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1、(10)授权公告号 CN 101731144 B (45)授权公告日 2012.07.18 CN 101731144 B *CN101731144B* (21)申请号 200810225940.5 (22)申请日 2008.11.07 A01H 4/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (73)专利权人 中国科学院遗传与发育生物学研 究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路中国科学 院遗传与发育生物学研究所 (72)发明人 鹿金颖 潘毅 阚晟 沈前华 刘敏 (74)专利代理机构 北京思创毕升专利事务所 11218 代理人 刘明华 CN 101189956 A,200。
2、8.06.04, 全文 . 赵玉萍 . “试管番茄” . 种子世界 .1992,( 第 4 期 ), 第 40 页 . 姚宗国等 .“五彩番茄试管内外快繁技术的 研究” .北方园艺 .2002,( 第 5 期 ), 第 64-66 页 . (54) 发明名称 一种在试管中进行番茄组织培养的方法 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 是涉及一种番茄 组织培养方法使用的诱导、 分化、 生根培养基， 利 用该培养基番茄实现在试管中开花结果的方法。 所述方法包括番茄诱导愈伤组织培养步骤、 分化 成苗步骤、 生根， 花芽分化， 开花结果步骤 ； 所述 方法的整个过程均在试管中完成 ； 即本方法不仅 。
3、能在试管中使番茄分化增殖， 而且还在试管中开 花结实。 本发明完善了番茄组织培养的技术， 即不 仅能在试管中使番茄分化增殖， 而且还可以在试 管中开花结实， 由于在试管中培育的技术较难， 该 项发明体现了组织培养的高水平。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 苏聃 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种在试管中进行番茄组织培养的方法， 其特征在于 ； 所述方法包括番茄诱导愈伤组织培养步骤， 分化幼茎步骤， 培育生根和开花结果步 骤 ； 所述方法的整个过程均在试管中完。
4、成， 即本方法不仅能在试管中使番茄分化增殖， 而 且还在试管中完成开花结实的组培过程 ； 番茄组织培养方法包括如下步骤 ： (1) 所述的番茄诱导愈伤组织培养步骤为 ： 取番茄幼嫩叶片， 用自来水彻底冲洗后放 在 1 -10的吐温 -20 中停留 2-10 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 3-4 次， 然后用 0.1升汞 (HgCl2) 溶液表面灭菌 2-10 分钟， 再用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 4-5 次 ； 叶 片组织剪成大小面积范围为 1mm1mm 10mm10mm 作为外植体， 接种到 MS 基本培养基 +6- 苄氨基腺嘌呤 (6-BA)0.1-10mgL-1+ 吲哚乙酸 (IA。
5、A)0.01-1mgL-1+ 琼脂 4-10gL-1+ 蔗糖 20-50g 的培养基中， 诱导愈伤 ； (2) 所述的分化幼茎步骤为 ： 将愈伤组织转到 MS 基本培养基， 将愈伤组织分化为幼 茎 ； (3) 培 育 生 根， 开 花 结 果 步 骤 为 ： 将 幼 茎 接 种 到 MS 基 本 培 养 基 + 吲 哚 丁 酸 IBA0.1-10mgL-1+ 琼脂 4-10gL-1+ 蔗糖 20-50g 的培养基中， 其 pH 值为 5.0-6.7， 控制组织培 养室培养温度为 23-25， 光照为白色荧光， 光强度定为 65E/m2/s， 在 12-20 小时的光周 期， 12-4 小时的暗。
6、周期中完成生根、 开花结果。 2. 根据权利要求 1 所述的一种在试管中进行番茄组织培养的方法， 其特征在于 ： 在所述的 (1) 番茄诱导愈伤组织培养步骤中 ： 所述的用自来水彻底冲洗后放在 5的 吐温 -20 中停留时间为 5 分钟 ； 用 0.1升汞 (HgCl2) 溶液表面灭菌时间为 4 分钟 ； 所述的 叶片组织剪成大小范围为 5mm5mm 左右作为外植体， 接种到培养基 MS 基本培养基 +6- 苄 氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL-1+吲哚乙酸(IAA)0.2mgL-1+琼脂6gL-1+蔗糖30g的培养基中， 诱导 愈伤 ； 在所述的 (3) 培育生根， 开花结果步骤中的幼茎接种的。
7、培养基为 MS 基本培养基 + 吲哚 丁酸 IBA1mgL-1+ 琼脂 8gL-1+ 蔗糖 30g ； 所述的 pH 值为 5.8 ； 所述的组织培养室培养温度为 23-25， 所述的光照为白色荧光， 光强定为65E/m2/s， 所述的光周期为16小时， 所述的暗 周期 8 小时。 权 利 要 求 书 CN 101731144 B 2 1/3 页 3 一种在试管中进行番茄组织培养的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 是涉及一种番茄组织培养方法使用的诱导、 分化、 生根 培养基， 利用该培养基番茄实现在试管中开花结果的方法。 背景技术 0002 番茄属于茄科、 番茄属、 番茄种(。
8、拉丁文名称Lycopersicon esculantumMill)。 番 茄是一种重要的经济作物， 是世界范围内分布广、 消费多的主要蔬菜， 同时番茄又是生物科 学研究中的一种重要实验材料， 是研究果实发育和成熟的模式植物。通过组织培养方法实 现番茄在试管中开花结果， 可以为番茄生物科学研究提供一个新的方法。为进一步探索植 物开花结果的原理机制， 提供理论依据， 也可以为园艺植物的微型培养提供新的途径。 。 0003 现有技术中的番茄组织培养方法主要用于优良品种的快繁和番茄转基因中的生 物技术的基本操作， 但是没有番茄在试管中开花结果的组织培养方法的研发， 因为番茄在 试管内开花结果不同于土壤。
9、中开花结果， 因为试管中是一个相对密闭的人为控制的微环 境， 难点在于对于光照、 温度的控制和培养基中的营养成分和激素配比， 以达到满足番茄能 在试管内开花结果的需求。 常规的番茄组织培养主要是为了调节番茄组织的分化增殖能力 以提高番茄试管苗的繁殖系数， 或者是为了转基因实验的需要进行调控， 当番茄试管苗分 化后就转到生根培养基中， 生根后就移栽至土壤中。本发明人是在番茄组织培养成熟技术 的基础上， 对培养基中激素种类和浓度、 营养成分进行了改进。 该发明中的激素调节主要为 了番茄试管苗在试管中实现由营养生长向生殖生长转化达到开花结实的目的， 因此在激素 的种类和浓度以及营养成分与常规的番茄组。
10、织培养是大不相同的。 由于试管内开花结实不 受季节限制， 可以随时诱导， 组培试管成花具有成花率高、 重复性好、 技术稳定等优点， 因此 可被大量用于成花结实研究。 发明内容 0004 本发明为了填补现有技术中组织培养方法实现番茄在试管中开花结果的方法的 空白， 发明了一种在试管中进行番茄组织培养的方法， 实现了番茄试管苗在试管中由营养 生长向生殖生长转化达到开花结实的效果和目的。 0005 本发明的内容为 ： 0006 一种在试管中进行番茄组织培养的方法， 所述方法包括番茄诱导愈伤组织培养步 骤， 分化幼茎步骤， 培育生根和开花结果步骤 ； 所述方法的整个过程均在试管中完成， 即本 方法不仅。
11、能在试管中使番茄分化增殖， 而且还在试管中完成开花结实的组培过程。 0007 在实际的组培中， 在试管中进行番茄组织培养的步骤为 ： 0008 (1) 所述的番茄诱导愈伤组织培养步骤为 ： 取番茄幼嫩叶片， 用自来水彻底冲洗 后放在 1 -10的吐温 -20 中停留 2-10 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 3-4 次， 然后 用 0.1升汞 (HgCl2) 溶液表面灭菌 2-10 分钟， 再用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 4-5 次 ； 叶片组织剪成大小面积范围为 1mm1mm 10mm10mm 作为外植体， 接种到 MS 基本培养基 说 明 书 CN 101731144 B 3 2/3 页。
12、 4 +6- 苄氨基腺嘌呤 (6-BA)0.1-10mgL-1+ 吲哚乙酸 (IAA)0.01-1mgL-1+ 琼脂 4-10g L-1+ 蔗糖 20-50g 的培养基中， 诱导愈伤 ； 0009 (2) 所述的分化幼茎步骤为 ： 将愈伤组织转到 MS 基本培养基， 将愈伤组织分化为 幼茎 ； 0010 (3) 培育生根， 开花结果步骤为 ： 将幼茎接种到 MS 基本培养基 + 吲哚丁酸 IBA0.1-10mgL-1+琼脂4-10g L-1+蔗糖20-50g的基质中， 其pH值为5.0-6.7， 控制组织培养 室培养温度为 23-25， 光照为白色荧光， 光强度定为 65E/m2/s， 在 1。
13、2-20 小时的光周期， 12-4 小时的暗周期中完成生根、 开花结果。 0011 在具体的实践中， 所述在试管中进行番茄组织培养的步骤为 ： 0012 在所述的 (1) 番茄诱导愈伤组织培养步骤中 ： 所述的用自来水彻底冲洗后放在 5的吐温 -20 中停留时间为 5 分钟 ； 用 0.1升汞 (HgCl2) 溶液表面灭菌时间为 4 分钟 ； 所述的叶片组织剪成大小范围为 5mm5mm 左右作为外植体， 接种到培养基 MS 基本培养基 +6- 苄氨基腺嘌呤 (6-BA)2mgL-1+ 吲哚乙酸 (IAA)0.2mgL-1+ 琼脂 6g L-1+ 蔗糖 30g 的培养基 中， 诱导愈伤 ； 00。
14、13 在所述的 (3) 培育生根， 开花结果步骤中的幼茎接种的培养基为 MS 基本培养基 + 吲哚丁酸 IBAlmgL-1+ 琼脂 8g L-1+ 蔗糖 30g ； 所述的 pH 值为 5.8 ； 所述的组织培养室培养温 度为 23-25， 所述的光照为白色荧光， 光强定为 65E/m2/s， 所述的光周期为 16 小时， 所 述的暗周期 8 小时。 0014 本发明完善了番茄组织培养的技术， 即不仅能在试管中使番茄分化增殖， 而且还 可以在试管中开花结实， 由于在试管中培育的技术较难， 目前世界上在试管中能够开花结 实的植物种类很少， 该项发明体现了组织培养的较高水平。 0015 实施例 0。
15、016 实例 1 0017 将番茄品种 MicroTom 田间生长的叶片作为外植体， 自来水下彻底冲洗， 然后放在 5的吐温 -20 中 5 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 3-4 次， 0.1升汞 (HgCl2) 表面灭 菌 4 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 4-5 次。 0018 叶片组织剪成大小为 5mm5mm 左右作为外植体， 接种到培养基 ： MS 基本培养基 +6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL-1+吲哚乙酸(IAA)0.2mgL-1+琼脂6g L-1+蔗糖30g， 诱导愈伤 25-30 天。 0019 将愈伤转到MS基本培养基， 培养7-10天， 愈伤组织分化为幼茎。。
16、 将幼茎接种到MS 基本培养基 + 吲哚丁酸 (IBA)1mgL-1+ 琼脂 8g L-1+ 蔗糖 30g， pH 值 5.8， 组织培养室培养温 度 23-25， 白色荧光光强 65E/m2/s， 16 小时的光周期， 8 小时的暗周期。7 天后生根、 形 成花蕾， 15 天开花， 30 天果实转色， 45 天果实成熟。 0020 实例 2 0021 将番茄品种 Bener Best 田间生长的叶片作为外植体， 自来水下彻底冲洗， 然后放 在 5的吐温 -20 中 5 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗 3-4 次， 0.1升汞 (HgCl2) 表面 灭菌 4 分钟， 用高温高压灭菌的蒸馏水。
17、漂洗 4-5 次。 0022 叶片组织剪成大小为 5mm5mm 左右作为外植体， 接种到培养基 MS 基本培养基 +6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL-1+吲哚乙酸(IAA)0.2mgL-1+琼脂6g L-1+蔗糖30g， 诱导愈伤 说 明 书 CN 101731144 B 4 3/3 页 5 25-30 天。 0023 将愈伤转到 MS 基本培养基， 培养 14-20 天， 愈伤组织分化为幼茎。将幼茎接种到 MS 基本培养基 + 吲哚丁酸 (IBA)1mgL-1+ 琼脂 8g L-1+ 蔗糖 30g， pH 值 5.8， 组织培养室培养 温度 23-25， 光照为白色荧光， 光强 65E/m2/s， 16 小时的光周期， 8 小时的暗周期。7 天 后生根、 14 天形成花蕾， 20 天开花， 40 天果实转色， 60 天果实成熟。 说 明 书 CN 101731144 B 5 。