技术领域
本发明涉及饲料领域，且特别涉及一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着高密度、集约化、工厂化水产养殖的发展，养殖海鲈脂肪肝的频繁发生是养殖业面临的普遍性问题。脂肪肝不仅会导致海鲈生长速度与饲料转化率下降，还会降低海鲈的免疫力，给海鲈养殖带来巨大经济损失，严重影响海鲈养殖的健康发展。根据我们实验室的多年研究结果，发现线粒体的功能障碍是海鲈脂肪肝发生的根本原因。线粒体功能障碍后导致脂肪酸分解能量降低，脂肪就容易在海鲈肝脏过度沉积。此外，线粒体功能障碍还会导致机体产生氧化应激。线粒体功能障碍后能量供应必然受到影响，则机体免疫反应受到影响。因此，海鲈脂肪肝常出现的氧化损伤、免疫力低下等现象都与线粒体功能障碍有密切的关系。
因此，开发能够改善海鲈肝脏线粒体功能的产品有着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂，该复合型饲料添加剂的原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。
本发明的第二目的在于提供一种上述饲料添加剂的制备方法，该制备方法简单，条件可控性好，稳定性好，具有良好的应用前景。
本发明的第三目的在于提供上述饲料添加剂在海鲈饲料中的应用，将其应用于制备海鲈饲料，可提高海鲈肝脏线粒体的抗氧化能力以及线粒体呼吸链功能，减少线粒体氧化损伤。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂，每100重量份的复合型饲料添加剂包括6-10重量份的蛋氨酸螯合锰、2-6重量份的蛋氨酸螯合铜、30-50重量份的黄连素、20-30重量份的肌酸以及0.5-2重量份的红法夫酵母，余量为载体。
本发明还提出上述复合型饲料添加剂的制备方法：按配比混合蛋氨酸螯合锰、蛋氨酸螯合铜、黄连素、肌酸、红法夫酵母以及载体。
另外，本发明还提出了上述复合型饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，例如可按质量百分数为0.5-1.5％的比例添加于海鲈饲料中。
本发明较佳实施例提供的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂及其制备方法与应用的有益效果是：
(1)所选原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。
(2)产品调控靶点明确、安全高效、配方合理，各组分间具有协同作用，配伍使用比单一使用效果更好、更稳定。
(3)产品可提高线粒体的呼吸链复合物的活性，促进线粒体的能量代谢、增强线粒体ATP的产生能力。
(4)产品可以提高线粒体生成能力，促进线粒体的再生。
(5)制备方法简单，条件可控性好，饲料稳定性好，具有很好的应用前景。
(6)用于制备海鲈饲料并饲喂海鲈，可提高海鲈肝脏线粒体的抗氧化能力以及线粒体呼吸链功能，减少线粒体氧化损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为试验例2中正常组海鲈肝细胞在电镜下的结构图；
图2为试验例2中高脂组海鲈肝细胞在电镜下的结构图；
图3为试验例2中试验组3海鲈肝细胞在电镜下的结构图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂及其制备方法与应用进行具体说明。
经研究发现，线粒体的功能障碍是鱼类脂肪肝发生的根本原因。线粒体是脂肪酸β-氧化的主要场所，也活性氧产生之源。线粒体功能障碍不仅会导致脂肪酸分解能量降低，脂肪易在肝脏过度沉积。而且，线粒体功能障碍还会导致细胞内活性氧产生升高，使机体产生氧化应激。线粒体是能量代谢的中心，其功能障碍后能量供应必然受到影响，能量缺乏还会使得机体免疫反应受到影响。
因此，鱼类脂肪肝常出现的氧化损伤、免疫力低下等现象都与线粒体的功能障碍有着极其密切的关系。
基于上述发现，本发明实施例中，每100重量份的复合型饲料添加剂例如可以包括6-10重量份的蛋氨酸螯合锰、2-6重量份的蛋氨酸螯合铜、30-50重量份的黄连素、20-30重量份的肌酸以及0.5-2重量份的红法夫酵母，余量为载体。
进一步地，每100重量份的上述复合型饲料添加剂例如可以包括7-9重量份的蛋氨酸螯合锰、3-5重量份的蛋氨酸螯合铜、35-45重量份的黄连素、23-27重量份的肌酸以及0.5-1.5重量份的红法夫酵母，余量为载体。
更进一步地，每100重量份的上述复合型饲料添加剂例如可以包括8重量份的蛋氨酸螯合锰、4重量份的蛋氨酸螯合铜、40重量份的黄连素、25重量份的肌酸以及1重量份的红法夫酵母，余量为载体。
作为可选地，上述载体包括脱脂米糠和/或稻壳粉。
其中，蛋氨酸螯合锰在本发明方案提供的复合型饲料添加剂中主要起到提供锰元素的作用。锰作为多种酶的组成成分或者激活剂，特别是作为锰过氧化物歧化酶的重要组成成分，可以消除线粒体的过氧化物，保护线粒体免遭氧化损伤。
其次，蛋氨酸螯合锰中还含有蛋氨酸，能够避免脂质过氧化物损害初级和次级溶酶体膜，导致溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来而对细胞和线粒体膜等重要的细胞器造成损害。此外，蛋氨酸还能够促进肝细胞膜磷脂甲基化，使膜流动性增强，减少肝细胞内胆汁的淤积，加强转硫基作用，减少胆汁酸在肝内聚积，具有较佳的解毒作用。
通过采用同时含有蛋氨酸与锰的蛋氨酸螯合锰，不仅能够兼具蛋氨酸以及锰的作用，而且还能较单独的蛋氨酸或者锰具有更高的生物效价，不仅降低了锰的用量，还减少了生产成本。
较佳地，上述蛋氨酸螯合锰中的配体比(蛋氨酸与锰元素的摩尔比)优选控制在2.5-3：1，此配体比范围内蛋氨酸螯合锰的稳定性较适合海鲈吸收利用。配体比过小会造成形成的螯合物不稳定，游离的锰离子会催化导致羟基自由基产生；配体比过大，虽螯合物稳定性增强，但其稳定性过强后，不仅不利于海鲈吸收利用，同时还会造成蛋氨酸的浪费，从而增加生产成本。
蛋氨酸螯合铜在本发明实施例的饲料添加剂中主要起抗氧化功能，可以清除自由基，保护线粒体膜的完整性。其与蛋氨酸螯合锰共同为海鲈提供蛋氨酸，并保护线粒体正常运作。
优选地，本发明实施例中蛋氨酸螯合铜所含的铜为Cu2+。较佳地，上述蛋氨酸螯合铜中铜元素的螯合率优选在92-93％，此螯合率下铜的稳定性较强，不仅可避免在海鲈体内催化羟基自由基产生，同时也较适于海鲈的消化吸收。
进一步地，本发明实施例中蛋氨酸螯合铜的配体比(蛋氨酸与铜元素的摩尔比)优选控制在2-2.5：1，此配体比范围内的具有上述螯合率(92-93％)的蛋氨酸螯合锰在相对稳定的同时，还较利于海鲈吸收利用。
黄连素也称小檗碱，目前黄连素通常用于治疗细菌性肠炎或痢疾等消化道疾病，另在调节肠道菌群及便秘方面也有应用。但本发明实施例中，通过将黄连素作为原料成分之一，可利用其激活细胞线粒体生物合成的关键因子，促使线粒体的生物合成、脂肪酸的氧化，同时也具有一定的抗氧化功能。
肌酸是天然存在的氨基酸衍生物，在本发明实施例中主要起到为细胞补充能量、增强细胞生物能、增强线粒体的功能以及减少线粒体介导的凋亡等作用。
红法夫酵母在本发明实施例中可增强海鲈线粒体呼吸链复合物II的活性、减少线粒体非正常自噬与分裂，促进线粒体的生成，并且红发夫酵母也具有强抗氧化活性。
上述原料成分除了各自具有单独的作用外，各原料之间还具有协同增效作用，例如：蛋氨酸螯合锰与蛋氨酸螯合铜具有协同抗氧化作用并能够减少线粒体的氧化损伤。蛋氨酸螯合锰与黄连素也具有协同抗氧化作用，并且，蛋氨酸螯合锰能增强黄连素促进线粒体生成的效果。蛋氨酸螯合锰与肌酸能够协同提高线粒体的能量代谢能力，补充细胞能量。蛋氨酸螯合锰与红法夫酵母能够协同抗氧化，提高线粒体呼吸链的活性。黄连素能够促进线粒体生成基因的表达，肌酸为线粒体生成提供能量，二者协同提高线粒体的生成。
承上所述，本发明实施例的饲料添加剂中的原料配合使用后，能够有效改善肝脏线粒体的功能，提高线粒体的脂肪酸分解能力，缓解脂肪肝的发生。
此外，本发明实施例还提供了一种上述复合型饲料添加剂的制备方法，也即按上述配比混合蛋氨酸螯合锰、蛋氨酸螯合铜、黄连素、肌酸、红法夫酵母以及载体即可。
作为可选地，由于红法夫酵母、蛋氨酸螯合铜及蛋氨酸螯合锰的含量较少，尤其是红法夫酵母，为避免混合不均匀，如造成某些部分含有红发夫酵母而某些部分不含红法夫酵母的情况，本发明实施例中可将载体分为两部分，先将红法夫酵母、蛋氨酸螯合锰、蛋氨酸螯合铜与第一部分载体混合均匀，然后再按配方量与黄连素、肌酸混合，最后再与剩余的第二部分载体混合，从而以使各组分混合均匀。
较佳地，在混合前，可将固体原料粉碎至150-180μm，以提高固体原料的颗粒均一性，改善饲料添加剂的可食性和消化率。
此外，本发明实施例还提供了一种上述复合型饲料添加剂的应用，例如可将其用于制备海鲈饲料并饲喂海鲈，从而能够有效提高海鲈肝脏线粒体数量、提高线粒体的能量代谢能力和呼吸链活性以及提高线粒体抗氧化能力，从而达到改善海鲈肝脏线粒体功能的作用。
作为可选地，该复合型饲料添加剂例如可以按质量百分数为0.5-1.5％添加于海鲈饲料中，例如可以按0.5wt％、1wt％和1.5wt％加入海鲈饲料中，优选按1wt％加入至海鲈饲料中。该添加比例下，饲料添加剂的性价比最佳。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
按每100重量份的复合型饲料添加剂含有6重量份的蛋氨酸螯合锰、2重量份的蛋氨酸螯合铜、30重量份的黄连素、20重量份的肌酸以及0.5重量份的红法夫酵母，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
其中，蛋氨酸螯合锰的配体比为2.5：1。蛋氨酸螯合铜所含的铜为Cu2+，蛋氨酸螯合铜中铜元素的螯合率为92％，蛋氨酸螯合铜的配体比为2：1。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的复合型饲料添加剂含有10重量份的蛋氨酸螯合锰、6重量份的蛋氨酸螯合铜、50重量份的黄连素、30重量份的肌酸以及2重量份的红法夫酵母，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的复合型饲料添加剂含有7重量份的蛋氨酸螯合锰、3重量份的蛋氨酸螯合铜、35重量份的黄连素、23重量份的肌酸以及0.5重量份的红法夫酵母，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的复合型饲料添加剂含有9重量份的蛋氨酸螯合锰、5重量份的蛋氨酸螯合铜、45重量份的黄连素、27重量份的肌酸以及1.5重量份的红法夫酵母，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的复合型饲料添加剂含有8重量份的蛋氨酸螯合锰、4重量份的蛋氨酸螯合铜、40重量份的黄连素、25重量份的肌酸以及1重量份的红法夫酵母，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锰中的配体比为3：1。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锰中的配体比为2.75：1。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合铜中铜元素的螯合率为93％。
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合铜中铜元素的螯合率为92.5％。
实施例10
本实施例与实施例1的区别在于：载体为稻壳粉。
实施例11
本实施例与实施例1的区别在于：载体为脱脂米糠与稻壳粉的混合物。
实施例12
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合铜的配体比为2.5：1。
实施例13
本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合铜的配体比为2.25：1。
实施例14
本实施例与实施例1的区别在于：混合过程中，将载体分为两部分，按配比先将红法夫酵母、蛋氨酸螯合锰、蛋氨酸螯合铜与第一部分载体混合均匀，然后再按配方量与黄连素、肌酸混合，最后再与剩余的第二部分载体混合。
实施例15
本实施例提供一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为0.5％添加于海鲈饲料中。
实施例16
本实施例提供一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为1％添加于海鲈饲料中。
实施例17
本实施例提供一种改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为1.5％添加于海鲈饲料中。
试验例
重复实施上述实施例1-14，得到足够多的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂。
以实施例1-2以及实施例5为例作为试验组1-3，采用单因子设计，将试验鱼驯化一周后，挑选体格健壮、规格均一(均重为200±3g)的海鲈1500尾，随机分成5组(对照组、高脂组、试验组1-3)，每组3个重复，每个重复100尾。海鲈养殖于15个海水网箱中(规格为2.0m×2.0m×2.0m)中养殖。养殖试验期间，每日投喂2次(7：30和17：30)，饱食投喂，养殖周期为10周。每组饲料配方如表1所示，正常组饲料脂肪含量11％，高脂组：饲料脂肪水平为20％(本实验室前期研究表明：20％脂肪会损伤肝脏线粒体)，试验组：饲料脂肪水平为20％，并添加本添加剂。用小型颗粒机加工成粒径为5mm左右的颗粒，常温风干后置于4℃冰箱保存备用。
养殖试验结束，禁食24h。统计每一网箱中鱼的尾数。将鱼用浓度为100mg/L的MS-222(Sigma，美国)麻醉，置于冰盘上采集肝脏，并提取线粒体，用于测试以下指标。试验结果如表2至表5所示。
表1各组饲料配方组％
注：表1中维生素预混物(mg或g/kg饲料)分别含有硫胺素25mg，核黄素45mg，盐酸吡哆醇20mg，维生素B120.1mg，维生素K310mg，肌醇800mg，泛酸60mg，烟酸200mg，叶酸20mg，生物素1.2mg，维生素A乙酸酯32mg，维生素D35mg，α-生育酚120mg，乙氧基喹啉150mg，胆碱(50％)5000mg。
矿物质预混料(mg/kg饲料)分别含有一水硫酸镁4000mg，一水硫酸锰50mg，碘化钾(1％)100mg，氯化钴(1％)100mg，五水硫酸铜20mg，一水硫酸亚铁260mg，一水硫酸锌150mg，亚硒酸钠(1％)50mg。
表2不同试验组对海鲈肝脏线粒体含量的影响
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组的海鲈的线粒体蛋白含量显著高于高脂组(P<0.05)，与正常组无显著差异(P>0.05)。试验组与高脂组相比，线粒体DNA拷贝数与线粒体密度均显著提高(P<0.05)，与正常组无显著差异。表明添加本发明实施例提供的复合型饲料添加剂可提高海鲈线粒体蛋白含量、DNA拷贝数以及线粒体密度。
表3不同试验组线粒体能量代谢功能的指标
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。
由表3可以看出，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组海鲈的线粒体异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和Na+,K+-ATPase活性与对高脂组相比显著升高(P<0.05)，与正常组无显著差异，表明本发明实施例提供的复合型饲料添加剂具有增强线粒体功能的作用。此外，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组海鲈的脂肪酸分解速率较高脂组显著提高，与正常组相比无差异，表明本发明实施例提供的复合型饲料添加剂可提高线粒体的脂肪酸分解能力。
表4不同试验组线粒体呼吸链复合物活性
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。
由表4可以看出，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组海鲈的线粒体呼吸链复合物I、II、III较高脂组均得以显著提高(P<0.05)，并达到正常组水平，表明本发明实施例提供的复合型饲料添加剂能够提高线粒体的呼吸链活性。
表5不同试验组线粒体氧化损伤指标
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。
由表5可以看出，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组海鲈的线粒体的总超氧化物歧化酶SOD活性较高脂组显著提高(P<0.05)，从而增强抗氧化功能。并且，添加实施例1、2、5所提供的复合型饲料添加剂后，试验组海鲈的脂质过氧化物MDA和细胞内ROS含量较高脂组明显更低(P<0.05)，说明本发明实施例提供的复合型饲料添加剂能够有效降低线粒体遭受的氧化损伤程度。
按照上述试验例的方法对实施例3、4以及6-14所得的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂进行试验，其结果同样显示通过饲喂含有本发明实施例提供的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的鱼饲料，可较高脂组提高海鲈肝脏线粒体数量、线粒体的能量代谢能力、呼吸链活性以及抗氧化能力。
试验例2
将试验例1中试验期结束时的试验组3以及正常组和高脂组的海鲈的肝细胞于电镜下观察，其结果如图1-3所示。由图1-3可以看出：正常组海鲈的肝细胞内线粒体呈深黑色、呈修长状，线粒体基质均匀，内外膜清晰。高脂组海鲈的线粒体密度变小，细胞内线粒体数目减少，线粒体肿胀，细胞核塌陷，线粒体内外膜模糊。试验组较高脂组能够增加海鲈线粒体的数量，缓解线粒体的肿胀。由此说明，通过饲喂含本发明实施例提供的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的海鲈饲料，有利于维持海鲈线粒体完整的正常结构。
综上所述，本发明实施例提供的改善海鲈肝脏线粒体功能的复合型饲料添加剂的原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。其制备方法简单，条件可控性好，稳定性好，具有良好的应用前景。将上述复合型饲料添加剂应用于制备海鲈饲料，可提高海鲈肝脏线粒体的抗氧化能力以及线粒体呼吸链功能，减少线粒体氧化损伤。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。