/L时，杠柳组培苗生根率呈上升趋势，并在浓度为0.5mg/L时达到最高，为91.67％；当IBA浓度从0.5mg/L上升至1.0mg/L时生根率反而下降，并在浓度为1.0mg/L时生根率达到最低，为23.33％，这说明IBA浓度过高或过低都不利于生根，单纯增大IBA浓度并不能提高生根率。当IBA浓度为0.5mg/L时，杠柳组培苗根系条数最多，平均数为11.5条，且明显高于其他浓度处理；浓度为0.0mg/L时根系数量最少，为4.3条。IBA浓度为0.0mg/L时，其根系细长细弱，几乎没有侧根(如a)，即使移栽也很难成活；IBA浓度为0.5mg/L时，根系长度为6.2cm，但其根系粗壮，侧根发达(如c)；IBA浓度为0.7(如d)和1.0mg/L(如e)时，根系长度分别为2.5和2.3cm,且没有侧根，这说明IBA浓度过高可能会抑制根系的生长。综上所述，当IBA浓度为0.5mg/L最适于杠柳根系生长。
表12 IBA浓度对杠柳组培苗生根的影响
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
2.3.3不同蔗糖浓度对杠柳组培苗生根的影响
从表13可以看出，当蔗糖浓度为25g/L时，杠柳组培苗的生根率最高，为90.00％，且该浓度下根的生长状况也较好，生根数多，侧根多且伸长生长良好，根部茁壮；当浓度增加到30g/L时生根率有所降低，为85％，根数虽多且粗壮但根的长度较短；当蔗糖浓度为20g/L，生根率为70％，该浓度下根数量少，长度中等。15g/L的蔗糖浓度下根数少，跟细长细弱，生根状况不理想。
表13蔗糖浓度对组培苗生根的影响
2.3.4组培苗状态对生根的影响
由表14可以看出，单从生根率来看，单株苗和丛生苗的生根率有差异但差异不大，单株苗生根率为95％，丛生苗为85％。接种苗状态不同，其组培苗生长状况也不同。丛生苗切成单株进行生根培养时，仍会在基部形成愈伤组织，并有少数增殖苗产生，根数量较多且粗壮；而单株苗进行生根培养时几乎没有愈伤组织的形成和增殖苗的产生，根数量为4～6，长度较长且侧根数量较多。造成这些差异的原因可能与植株体内积累的植物激素的成分和含量有关。
表14单株苗与丛生苗生根率
2.4驯化移栽
2.4.1不同驯化时间对杠柳组培苗移栽成活率的影响
从表15可以看出，在闭瓶驯化时间一定的基础上，开瓶驯化时间不同，杠柳组培苗移栽成活率在各个处理上存在显著性差异。其中，不经开瓶驯化直接移栽的杠柳组培苗成活率极显著低于经开平驯化的组培苗，成活率为24.44％，随着开瓶驯化天数的增长，其移栽成活率在开瓶驯化时间为5天的处理下达到最高，为77.78％，显著高于其他处理。这说明适当增加开瓶驯化时间可以使组培苗逐渐适应新环境，达到壮苗目的。当开瓶驯化时间继续增加到7d时，移栽成活率较开瓶驯化时间为5d有所降低，这可能是由于开瓶驯化时间过长，组培苗受外界环境影响较大，或是培养基营养成分消耗过多，其生活力有所降低，造成移栽成活率降低。
表15不同驯化时间对组培苗移栽成活率的影响
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
2.4.2不同移栽基质对杠柳组培苗移栽成活率的影响
图10为不同基质下杠柳组培苗移栽成活率。从图10可以看出，不同基质下的存活率：处理1＞4＞3＞2。处理1(1/2泥炭+1/2蛭石)存活率最高，为78.89％，处理2(1/2泥炭+1/2园土)最低，为41.11％，这可能是由于园土和泥炭这两种基质混合在一起后，透气性不好，造成根系难以吸收水分养分或根系腐烂，降低成活率。由此可以看出，适宜的栽培基质应既具备组培苗生长所需要的营养，又有良好的通气性。
3最终技术方案
为了在短时间内获得大量优良苗木、扩大繁殖以满足市场需求，本研究利用植物组织培养技术，以杠柳带芽茎段作为外植体，对杠柳茎段组培快繁技术进行了较为系统的研究，包括消毒处理、诱导培养、增殖培养、生根培养和驯化移栽五个植物离体快繁的主要阶段，确定了专属杠柳的快速繁殖方法，即：
(1)利用不同浓度、不同种类的消毒剂对不同取材时期(5月、7月和9月)的杠柳带芽茎段进行较为系统的消毒试验，方法采用单因素试验和正交试验。5月取材的外植体适宜的消毒方式为，75％酒精1min+8％次氯酸钠15min，其存活率为84.44％。7月取材的外植体适宜的消毒方式为：75％酒精30s+10％次氯酸钠20min，其存活率为64.74％。9月取材的外植体适宜的消毒方式为：75％酒精30s+0.1％升汞10min，其存活率为67.22％。以杠柳带芽茎段作为外植体材料的组织培养的最佳取材时期为5月，此时材料污染较易控制，存活率较高。
(2)将经过消毒处理后无污染的杠柳茎段接种到诱导培养基中进行诱导培养。研究不同蔗糖浓度和光照条件，以及不同浓度、不同种类植物生长调节剂组合对杠柳带芽茎段诱导的影响。适宜的培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L；适宜的光照强度为2500lx，光照时间为16h/d，光照时间过长会影响植物生长，降低诱导率；此培养条件下诱导率达93.33％。
(3)将经过消毒处理后无污染的杠柳茎段接种到增殖培养基中进行增殖培养。研究不同蔗糖浓度和光照条件，以及不同浓度、不同种类植物生长调节剂组合对杠柳带芽茎段增殖的影响。适宜的培养基为MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.3mg/+蔗糖30g/L，浓度过低不利于增殖；适宜的光照强度为3000lx；此培养条件下增殖效果较好，增殖系数达5.79。
(4)选择生长健壮的无菌苗进行生根培养，研究不同MS浓度、IBA浓度、蔗糖浓度和组培苗状态对组培苗生根的影响。适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖25g/L，此培养条件下苗端健壮，根系发达。使用诱导苗直接生根比使用增殖苗生根效果好，生根率达91.67％。
(5)移栽基质试验采用泥炭、蛭石和园土的不同组合，1/2泥炭+1/2蛭石的移栽基质组合下移栽成活率较高，达78.89％。闭瓶炼苗5d+开瓶炼苗5d效果理想。
通过上述研究内容可知，本发明所述杠柳的快速繁殖方法与张坚刘志飞等对滇杠柳茎段和顶芽组织培养及植株再生研究中的方法完全不同，具体见表16。与张坚等对杠柳组培苗的诱导方法也完全不同，见表17。
表16本发明方法与刘飞等对杠柳组培苗的诱导方法不同点
表17本发明方法与张坚等对杠柳组培苗的诱导方法不同点
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。