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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510750174.4 (22)申请日 2015.11.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105248283 A (43)申请公布日 2016.01.20 (73)专利权人 河南师范大学 地址 453007 河南省新乡市牧野区建设东 路46号 (72)发明人 赵喜亭 李金亭 陈明霞 李俊华 蒋丽薇 李明军 (74)专利代理机构 新乡市平原专利有限责任公 司 41107 代理人 路宽 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) 审查员 冀。
2、敏 (54)发明名称 一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法 (57)摘要 本发明公开了一种调控盾叶薯蓣三倍体植 株生根的方法， 其特征在于具体步骤为： 选取生 长健壮的盾叶薯蓣三倍体再生芽， 在超净工作台 上切成2-3cm长的带芽茎段， 接种到培养基中， 该 培养基包括1/2MS+0.3mg/L NAA+0.24-0.96mg/L 蜕皮甾酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L琼脂粉， 培 养基pH值为5.8-6.0， 在无菌条件下进行培养， 培 养条件为： 温度22-24， 光/暗=16h/8h， 相对湿 度80%-90%， 光照强度2000-3000Lx。 本发明对盾 叶薯蓣三倍体植株。
3、生根的促进作用显著， 具体表 现为缩短开始生根时间的同时， 平均根长和平均 生根数显著增加、 移栽成活率也显著提高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105248283 B 2018.04.13 CN 105248283 B 1.一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法， 其特征在于具体步骤为： 选取生长健壮 的盾叶薯蓣三倍体再生芽， 在超净工作台上切成2-3cm长的带芽茎段， 接种到培养基中， 该 培养基包括1/2MS+0.3mg/L NAA+0.48mg/L -蜕皮甾酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L琼脂粉， 培养基pH值为5.8-6.0， 在无菌条件下进行培养， 培养条件为： 温。
4、度22-24， 光/暗=16h/8h， 相对湿度80%-90%， 光照强度2000-3000Lx。 2.根据权利要求1所述的调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法， 其特征在于： 所述的蜕 皮甾酮是从药用植物怀牛膝、 川牛膝、 桑叶、 白毛夏枯草、 泽泻、 罗汉松、 紫杉、 乌毛蕨或紫箕 中提取的。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105248283 B 2 一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法 技术领域 0001 本发明属于植物三倍体植株生根方法技术领域， 具体涉及一种调控盾叶薯蓣三倍 体植株生根的方法。 背景技术 0002 盾叶薯蓣 （Dioscorea Zingiberensis C。
5、.H. Wright） 是薯蓣科薯蓣属多年生草本 植物， 俗称黄姜， 以干燥根茎入药， 根茎中10%左右为薯蓣皂苷 （含量最高为16.5%） （秦松云, 丁季春, 舒抒, 余再柏, 李泉森. 中国盾叶薯蓣资源现状及保护对策. 资源开发与市场, 2004, 20, 263-265. ） ， 是世界上皂苷元含量最高的植物。 薯蓣皂苷元具有降血脂、 抗衰老、 抗肿瘤、 治疗骨质疏松、 保护肝脏、 抗糖尿病和消炎等功能。 0003 多倍体基因的剂量效应， 可以使其营养器官变大， 有效成分增加， 抗逆性增强等， 所以药用植物多倍体育种已成为一条很好的优良品种选育的有效途径。 三倍体育种是以营 养器官为药。
6、用部位的植物多倍体育种的一种有效途径。 因为它不仅具有多倍体植株所具有 的优良性状， 而且还因其减数分裂行为异常而多败育， 降低了植物的生殖能耗， 有利于营养 生长和有效成分的积累 （Lewis WH (鲍文奎等译) 多倍体在植物和动物中的地位 贵阳： 贵 州人民出版社， 1984： 293-294） 。 0004 近年来， 对盾叶薯蓣的研究主要集中在有效成分的提取和药理的研究等。 含有皂 苷元的药物逐渐被开发， 在临床上的应用越来越广泛。 然而由于人们对于盾叶薯蓣资源不 合理的开发与利用， 导致其生产能力满足不了市场的需求， 因此运用组织培养技术开发出 新品种有望解决产量和质量问题， 其中利。
7、用胚乳培养的方法获得三倍体植株， 能够有效的 改善盾叶薯蓣品质、 提高盾叶薯蓣的产量及有效成分含量， 具有十分重要的现实意义。 前期 我们研究室通过盾叶薯蓣的胚乳培养诱导出了愈伤组织， 并从愈伤组织分化了再生芽， 采 用李懋学和张杶方 （李懋学, 张杶方. 植物染色体研究技术. 哈尔滨: 东北林业大学出版 社. 1991, 6-48） 方法对再生芽的腋芽生长点进行鉴定获得了三倍体再生芽， 获得的三倍 体再生芽很难生根， 在培养基上茎基部膨大， 时间长了茎芽枯黄。 采用1/2MS + 0.3 mg/ LNAA能够使生根率达到90%， 但生根所需时间较长， 培养15天后才有明显的根长出， 45天后。
8、 才能达到移栽状态， 移栽成活率仅为80%。 为了使其快速生根， 根数增多， 根长增加， 移栽成 活率升高， 我们对其生根促进剂进行了研究探索。 0005 蜕皮甾酮 （ecdysterone， EDS） 即 -蜕皮甾酮， 1954年， Butenandt等从500kg蚕蛹中 分离出250mg最初的昆虫变态活性物质蜕皮酮 （ecdysone） 。 此后， 在许多种植物中分离出多 种类似的物质。 人们发现， 蜕皮激素在植物界的分布不仅较动物界高， 而且广， 资源丰富， 如 怀牛膝、 川牛膝、 桑叶、 白毛夏枯草、 泽泻、 罗汉松、 紫杉、 乌毛蕨及紫箕等药用植物中均含有 其类似物， 涉及到低等植物。
9、厥类、 裸子植物、 被子植物等80个科的植物类群中。 动物实验表 明EDS能促进核酸及蛋白质合成、 调节糖代谢、 促进脂肪代谢、 调节基因表达、 改善免疫功 能、 影响中枢神经及心血管系统和促进细胞增殖、 分化等， 因此被认为有 “更生诱导物质 （revive inducer） ” 的作用。 蜕皮甾酮易溶于乙醇， 用乙醇很容易将其提取。 研究发现牛膝 说 明 书 1/4 页 3 CN 105248283 B 3 的醇提物以及醇提物的乙酸乙酯萃取物 （主要成分为EDS） 对成骨样细胞有显著的促进增殖 作用 （高晓燕, 王大为, 李发美, 姜志. 牛膝提取物对成骨样细胞增殖的作用. 2000a， 。
10、17 (3): 201-213， 高晓燕, 王大为, 李发美. 牛膝中脱皮甾酮的含量测定及促成骨样细胞增 殖活性. 药学学报， 2000b, 35(11): 868-870） ， 在人表皮干细胞增殖过程中也有显著促进 作用， 是促进创面愈合的主要机制 （李国芳. 蜕皮甾酮促进人表皮干细胞增殖的初步研究 D， 广州： 南方医科大学， 2009） 。 也有研究发现， DES可促进人脐静脉血管内皮细胞 （HUVEC） 由静止期和 （或） DNA合成前期进入DNA合成期、 由DNA合成期进入DNA合成后期和 （或） 分裂 期， 对HUVEC增殖具有促进作用 （吴旭. 蜕皮甾酮的内皮保护作用及其机理研究。
11、D， 广州： 第一军医大学， 2006） 。 0006 通过对近五十年有关EDS的研究报道的总结发现， 相关研究主要集中在分离鉴定、 化学结构和对动物的作用及其机制， 另外在不同植物中的分布、 积累和测定方法等方面的 研究也较多， 而对植物本身的作用方面尚未见报道。 缘于EDS在动物上有促进细胞增殖、 分 化等的作用， 本研究将其运用到盾叶薯蓣三倍体植株生根上， 以期找到一种调控盾叶薯蓣 三倍体植株快速生根的有效方法。 发明内容 0007 本发明解决的技术问题是提供了一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法， 所建 立的盾叶薯蓣三倍体植株生根方法不仅生根快而且生根率高， 根数较多， 根长较长， 同。
12、时对 地上部分生长也有明显的促进作用， 易于移栽成活， 移栽成活率高达100%。 0008 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案， 一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生 根的方法， 其特征在于具体步骤为： 选取生长健壮的盾叶薯蓣三倍体再生芽， 在超净工作台 上切成2-3cm长的带芽茎段， 接种到培养基中， 该培养基包括1/2MS+0.3mg/L NAA+0.24- 0.96mg/L蜕皮甾酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L琼脂粉， 培养基pH值为5.8-6.0， 在无菌条件 下进行培养， 培养条件为： 温度22-24， 光/暗=16h/8h， 相对湿度80%-90%， 光照强度2000- 。
13、3000Lx。 0009 进一步优选， 所述的培养基包括1/2MS+0 .3mg/L NAA+0 .48mg/L蜕皮甾酮+ 30000mg/L蔗糖+7500g/L琼脂粉。 0010 进一步优选， 所述的蜕皮甾酮是从药用植物怀牛膝、 川牛膝、 桑叶、 白毛夏枯草、 泽 泻、 罗汉松、 紫杉、 乌毛蕨或紫箕中提取的。 0011 本发明与现有技术相比较， 对盾叶薯蓣三倍体植株生根的促进作用显著， 具体表 现为缩短开始生根时间的同时， 平均根长和平均生根数显著增加、 移栽成活率也显著提高。 本发明中蜕皮甾酮来源于植物， 存在于80个科的植物类群中， 并且易于提取、 定量。 因此具 有广阔的应用前景。 。
14、具体实施方式 0012 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明， 但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例， 凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。 说 明 书 2/4 页 4 CN 105248283 B 4 实施例 0013 材料和方法 0014 1.1 材料 0015 供试材料为进行过染色体数目、 形态学、 细胞学、 生理生化、 同工酶鉴定的盾叶薯 蓣三倍体再生植株。 0016 1. 2 方法 0017 生根实验： 超净工作台上， 将盾叶薯蓣三倍体再生植株切成2-3cm长的带芽茎段， 接种到1/2MS+0.3mg/L NAA+0.24-0.96m。
15、g/L蜕皮甾酮+30000g/L蔗糖+7500g/L琼脂粉的培 养基中， 培养基pH值为5.8-6.0， 无菌条件下进行培养， 蜕皮甾酮的浓度分别设置为0.24、 0.48、 0.72、 0.96mg/L， 以不添加蜕皮甾酮的培养基为对照。 培养条件为： 温度22-24， 光/ 暗=18h/6h， 相对湿度80%-90%， 光照强度2000-3000Lx。 0018 每种培养基20瓶， 每瓶接种4株， 每4瓶为一个重复。 观察开始生根时间， 即有明显 根开始长出的时间。 培养30天后， 统计生根率、 根数、 根长等。 0019 移栽实验： 待生根培养至30天后， 用自来水冲洗去根部培养基， 水。
16、培2-3天， 移栽到 m （泥炭土） ： m （蛭石） 为1:1的基质中， 正常管理。 在温室中培养30天后， 统计成活率。 0020 1. 3 数据处理 0021 数据处理用SPSS13.0。 采用 “Duncan” 法进行平均数多重比较。 0022 实验结果 0023 不同浓度蜕皮甾酮处理对盾叶薯蓣三倍体植株生根及移栽成活率的影响见表1。 0024 表1 不同浓度的蜕皮甾酮溶液对盾叶薯蓣三倍体植株生根及移栽成活率的影响 （30天） 0025 0026 注： 同一列数据后不同小写字母表示表示在P0.05水平上达到显著差异。 0027 由表1可以看出： 与对照号培养基相比， 添加0.24-0.。
17、96mg/L蜕皮甾酮都促进了 说 明 书 3/4 页 5 CN 105248283 B 5 盾叶薯蓣三倍体植株的生根， 具体体现在： 开始生根时间提前， 最多可提前5天； 生根率显著 提高， 最高可达100%， 每个茎段平均根数增加， 最多可达大约26条， 其中1cm根 （对移栽成 活非常重要） 所占比率也大幅提高， 最高达85%。 0028 由表1还可以看出， 与对照号培养基相比， 添加0.24-0.96mg/L蜕皮甾酮也促进 了盾叶薯蓣三倍体植株地上部分的生长， 具体表现在： 显著增加了株高， 最大株高3.92cm； 显著增加单株叶片数， 叶片数最多为4.85个。 0029 添加蜕皮甾酮对盾叶薯蓣三倍体植株生根和地上部分生长的的促进作用也显著 影响了其移栽成活， 使其移栽成活率大幅提高， 最高可达100%。 这对于其规模化生产具有重 要意义。 0030 以上实施例描述了本发明的基本原理、 主要特征及优点， 本行业的技术人员应该 了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理， 在不脱离本发明原理的范围下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105248283 B 6 。