一种四倍体金线莲的培育方法.pdf

《一种四倍体金线莲的培育方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种四倍体金线莲的培育方法.pdf（6页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 104082123 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104082123 A (21)申请号 201410297284.5 (22)申请日 2014.06.28 A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 玉林师范学院 地址 537000 广西壮族自治区玉林市教育中 路 299 号玉林师范学院 (72)发明人 梁钧淞 莫昭展 甘耀坤 梁林英 梁晓菊 潘洁明 严翠琼 张燕飞 吴凤娟 (74)专利代理机构 玉林市振盛专利商标代理事 务所 45109 代理人 吴安仪 (54) 发明名称 一种四倍体金线莲的培育。

2、方法 (57) 摘要 一种四倍体金线莲的培育方法， 本发明包括 金线莲 （Anoectochilusroxburghii）人工授粉、 非共生萌发、 诱变剂处理、 壮苗培养和试管苗移栽 等各阶段。 金线莲开花后采取人工方法授粉， 将成 熟的金线莲蒴果经消毒后切开把种胚接种到萌发 培养基上培养形成原球茎， 然后转入含有诱变剂 的液体分化培养基进行诱变处理， 再接种到壮苗 培养基进行壮苗培养， 最后进行试管苗移栽。 本发 明简单易行， 诱变频率达到 75% 以上， 同时也可大 幅度提高金线莲的药材产量， 为金线莲多倍体育 种、 遗传改良和新品种培育开辟了一条新途径。 (51)Int.Cl. 权利要求。

3、书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104082123 A CN 104082123 A 1/1 页 2 1. 一种四倍体金线莲的培育方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 人工授粉 ： 按常规方法进行栽培管理， 选定株系优良的金线莲植株作为亲本， 在金 线莲开花后进行异花授粉 ; （2） 非共生萌发 ： 在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时， 经 75% 80% 的酒精溶 液消毒 2 5 分钟后， 用无菌水冲洗 2 5 次后置于 0.1% 升汞溶液消毒 8 15 分钟， 经无 菌水。

4、冲洗25次后用无菌滤纸吸干， 然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接 种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养， 培养 20 30 天后种子萌发成原球茎 ; （3） 诱变剂处理 ： 将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基中， 在 25 28条件下进行间歇振荡诱变处理 240 480 小时 ; （4） 壮苗培养 ： 将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养， 进一步形成 5 8cm 高的带根小苗 ; （5） 试管苗移栽 ： 将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗 5 7 天后， 将试管苗从培 养瓶中取出， 洗掉根部培养基， 栽入由泥炭土和松树皮 （1 ： 3） 混合成。

5、的基质中并按常规的 二倍体金线莲进行大田栽培管理 ; 上述 （2） （4） 各步骤中的培养条件均为 ： 培养温度 25 30， 每天光照 10 15 小 时， 光照强度 1500 2000lx。 2. 根据权利要求 1 所述的一种四倍体金线莲的培育方法， 其特征在于步骤 （2） 所述 的萌发培养基为 ： 0.5 2.0g/L 花宝 1 号 +0.2 2.0g/L 蛋白胨 +100 200ml/L 椰子汁 +20 35g/L 蔗糖 +3.0 7.0g/L 琼脂 +0.3 1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物 成分， pH 为 5.4 5.8。 3. 根据权利要求 1 所述的一种四。

6、倍体金线莲的培育方法， 其特征在于步骤 （3） 所述 的液体分化培养基为 ： 1/2MS+0.2 1.2mg/L 6-BA+0.1 0.6mg/L NAA+20 35g/L 蔗糖 +0.22.0g/L蛋白胨+0.10.5g/L酸性水解酪蛋白+0.31.0g/L活性炭， pH为5.4 5.8。 4. 根据权利要求 1 所述的一种四倍体金线莲的培育方法， 其特征在于步骤 （3） 所述的 诱变剂为 0.01% 0.05% 秋水仙碱 （olchicine） +0.01% 0.03% 氟乐灵 （trifluralin） 的 混合液。 5. 根据权利要求 1 所述的一种四倍体金线莲的培育方法， 其特征在于。

7、步骤 （4） 所述的 壮苗培养基为 ： 0.52.0g/L花宝1号+0.52.0g/L花宝2号+0.51.5mg/LNAA+0.2 2.0g/L 蛋白胨 +0.1 0.5g/L 酸性水解酪蛋白 +20 35g/L 蔗糖 +3.0 7.0g/L 琼脂 +0.3 1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.4 5.8。 6. 根据权利要求 1 所述的一种四倍体金线莲的培育方法， 其特征在于步骤 （5） 所述的 试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为 2n=80 的试管苗。 权 利 要 求 书 CN 104082123 A 2 1/4 页 3 一种四倍体金线莲的培育方法。

8、 技术领域 0001 本发明涉及植物新品种的培育方法， 具体地说， 涉及一种四倍体金线莲的培育方 法。 背景技术 0002 金线莲 （Anoectochilus roxburghii） ， 即花叶开唇兰， 别名金线莲、 金石松、 虎头 蕉、 鸟人参等， 为兰科开唇兰属珍稀药用植物。金线莲是我国传统珍贵药材， 由于其治疗面 广、 疗效独特， 有 “神药” 之称， 享有 “药王” 等美誉。 0003 染色体是决定生物个体性状基因的载体， 染色体加倍以后的植株与亲本之间会产 生形态及性状上的变化， 其中巨大性是多倍体最为显著的外部形态特征。 与此同时， 植物染 色体倍性的变化也往往会导致次生代谢产物。

9、含量变化。 中药材是一类具有特殊用途的经济 植物， 一般以其根、 茎、 叶等器官为收获对象。 多倍体植物中的染色体加倍， 往往表现出植株 的巨大性， 能较好地满足中药生产的需求。 金线莲植株矮小、 生长慢、 生境苛刻， 若能将其培 育为多倍体并固定下来， 则可能提高其药用价值， 同时为选育优质金线莲提供珍贵的原始 材料。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种四倍体金线莲的培育方法， 通过人工授粉、 非共生萌 发、 诱变剂处理、 壮苗培养和试管苗移栽等各阶段， 以秋水仙碱和氟乐灵混合液作为多倍体 诱变剂处理金线莲类原球茎， 提高了诱变率， 处理一次即可获得数量可观的四倍体金线莲， 从而实。

10、现了本发明的目的。 0005 本发明的一种四倍体金线莲的培育方法， 包括以下的步骤 ： （1） 人工授粉 ： 按常规方法进行栽培管理， 选定株系优良的金线莲植株作为亲本， 在金 线莲开花后进行异花授粉。 0006 （2） 非共生萌发 ： 在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时， 经 75% 80% 的酒 精溶液消毒 2 5 分钟后， 用无菌水冲洗 2 5 次后置于 0.1% 升汞溶液消毒 8 15 分钟， 经无菌水冲洗25次后用无菌滤纸吸干， 然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养， 培养 20 30 天后种子萌发成原球茎。 0007 （3） 诱变。

11、剂处理 ： 将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基 中， 在 25 28条件下进行间歇振荡诱变处理 240 480 小时。 0008 （4） 壮苗培养 ： 将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养， 进一步形 成 5 8cm 高的带根小苗。 0009 （5） 试管苗移栽 ： 将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗 5 7 天后， 将试管苗 从培养瓶中取出， 洗掉根部培养基， 栽入由泥炭土和松树皮 （1 ： 3） 混合成的基质中并按常 规的二倍体金线莲进行大田栽培管理。 0010 上述 （2） （4） 各步骤中的培养条件均为 ： 培养温度 25 30， 每天光照 10 说 。

12、明 书 CN 104082123 A 3 2/4 页 4 15 小时， 光照强度 1500 2000lx。 0011 上述步骤 （2） 所述的萌发培养基为 ： 0.5 2.0g/L 花宝 1 号 +0.2 2.0g/L 蛋白 胨 +100 200ml/L 椰子汁 +20 35g/L 蔗糖 +3.0 7.0g/L 琼脂 +0.3 1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.4 5.8 ； 上述步骤 （3） 所述的液体分化培养基为 ： 1/2MS+0.2 1.2mg/L 6-BA+0.1 0.6mg/L NAA+2035g/L蔗糖+0.22.0g/L蛋白胨+0.10.。

13、5g/L酸性水解酪蛋白+0.31.0g/ L 活性炭， pH 为 5.4 5.8 ； 上述步骤 （3） 所述的诱变剂为 0.01% 0.05% 秋水仙碱 （olchicine） +0.01% 0.03% 氟乐灵 （trifluralin） 的混合液 ; 上述步骤 （4） 所述的壮苗培养基为 ： 0.5 2.0g/L 花宝 1 号 +0.5 2.0g/L 花宝 2 号 +0.5 1.5mg/LNAA+0.2 2.0g/L 蛋白胨 +0.1 0.5g/L 酸性水解酪蛋白 +20 35g/L 蔗 糖+3.07.0g/L琼脂+0.31.0g/L活性炭， 其余为MS培养基的有机物成分， pH为5.4 5。

14、.8 ； 上述步骤 （5） 所述的试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为 2n=80 的试管苗。 0012 本发明具有的特点 , 目前国内关于金线莲多倍体离体诱导有少量报道， 但技术还 不够成熟， 而本发明具有简单、 易行、 诱变率高的特点。本发明处理一次即可获得数量可观 的四倍体金线莲， 可以为金线莲遗传育种提供亲本材料， 也为金线莲的新品种培育提供新 的思路。 具体实施方式 0013 以下实施例是对本发明的进一步说明， 不是对本发明的限制。 0014 实施例 1 1、 品种来源 福建产组培苗经大田栽培 2 年后的优质金线莲 ； 2、 培育过程 （1） 人工授粉 ： 按常规方法进行栽培管理，。

15、 金线莲开花进行异花授粉后 120 天蒴果成 熟。 0015 （2） 非共生萌发 ： 在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时， 经 75% 的酒精溶液消毒 3分钟后， 用无菌水冲洗2次后置于0.1%升汞溶液消毒8分钟， 经无菌水冲洗2次后用无菌 滤纸吸干， 然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接种针将黄色种胚接种到萌 发培养基上培养， 培养 23 天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为 ： 1.5g/L 花宝 1 号 +1.0g/L 蛋白胨 +200ml/L 椰子汁 +25g/L 蔗糖 +4.5g/L 琼脂 +0.5g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.。

16、6。 0016 （3） 诱变剂处理 ： 将非共生萌发开成的原球茎转入含有0.02%秋水仙碱和0.01%氟 乐灵混合液的液体分化培养基中， 在 28条件下进行间歇振荡诱变处理 240 小时， 经染色 体计数， 四倍体诱导率为 72%。所采用的液体分化培养基为 ： 1/2MS+1.2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+25g/L 蔗糖 +1.0g/L 蛋白胨 +0.5g/L 酸性水解酪蛋白 +0.3g/L 活性炭， pH 为 5.6。 0017 （4） 壮苗培养 ： 将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养， 进一步形 成 5 8cm 高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为 ： 1.0。

17、g/L 花宝 1 号 +1.0g/L 花宝 2 号 说 明 书 CN 104082123 A 4 3/4 页 5 +0.5mg/LNAA+2.0g/L 蛋白胨 +0.5g/L 酸性水解酪蛋白 +35g/L 蔗糖 +3.0g/L 琼脂 +1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.6. （5） 试管苗移栽 ： 将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗 5 天后， 将试管苗从培养瓶 中取出， 洗掉根部培养基， 栽入由泥炭土和松树皮 （1 ： 3） 混合成的基质中并按常规的二倍 体金线莲进行大田栽培管理， 四倍体金线莲成活率达 92%。 0018 上述 （2） （4） 各步。

18、骤中的培养条件均为 ： 培养温度 28， 每天光照 13 小时， 光照 强度 1500lx。 0019 实施例二 1、 品种来源 台湾产组培苗经大田栽培 1 年后的优质金线莲 ； 2、 培育过程 （1） 人工授粉 ： 按常规方法进行栽培管理， 金线莲开花进行异花授粉后 110 天蒴果成 熟。 0020 （2） 非共生萌发 ： 在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时， 经 78% 的酒精溶液消毒 2 分钟后， 用无菌水冲洗 5 次后置于 0.1% 升汞溶液消毒 10 分钟， 经无菌水冲洗 3 次后用无 菌滤纸吸干， 然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接种针将黄色种胚接种到 萌发培养基上培。

19、养， 培养 25 天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为 ： 1.0g/L 花宝 1 号 +2.0g/L 蛋白胨 +100ml/L 椰子汁 +25g/L 蔗糖 +6.0g/L 琼脂 +0.3g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.8。 0021 （3） 诱变剂处理 ： 将非共生萌发开成的原球茎转入含有0.01%秋水仙碱和0.03%氟 乐灵混合液的液体分化培养基中， 在 25条件下进行间歇振荡诱变处理 360 小时， 经染色 体计数， 四倍体诱导率为 74%。所采用的液体分化培养基为 ： 1/2MS+0.4mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25g/L 蔗。

20、糖 +2.0g/L 蛋白胨 +0.5g/L 酸性水解酪蛋白 +0.5g/L 活性炭， pH 为 5.8。 0022 （4） 壮苗培养 ： 将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养， 进一步形 成 5 8cm 高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为 ： 1.5g/L 花宝 1 号 +1.0g/L 花宝 2 号 +1.5mg/LNAA+1.0g/L 蛋白胨 +0.3g/L 酸性水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +3.0g/L 琼脂 +1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.8. （5） 试管苗移栽 ： 将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗 7 天后， 将试管苗从。

21、培养瓶 中取出， 洗掉根部培养基， 栽入由泥炭土和松树皮 （1 ： 3） 混合成的基质中并按常规的二倍 体金线莲进行大田栽培管理， 四倍体金线莲成活率达 95%。 0023 上述 （2） （4） 各步骤中的培养条件均为 ： 培养温度 25， 每天光照 10 小时， 光照 强度 2000lx。 0024 实施例三 1、 品种来源 广西产组培苗经大田栽培 1.5 年后的优质金线莲 ； 2、 培育过程 （1） 人工授粉 ： 按常规方法进行栽培管理， 金线莲开花进行异花授粉后 95 天蒴果成熟。 0025 （2） 非共生萌发 ： 在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时， 经 80% 的酒精溶液消毒 4 分。

22、钟后， 用无菌水冲洗 3 次后置于 0.1% 升汞溶液消毒 15 分钟， 经无菌水冲洗 5 次后用无 说 明 书 CN 104082123 A 5 4/4 页 6 菌滤纸吸干， 然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接种针将黄色种胚接种到 萌发培养基上培养， 培养 25 天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为 ： 1.5g/L 花宝 1 号 +1.0g/L 蛋白胨 +80ml/L 椰子汁 +28g/L 蔗糖 +7.0g/L 琼脂 +0.8g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.8。 0026 （3） 诱变剂处理 ： 将非共生萌发开成的原球茎转入含有0.0。

23、3%秋水仙碱和0.02%氟 乐灵混合液的液体分化培养基中， 在 26条件下进行间歇振荡诱变处理 400 小时， 经染色 体计数， 四倍体诱导率为 75%。所采用的液体分化培养基为 ： 1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+35g/L 蔗糖 +2.0g/L 蛋白胨 +0.1g/L 酸性水解酪蛋白 +0.6g/L 活性炭， pH 为 5.8。 0027 （4） 壮苗培养 ： 将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养， 进一步形 成 5 8cm 高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为 ： 1.8g/L 花宝 1 号 +1.2g/L 花宝 2 号 +0.6mg/LNAA+1。

24、.5g/L 蛋白胨 +0.3g/L 酸性水解酪蛋白 +35g/L 蔗糖 +4.0g/L 琼脂 +1.0g/L 活性炭， 其余为 MS 培养基的有机物成分， pH 为 5.8. （5） 试管苗移栽 ： 将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗 6 天后， 将试管苗从培养瓶 中取出， 洗掉根部培养基， 栽入由泥炭土和松树皮 （1 ： 3） 混合成的基质中并按常规的二倍 体金线莲进行大田栽培管理， 四倍体金线莲成活率达 96%。 0028 上述 （2） （4） 各步骤中的培养条件均为 ： 培养温度 26， 每天光照 12 小时， 光照 强度 1500lx。 说 明 书 CN 104082123 A 6 。