一种皱叶山姜的组织培养快繁方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810690810.2 (22)申请日 2018.06.28 (71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所海 南分所 地址 570311 海南省海口市秀英区药谷四 路4号 (72)发明人 郑希龙 张雯 李伟杰 戴波 杨海建 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 朱双 刘明星 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种皱叶山姜的组织培养快繁方法 (57)摘要 本发明公开了一种皱叶山姜的组织培养快 繁。

2、方法。 该方法包括外植体消毒、 不定芽诱导、 不 定芽增殖、 生根壮苗和炼苗移栽步骤。 本发明只 需简单的植物组织培养设备即可进行， 在80 120d内完成从外植体块茎上的芽点到完整植株 的一个周期， 大大加快了皱叶山姜的繁殖速度。 本方法培养皱叶山姜生产周期短、 增殖倍数高、 成活率高， 能获得足量试管植株， 利于大规模市 场推广。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 108668900 A 2018.10.19 CN 108668900 A 1.一种皱叶山姜的组织培养快繁方法， 其特征在于， 包括以下步骤： a.外植体消毒： 挑选有新芽的皱叶山姜地下茎， 除去须根、 茎尖、 外层包。

3、裹的叶片， 清理 消毒， 切分含有单个芽点的块茎作为外植体， 对外植体进行消毒； b.不定芽诱导： 将外植体接种到不定芽诱导培养基中， 诱导培养不定芽； 所述的不定芽 诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤2.03.5mg、 奈乙酸0.20.3mg、 蔗糖2030g、 琼脂 5.06.0g， 余量为MS培养基， pH值为5.65.8； c.不定芽增殖： 切取不定芽， 除去叶片和茎， 留芽基部， 将其接种到不定芽增殖培养基 中， 培养形成丛生芽； 所述的不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤1.53.0mg、 奈 乙酸0.10.3mg、 蔗糖2030g、 琼脂56g， 余量为MS培养基， 。

4、pH值为5.65.8； d.生根壮苗： 切取单个丛生芽， 将其接种到生根壮苗培养基中， 培养形成生根苗； 所述 的生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸0.30.8mg、 蔗糖2030g、 琼脂56g， 余量为MS培养 基， pH值为5.65.8； e.炼苗移栽： 将生根苗取出， 洗净根部培养基， 经消毒后将生根苗移栽至栽培基质中， 进行培养管理， 获得皱叶山姜种苗。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤a的清理消毒是用体积分数 75乙醇水溶液冲洗干净； 所述的步骤a的对外植体进行消毒是将外植体用体积分数75 乙醇水溶液浸泡2030s， 无菌水清洗1次； 再用质量分数0.080.。

5、12升汞浸泡8 10min， 无菌水冲洗46次。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤b、 c、 d中的培养条件为： 温度27 2， 光照强度18002300lx， 光照时间1014h/d。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的所述的步骤b、 c、 d中的培养条件为： 温度272， 光照强度2000lx， 光照时间12h/d。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤e的消毒是将生根苗使用质量 分数0.10.3百菌清溶液浸泡3040min。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤e的栽培基质为将细砂、 珍珠岩 和泥炭土以重量。

6、比12： 12： 34混匀得到的混合物。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤e的培养条件为： 温度2327 ， 空气相对湿度7080。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的不定芽诱导培养基： 每升含有6 苄 氨基腺嘌呤3.0mg、 奈乙酸0.3mg、 蔗糖30g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄 氨基腺嘌呤2.0mg、 奈乙酸0.15mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征。

7、在于， 所述的生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸 0.5mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108668900 A 2 一种皱叶山姜的组织培养快繁方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体涉及一种皱叶山姜的组织培养快繁方 法。 背景技术 0002 皱叶山姜(Alpinia rugosa S.J.Chen&Z.Y.Chen)是姜科山姜属新种， 仅产海南保 亭吊罗山。 自1990年引种到华南植物园后， 国内的西双版纳植物园和国外夏威夷自华南植 物园引种。 目前夏威夷已将皱叶山姜繁殖应用。 该植物以。

8、其叶皱缩， 具有极高的园艺观赏 性， 是姜科新型园艺观赏植物。 叶片长圆， 叶面无毛， 背面密被短柔毛， 极具皱纹， 基部深心 形重叠， 稍偏斜。 总状花序直立， 密花， 有9-20朵花， 整个花序在果期稍长， 背密黄色短柔毛； 苞片褐色， 花萼粉红色， 管状； 因其株型整齐、 叶片奇特且易于栽培管理， 可应用于各类公共 绿地、 庭院及道路两旁绿地， 也可作为室内观叶和林下地被植物。 0003 皱叶山姜繁殖主要采用切分根状茎繁殖， 因物种的稀缺性， 没有过多的植株供切 分繁殖。 且切分繁殖增殖率较低， 长期分株繁殖容易感染病毒， 不利于品种优良遗传特性的 稳定性。 组织培养繁殖成活率高、 繁殖。

9、增长率高、 生长周期短， 可在短期内进行大规模繁殖； 然而， 尚未有适合皱叶山姜组织培养快繁的相关方法。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种皱叶山姜的组织培养快繁方法， 以克服现有技术中存 在的不足， 该方法培养皱叶山姜生产周期短、 增殖倍数高、 成活率高， 能获得足量试管植株； 并且提高皱叶山姜种苗稳定性， 保持母株的优良特性。 0005 本发明的皱叶山姜的组织培养快繁方法， 包括以下步骤： 0006 a.外植体消毒： 挑选有新芽的皱叶山姜地下茎， 除去须根、 茎尖、 外层包裹的叶片， 清理消毒， 切分含有单个芽点的块茎作为外植体， 对外植体进行消毒； 0007 b.不定芽诱导： 。

10、将外植体接种到不定芽诱导培养基中， 诱导培养不定芽； 所述的不 定芽诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤2.03.5mg、 奈乙酸0.20.3mg、 蔗糖2030g、 琼脂5.06.0g， 余量为MS培养基， pH值为5.65.8； 0008 c.不定芽增殖： 切取不定芽， 除去叶片和茎， 留芽基部， 将其接种到不定芽增殖培 养基中， 培养形成丛生芽； 所述的不定芽增殖培养基： 每升含有6苄氨基腺嘌呤1 .5 3.0mg、 奈乙酸0.10.3mg、 蔗糖2030g、 琼脂56g， 余量为MS培养基， pH值为5.65.8； 0009 d.生根壮苗： 切取单个丛生芽， 将其接种到生根壮苗培养基。

11、中， 培养形成生根苗； 所述的生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸0.30.8mg、 蔗糖2030g、 琼脂56g， 余量为MS 培养基， pH值为5.65.8； 0010 e.炼苗移栽： 将生根苗取出， 洗净根部培养基， 经消毒后将生根苗移栽至栽培基质 中， 进行培养管理， 获得皱叶山姜种苗。 0011 优选， 所述的步骤a的清理消毒是用体积分数75乙醇水溶液冲洗干净； 所述的步 说 明 书 1/5 页 3 CN 108668900 A 3 骤a中对外植体进行消毒是将外植体用体积分数75乙醇水溶液浸泡2030s， 无菌水清洗 1次； 再用质量分数0.080.12升汞浸泡810min， 无菌水冲洗。

12、46次。 0012 优选， 所述的步骤b、 c、 d中的培养条件为： 温度272， 光照强度18002300lx， 光照时间1014h/d。 0013 更优选的， 所述的步骤b、 c、 d中的培养条件为： 温度272， 光照强度2000lx， 光 照时间12h/d。 0014 优选， 所述的步骤e的消毒是将生根苗使用质量分数0.10.3百菌清溶液浸 泡3040min。 0015 优选， 所述的步骤e的栽培基质为细砂、 珍珠岩和泥炭土以重量比12： 12： 34 混匀得到的混合物。 0016 优选， 所述的步骤e的培养条件为： 温度2327， 空气相对湿度7080。 0017 优选， 所述的不定。

13、芽诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤3.0mg、 奈乙酸0.3mg、 蔗糖30g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 0018 优选， 所述的不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤2.0mg、 奈乙酸0.15mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 0019 优选， 所述的生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸0.5mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为 MS培养基， pH值为5.8。 0020 本发明以皱叶山姜地下块茎上的新芽为材料， 地下茎染有多种微生物； 若直接用 水冲洗地下块茎， 由于块茎可能在采挖过程中有所损伤， 自来水。

14、冲洗很可能造成伤口染菌 使外植体污染， 这将影响后续皱叶山姜扩繁， 繁殖慢、 成活率低。 本发明先对外植体块茎进 行清理消毒， 然后切分带芽点的块茎； 植株自采挖后避免接触其他物质或受到感染， 经过多 次消毒处理， 外植体污染率低， 消毒效果明显， 这将有利于后续的组织培养繁殖： 极大缩短 了繁殖周期且提高了植株的成活率。 0021 本发明的有益效果在于： 0022 (1)本发明以皱叶山姜地下茎上的新芽为材料， 经过多次消毒处理， 即可进入诱导 期， 消毒处理后的外植体污染率低， 本发明只需简单的植物组织培养设备即可进行， 利用植 物组织细胞的全能性和植物组织培养等生物技术就可在80120d内。

15、完成从外植体块茎上 的芽点到完整植株的一个周期， 大大加快了皱叶山姜的繁殖速度。 0023 (2)能保存皱叶山姜野生种质资源， 提高皱叶山姜种苗稳定性， 通过块茎上的芽点 无性繁殖的种苗能够完全保持亲本的遗传信息， 母本的优良品质得以稳定遗传。 增殖的种 苗具有苗壮、 生长一致的优点， 便于统一管理， 节省生产成本。 0024 (3)通过诱导和增殖培养， 大大提高了皱叶山姜的繁殖系数； 生根培养获得叶片伸 展、 根系发达的壮苗， 增强了种苗的抗逆性， 提高了栽培成活率。 0025 本发明的皱叶山姜组织培养快繁方法简便易行， 能在短时间内获得大量无菌种 苗， 植株生长健壮， 投入低产出高， 利于。

16、大规模市场推广。 附图说明 0026 图1为实施例1皱叶山姜剥去外皮消毒后的外植体。 0027 图2为实施例1外植体接入不定芽诱导培养基12d的不定芽。 说 明 书 2/5 页 4 CN 108668900 A 4 0028 图3为实施例1切割不定芽接入不定芽增殖培养基20d的丛生芽。 0029 图4为实施例1生根壮苗培养形成的生根苗完整植株。 0030 图5为实施例1洗净根部培养基消毒后的生根苗。 0031 图6为实施例1移栽成活的皱叶山姜种苗。 具体实施方式 0032 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 以下实例中未具 体注明的实验方法， 均可按照常规方法进行， 或。

17、按照所用产品生产厂商的使用说明； 所使用 的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可通过商业途径得到。 0033 实施例1 0034 本发明实施例提供一种皱叶山姜的组织培养快繁方法， 其包括以下步骤： 0035 (1)外植体消毒： 挑选有新芽的皱叶山姜地下茎， 用纸巾擦干净， 剪去块茎上的须 根， 切去茎尖， 剥去外层包裹叶片， 将外植体在体积分数75乙醇水溶液下将泥土冲洗干 净。 切分含有单个芽点的块茎为外植体， 并对外植体进行消毒； 体积分数75乙醇水溶液消 毒20s， 无菌水清洗1次； 再用质量分数0.1升汞消毒10min， 无菌水冲洗4次； 消毒后的外植 体如图1所示。 0036 (2)。

18、不定芽诱导： 将步骤(1)中消毒好的芽点外植体接种到不定芽诱导培养基中， 进行不定芽的诱导培养， 外植体在诱导培养基上12d形成高12cm的不定芽(如图2所示)； 所述不定芽诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤2.0mg、 奈乙酸0.2mg、 蔗糖20g、 琼脂 5.0g， 余量为MS培养基， pH值为5.6； 不定芽诱导培养条件为： 温度272， 光照强度 1800lx， 光照时间10h/d， 不定芽诱导培养时间为28d。 0037 (3)不定芽增殖： 切下步骤(2)中诱导出的不定芽， 切掉叶片和茎， 留芽基部， 接种 到不定芽增殖培养基中进行继代培养， 切割的不定芽在不定芽增殖培养基上培。

19、养20d就可 形成3-5个丛生芽(如图3所示)； 所述不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤1.5mg、 奈乙酸0.1mg、 蔗糖20g、 琼脂5g， 余量为MS培养基， pH值为5.6。 不定芽增殖培养条件为： 温度 272， 光照强度1800lx， 光照时间10h/d， 增殖培养的时间为40d。 0038 (4)生根壮苗： 切下步骤(3)中苗高46cm的单个丛生芽， 并将其接种到生根壮苗 培养基中进行生根培养， 以形成完整植株的生根苗(如图4所示)； 所述生根壮苗培养基： 每 升含有奈乙酸0.3mg、 蔗糖20g、 琼脂5g， 余量为MS培养基， pH值为5.6。 生根壮苗培养的条件。

20、 为： 温度272， 光照强度1800lx， 光照时间10h/d， 生根壮苗培养的时间为26d。 0039 (5)炼苗移栽： 将步骤(4)中培养高68cm的生根苗， 洗净根部培养基(如图5所 示)， 经消毒后将生根苗移栽至栽培基质中， 正常培养管理即可获得皱叶山姜种苗(如图6所 示)。 所述栽培基质为将细砂、 珍珠岩和泥炭土以重量比1： 2： 3混匀得到的混合物； 所述消毒 是使用质量分数0.1百菌清溶液浸泡30min； 生根苗移栽至栽培基质后， 进行遮阴培养， 培 养温度23， 空气相对湿度70。 0040 实施例2 0041 本发明实施例提供一种皱叶山姜的组织培养快繁方法， 其包括以下步骤。

21、： 0042 (1)外植体消毒： 挑选有新芽的皱叶山姜地下茎， 用纸巾擦干净， 剪去块茎上的须 根， 切去茎尖， 剥去外层包裹叶片， 将外植体在流动的体积分数75乙醇水溶液下将泥土冲 说 明 书 3/5 页 5 CN 108668900 A 5 洗干净。 切分含有单个芽点的块茎为外植体， 并对外植体进行消毒； 体积分数75乙醇水溶 液消毒25s， 无菌水清洗1次； 再用质量分数0.1升汞消毒9min， 无菌水冲洗4次。 0043 (2)不定芽诱导： 将步骤(1)中消毒好的芽点外植体接种到不定芽诱导培养基中， 进行不定芽的诱导培养； 所述不定芽诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤3.0mg、 。

22、奈乙酸 0.3mg、 蔗糖30g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8； 不定芽诱导培养条件为： 温度27 2， 光照强度2000lx， 光照时间12h/d， 不定芽诱导培养时间为25d。 0044 (3)不定芽增殖： 切下步骤(2)中诱导出的不定芽， 切掉叶片和茎， 留芽基部， 接种 到不定芽增殖培养基中进行继代培养； 所述不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤 2.0mg、 奈乙酸0.15mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 不定芽增殖培养条 件为： 培养温度272， 光照强度2000lx， 光照时间12h/d， 增殖培养的时间为。

23、35d。 0045 (4)生根壮苗： 切下步骤(3)中苗高46cm的单个丛生芽， 并将其接种到生根壮苗 培养基中进行生根培养， 以形成完整植株的生根苗； 所述生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸 0.5mg、 蔗糖25g、 琼脂5.5g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 生根壮苗培养的条件为： 温度27 2， 光照强度2000lx， 光照时间12h/d， 生根壮苗培养的时间为20d。 0046 (5)炼苗移栽： 将步骤(4)中培养高68cm的生根苗， 洗净根部培养基， 经消毒后将 生根苗移栽至栽培基质中， 正常培养管理即可获得皱叶山姜种苗。 所述栽培基质为将细砂、 珍珠岩和泥炭土以重量比2：。

24、 1： 4混匀得到的混合物； 所述消毒是使用质量分数0.2百菌清 溶液浸泡35min； 生根苗移栽至栽培基质后， 进行遮阴培养， 培养温度25， 空气相对湿度 80。 0047 实施例3 0048 本发明实施例提供一种皱叶山姜的组织培养快繁方法， 其包括以下步骤： 0049 (1)外植体消毒： 挑选有新芽的皱叶山姜地下茎， 用纸巾擦干净， 剪去块茎上的须 根， 切去茎尖， 剥去外层包裹叶片， 将外植体在流动的体积分数75乙醇水溶液下将泥土冲 洗干净。 切分含有单个芽点的块茎为外植体， 并对外植体进行消毒； 体积分数75乙醇水溶 液消毒30s， 无菌水清洗1次； 再用质量分数0.1升汞消毒8mi。

25、n， 无菌水冲洗6次。 0050 (2)不定芽诱导： 将步骤(1)中消毒好的芽点外植体接种到不定芽诱导培养基中， 进行不定芽的诱导培养； 所述不定芽诱导培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤3.5mg、 奈乙酸 0.3mg、 蔗糖30g、 琼脂6.0g， 余量为MS培养基， pH值为5.6； 不定芽诱导培养条件为： 温度27 2， 光照强度2300lx， 光照时间14h/d， 不定芽诱导培养时间为35d。 0051 (3)不定芽增殖： 切下步骤(2)中诱导出的不定芽， 切掉叶片和茎， 留芽基部， 接种 到不定芽增殖培养基中进行继代培养； 所述不定芽增殖培养基： 每升含有6 苄氨基腺嘌呤 2.5mg。

26、、 奈乙酸0.18mg、 蔗糖30g、 琼脂6g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 不定芽增殖培养条件 为： 培养温度272， 光照强度2300lx， 光照时间14h/d， 增殖培养的时间为45d。 0052 (4)生根壮苗： 切下步骤(3)中苗高46cm的单个丛生芽， 并将其接种到生根壮苗 培养基中进行生根培养， 以形成完整植株的生根苗； 所述生根壮苗培养基： 每升含有奈乙酸 0.8mg、 蔗糖30g、 琼脂6g， 余量为MS培养基， pH值为5.8。 生根壮苗培养的条件为： 温度272 ， 光照强度2300lx， 光照时间14h/d， 生根壮苗培养的时间为30d。 0053 (5)炼。

27、苗移栽： 将步骤(4)中培养高68cm的生根苗， 洗净根部培养基， 经消毒后将 生根苗移栽至栽培基质中， 正常培养管理即可获得皱叶山姜种苗。 所述栽培基质为将细砂、 说 明 书 4/5 页 6 CN 108668900 A 6 珍珠岩和泥炭土以重量比2： 2： 3混匀得到的混合物； 所述消毒是使用质量分数0.3百菌清 溶液浸泡40min； 生根苗移栽至栽培基质后， 进行遮阴培养， 培养温度27， 空气相对湿度为 75。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108668900 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 108668900 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 108668900 A 9 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 108668900 A 10 。