《一种糖尿病肾病动物模型的构建方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种糖尿病肾病动物模型的构建方法.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610221149.1 (22)申请日 2016.04.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105726568 A (43)申请公布日 2016.07.06 (73)专利权人 陕西科技大学 地址 710021 陕西省西安市未央区大学园1 号 (72)发明人 龚频 皮思慧 王兰 杨文娟 常相娜 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 (51)Int.Cl. A01K 67/02(2006.01) A61K 33/24。
2、(2006.01) A23K 20/158(2016.01) A23K 20/163(2016.01) (56)对比文件 CN 103432572 A,2013.12.11, CN 101766149 A,2010.07.07, 石光等.糖尿病肾病大鼠模型制备方法与模 型建立标准研究. 辽宁中医药大学学报 .2014, 第16卷(第7期), 审查员 孔越 (54)发明名称 一种糖尿病肾病动物模型的构建方法 (57)摘要 本发明提供了一种糖尿病肾病动物模型的 构建方法， 模拟环境污染对疾病发生的影响， 糖 尿病肾病模型诱导物为氯化镉， 主要通过腹腔注 射给药， 结合时长为8周的高糖高脂饲喂， 生。
3、理生 化指标检测结果显示氯化镉能够引起血糖升高， NAG含量增加， 病理学检查符合糖尿病肾病的病 理变化， 本发明具有操作简单、 经济适用、 造模成 功率高等特点， 而且能模仿糖尿病肾病的发病经 过， 解决了现有糖尿病肾病动物模型单一性的问 题。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105726568 B 2019.01.29 CN 105726568 B 1.一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 以高脂高糖饲料喂养实验动物79周， 高脂高糖饲料喂养期间每天对每只实验动物腹 腔注射含镉溶液， 每只实验动物每天的注射量按照氯化镉计算为12mg/kg， 高脂高糖。
4、饲料 喂养期结束后， 从所述实验动物中挑选空腹血糖11.1mmol/L的个体作为糖尿病肾病动物 模型。 2.根据权利要求1所述一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 所述含镉溶 液为氯化镉水溶液。 3.根据权利要求1所述一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 所述实验动 物选自小鼠、 大鼠、 比格犬、 恒河猴、 猪、 牛。 4.根据权利要求3所述一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 所述实验动 物选自昆明小鼠。 5.根据权利要求1所述一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 所述高脂高 糖饲料喂养采用自由取食方式。 6.根据权利要求1所述一种糖尿病肾病动。
5、物模型的构建方法， 其特征在于： 所述高脂高 糖饲料喂养期间， 实验动物按需自由饮水。 7.根据权利要求1所述一种糖尿病肾病动物模型的构建方法， 其特征在于： 所述高脂高 糖饲料按质量分数由以下组分组成： 1719的猪油、 1921的蔗糖、 24的蛋黄以及 5860的实验动物日常维持型饲料。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105726568 B 2 一种糖尿病肾病动物模型的构建方法 技术领域 0001 本发明属于药理学领域， 涉及一种糖尿病肾病动物模型的构建方法。 背景技术 0002 糖尿病(diabetes mellitus， DM)是全球性严重的公共卫生问题， 我国糖尿病患病 。
6、率出现 “井喷” 趋势， 中国已取代印度， 成为糖尿病第一大国， 糖尿病患病率达9.7， 约有9 千万中国人罹患糖尿病。 目前我国每年DM医疗支出达200亿元， 占全国卫生资源总消耗的 4.38， 严重阻碍了我国的经济发展。 其危害性主要表现在各种慢性并发症上， 不仅是糖尿 病患者致死致残的最主要原因， 还造成了沉重的经济负担。 0003 糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病全身性微血管并发症， 亦是导 致慢性肾衰的主要原因之一， 病程10年以上的T2DM患者累积有20发生DN。 在西方国家， DN 已成为终末期肾病(end-stage renal disea。
7、se， ESRD)的主要病因， 在美国， 近42的ESRD 患者因DM所致， 其中T2DM更是占到了90， 在每年新增的ESRD中， 有50是DN患者。 而根据 我国部分城市2002年统计的资料显示， DN占ESRD的15左右。 DN早期临床症状隐匿， 发现晚 且病变难以逆转， 目前尚缺乏有效的治疗方法， 仅依靠降糖、 降压和调脂等常规治疗手段。 因此， DN的治疗现状不容乐观， 其关键在于早期诊断及防治， 一旦进入临床蛋白尿期， 肾损 害则难以逆转。 0004 DN的发病机制较复杂， 至今仍未完全明确， 涉及高糖毒性， 脂代谢紊乱， 肾血流动 力学异常， 细胞因子和生长因子， 炎症因子和氧化。
8、应激等多个方面。 建立一种能够模仿人类 糖尿病肾病发病过程的动物模型能够有助于深入了解糖尿病肾病的发病机制， 从而更好的 防治糖尿病肾病。 0005 目前有关糖尿病肾病的研究模型较少， 包括自发性或遗传性动物模型， 基于化学 药物诱导、 高脂高糖饲料诱导、 手术切除胰腺和转基因动物所建立的模型， 但一般都是基于 糖尿病动物模型的基础上， 并不能完全反映糖尿病肾病发生过程的病理及生理变化特点。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种糖尿病肾病动物模型的构建方法。 0007 为达到上述目的， 本发明采用了以下技术方案： 0008 该动物模型的构建方法包括以下步骤： 以高脂高糖饲料喂养实验动物。
9、79周， 高 脂高糖饲料喂养期间每天对每只实验动物腹腔注射含镉溶液， 每只实验动物每天的含镉溶 液注射量按照氯化镉计算为12mg/kg， 高脂高糖饲料喂养期结束后， 从所述实验动物中挑 选空腹血糖11.1mmol/L的个体作为糖尿病肾病动物模型。 0009 所述含镉溶液为氯化镉水溶液。 0010 所述实验动物选自小鼠、 大鼠、 比格犬、 恒河猴、 猪、 牛。 0011 所述实验动物选自昆明小鼠。 0012 所述高脂高糖饲料喂养采用自由取食方式。 说 明 书 1/4 页 3 CN 105726568 B 3 0013 所述高脂高糖饲料喂养期间， 实验动物按需自由饮水。 0014 所述高脂高糖饲料。
10、按质量分数由以下组分组成： 1719的猪油、 1921的蔗 糖、 24的蛋黄以及5860的实验动物日常维持型饲料。 0015 本发明基于高脂高糖饲料喂养联合镉慢性中毒处理建立了一种利用镉损伤构建 糖尿病肾病小鼠模型的方法， 为研究环境污染与疾病发生之间的相关性提供了一种新的模 型， 该方法与传统糖尿病肾病动物模型构建相比， 具有以下优点： 0016 1.模仿环境因素对疾病发生的影响， 增强了研究的实用性。 0017 2.具有建模时间短、 成功率高、 无手术风险且建模成本相对较低的特点， 而且能模 仿糖尿病肾病的发病经过， 具备糖尿病肾病经常合并的高血脂、 高血糖等特点， 病理学检查 符合糖尿病。
11、肾病的病理变化。 附图说明 0018 图1为不同分组小鼠血糖(Blood sugar)值检测结果； 表示与空白组相比， P 0.05， #表示与损伤组相比， P0.05； 0019 图2为不同分组小鼠NAG值检测结果； 表示与空白组相比， P0.05， #表示与损伤 组相比， P0.05； 0020 图3为不同分组小鼠生化指标检测结果， A： 总胆固醇(TC)， B： 甘油三酯(TG)， C： 碱 性磷酸酶(ALP)， D： 转氨酶(AST)， E： 高密度脂蛋白(HDL)， F： 低密度脂蛋白(LDL)； 表示与 空白组相比， P0.05， #表示与损伤组相比， P0.05； 表示与空白组相。
12、比， P0.01， #表示 与损伤组相比， P0.01； 0021 图4为不同分组小鼠组织形态学观察结果； A为空白组， B为损伤组， C为保护组。 具体实施方式 0022 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。 0023 为了尽可能真实的还原环境污染对于糖尿病肾病发生的影响， 本发明提供了一种 利用镉慢性中毒的方法构建糖尿病肾病动物模型的方法。 本发明中的动物包括但不限于： 小鼠、 大鼠、 比格犬、 恒河猴、 猪、 牛等与科学实验和人们生活息息相关的动物(以下以小鼠 为例)。 0024 一、 动物准备 0025 成年昆明雄性小鼠30只， 体重20g2g， 自由取食、 饮水， 生活节律按照昼。
13、夜节律。 0026 二、 动物分组及模型构建 0027 经过适应性喂养一周后， 小鼠随机分为空白组(Control)、 损伤组(DN)和保护组 (Protect group)， 每组10只。 0028 空白组给予普通饲料(即实验小鼠日常维持型饲料)喂养， 损伤组给予高脂高糖饲 料喂养， 同时空白组给予腹腔注射0.9生理盐水， 损伤组给予腹腔注射氯化镉水溶液， 每 次给药体积为0.30.5mL， 根据小鼠的重量及氯化镉给药量2mg/(kgd)， 计算具体给药体 积， 氯化镉水溶液的浓度为0.1mg/mL， 时长为8周， 期间小鼠保持自由饮水。 具体的建模方式 见表1。 最后一天给药完毕后， 空腹。
14、， 自由饮水。 0029 表1糖尿病肾病小鼠建模方法 说 明 书 2/4 页 4 CN 105726568 B 4 0030 0031 所述普通饲料的饲喂量为： 小鼠自由取食， 一天6g左右。 0032 所述高脂高糖饲料的饲喂量为： 小鼠自由取食， 一天6g左右。 0033 所述高脂高糖饲料的组分及质量配比如下： 猪油18， 蔗糖20， 鸡蛋黄3以及 实验小鼠日常维持型饲料(购于西安交通大学医学院实验动物中心)59。 该饲料配方与市 售高脂高糖饲料相比， 提高了猪油比例， 并且加入了少量鸡蛋黄， 能够更加快速的构建糖尿 病肾病模型。 0034 三、 生理生化指标的测定 0035 8周喂养后， 。
15、对各组小鼠禁食12小时后尾静脉取血， 测量其空腹血糖， 以及总胆固 醇(TC)、 甘油三酯(TG)、 碱性磷酸酶(ALP)、 转氨酶(AST)、 低密度脂蛋白(LDL)、 高密度脂蛋 白(HDL)和N-乙酰- -D-葡萄糖苷酶(NAG)活性。 0036 四、 模型的验证 0037 以公认的血糖11.1mmol/L及N-乙酰- -D-葡萄糖苷酶活性上升作为糖尿病肾病 小鼠建模成功标准。 不同物种的NAG活性差别很大， 因而无法给出一定规定的标准用以判断 肾损伤的发生。 以小鼠为例， 通常以个体NAG活性较正常值升高作为判断肾损伤发生的标 准。 0038 五、 测定结果以及分析 0039 1)分组。
16、小鼠空腹血糖的测定结果参见图1， 从图1可以看出， 与空白组相比， 损伤组 说 明 书 3/4 页 5 CN 105726568 B 5 小鼠的血糖显著上升， 即高脂高糖联合镉的毒性作用能够造成小鼠血糖上升， 诱导其发生 糖尿病。 多次类似的损伤实验表明， 平均建模成功率为95， 如果没有达到标准， 就认为建 模失败。 0040 2)分组小鼠NAG活性的测定结果参见图2， 从图2可以看出， 高脂高糖联合镉的毒性 作用能够诱导小鼠肾脏损伤。 多次类似的损伤实验表明， 与空白组相比， 损伤组小鼠的NAG 活性均显著性上升。 0041 3)分组小鼠其他生理生化指标测定结果参见图3， 从图3可以看出，。
17、 高脂高糖联合 镉的毒性作用能够在小鼠上诱导出糖尿病肾病典型的物质和能量代谢紊乱。 0042 4)分组小鼠组织形态学观察结果参见图4， 从图4A可以看出， 空白组小鼠肾脏的肾 小球结构完整， 轮廓清晰， 肾小管完整， 有完整的细胞结构， 无炎症细胞侵润。 从图4B可以看 出， 损伤组小鼠肾脏出现水肿， 肾小球萎缩和系膜基质增生， 肾小管细胞结构不完整， 同时 出现肾小管管腔扩张的现象， 部分肾小管基底膜不清楚， 近端肾小管出现坏死， 同时出现许 多空泡及间质可以观察到有细胞炎症侵润。 而从图4C可以看出， 在保护组中肾小管结构完 整， 无细胞皱缩以及炎症侵润， 空泡现象明显减少。 0043 5。
18、)结论 0044 已有研究表明， 镉的毒性作用能够诱导糖尿病的发生， 且镉一旦进入机体， 主要富 积在肾脏中， 对肾脏造成损伤， 影响肾脏的正常功能， 因此， 本发明通过高脂高糖联合镉中 毒诱导构建了小鼠糖尿病肾病模型， 实验表明， 8周氯化镉的处理， 能够诱导小鼠血糖升高， 肾脏损伤， 表明高脂高糖联合镉能够对小鼠糖代谢以及肾脏功能造成影响。 与现有糖尿病 肾病建模方法相比， 本发明具有肾脏损伤明显(与高脂高糖饲料诱导相比)、 建模时间短、 成 功率高(与化学药物诱导相比)、 无手术风险(与手术切除胰腺相比)且建模成本相对较低 (与转基因动物相比)的技术优势。 建模过程中的中毒剂量、 时间及方式等会非常大的影响 建模成功率， 例如， 剂量过少会造成检测指标不合格， 建模失败； 剂量过多导致实验动物死 亡。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105726568 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 105726568 B 7 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 105726568 B 8 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 105726568 B 9 。