技术领域
本发明属于苦荞茶技术领域，具体涉及一种利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法。
背景技术
苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)，属双子叶蓼科一年生植物，是中国占有绝对优势的一种杂粮资源。《本草纲目》、《重修政和证类本草》、《中药大词典》等书中记载，“苦荞麦性味苦，平，寒，有益气力，续精神，利耳目，降气宽肠键胃的作用”；“叶作茹食，下气、利耳目”；“治噎食、痈肿，并能止血，蚀恶肉”。药理和化学成分的研究表明，苦荞含有丰富的营养及较多的芦丁、槲皮素等黄酮类物质，这赋予了苦荞多种生物学功能，如抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压、降血脂、预防动脉硬化及保护心血管等作用。目前，国内外市场对苦荞及其加工产品的需求日益增大，我国的苦荞资源生产与加工正面临着诸多的机遇与挑战，因而急需对其进行系统的开发和利用，以提高其附加价值，加快产业化开发进程，促进地区经济的提高，使我国苦荞产业健康发展。
苦荞传统加工生产主要利用的是苦荞籽，已开发为多种产品，而对苦荞其他部位如苦荞花、叶、茎等，利用较少。相关研究亦表明，苦荞中的活性代表成分芦丁在叶中的含量高于籽粒。但苦荞作为一年生草本植物，以嫩叶作为原材料并不利于其全面开发与利用，而在苦荞栽培地区如中国四川凉山，苦荞叶、茎等作为苦荞籽粒采收后的副产物，常被用作饲料或是焚烧、丢弃，这是一种极大的浪费。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，可有效解决苦荞茎叶浪费的问题，同时还为苦荞茶增加了新类型。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，包括以下步骤：
(1)黑曲霉的分离纯化
将普洱茶或黑茶烘干，用浓度为0.9％的无菌生理盐水浸泡，以浸泡液作为母液，然后对母液依次进行10倍浓度梯度稀释，直至浓度为10-7g/mL，分别吸取各浓度浸泡液，涂布于PDA平板培养基，于25-30℃条件下培养1-2天，然后挑取菌落，分离、纯化，鉴定，得黑曲霉；
(2)黑曲霉孢子悬液的制备
将步骤(1)分离纯化得到的黑曲霉接种于PDA试管培养基，在25-30℃条件下培养3-5天，产生成熟的黑曲霉孢子，然后用浓度为0.9％的无菌生理盐水冲洗培养基，并同时将悬液调至OD600值为1.8-2.2，得黑曲霉孢子悬液；
(3)苦荞茎叶发酵液的制备
取苦荞茎叶，清洗干净后干燥，粉碎至5-10目，得苦荞茎叶粉，将苦荞茎叶粉置于121℃条件下灭菌20min，冷却后按体积分数为3％-8％向灭菌的苦荞茎叶粉中接种黑曲霉孢子悬液，得混合物，然后向混合物中加入等重量的无菌水，搅拌均匀，于25-30℃条件下发酵2-10天，得苦荞茎叶发酵液；
(4)苦荞茶的制备
将步骤(3)制得的苦荞茎叶发酵液于50-60℃条件下烘干，得苦荞茎叶发酵物即苦荞茶。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)中培养温度为28℃。
进一步地，步骤(2)中用0.9％的无菌生理盐水将悬液调至OD600值为2。
进一步地，步骤(3)中所添加的黑曲霉孢子悬液体积分数为5％。
进一步地，步骤(3)中发酵温度为28℃。
进一步地，步骤(3)中发酵时间为4-6天。
通过上述方法制备出的苦荞茶。
通过上述方法制备出的苦荞茎叶发酵液。
本发明提供的利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，具有以下有益效果：
(1)本发明以苦荞籽粒采收后的苦荞茎和叶作为原料，利用普洱茶或黑茶中的优势菌种黑曲霉，通过特定的发酵工艺，对苦荞茎、叶进行发酵，可以有效解决苦荞茎和叶被丢弃、焚烧或其他形式的浪费问题，同时还为苦荞茶增加了新的种类。
(2)经黑曲霉发酵后制得的苦荞茶，总多酚、总黄酮含量均较高，具有较强的抗氧化活性，此发明使得废弃物得以有效利用，变废为宝，可将其用于预防和缓解“三高”以及动脉硬化，还可以起到保护心血管的药效作用。
(3)本发明制备方法简单，成本低，适用于工业化生产。
附图说明
图1为不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物中多酚含量变化图。
图2为不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物中黄酮含量变化图。
图3为芦丁标准品、槲皮素标准品和发酵样品的色谱图。
图4为不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物中芦丁、槲皮素和总芦丁含量变化图。
图5为不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物对DPPH自由基清除率结果。
图6为不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物铁氰化钾还原实验结果。
具体实施方式
实施例1
利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，包括以下步骤：
(1)黑曲霉的分离纯化
将普洱茶烘干，称取1g，用100mL浓度为0.9％的无菌生理盐水浸泡，以浸泡液作为母液，然后对母液依次进行10倍浓度梯度稀释，直至浓度为10-7g/mL，分别吸取各浓度浸泡液100μL，涂布于PDA平板培养基，于25℃条件下培养1-2天，然后挑取菌落，分离、纯化，鉴定，得黑曲霉；
(2)黑曲霉孢子悬液的制备
将步骤(1)分离纯化得到的黑曲霉接种于PDA试管培养基，在25℃条件下培养3-5天，产生成熟的黑曲霉孢子，然后用浓度为0.9％的无菌生理盐水冲洗培养基，并同时将悬液调至OD600为1.8，得黑曲霉孢子悬液；
(3)苦荞茎叶发酵液的制备
取苦荞茎叶，清洗干净后干燥，粉碎至5目，得苦荞茎叶粉，将苦荞茎叶粉置于121℃条件下灭菌20min，冷却后按体积分数为3％向灭菌的苦荞茎叶粉中接种黑曲霉孢子悬液，得混合物，然后向混合物中加入等重量的无菌水，搅拌均匀，于25℃条件下发酵1-25天，得苦荞茎叶发酵液；其中每隔24h取样1g，进行化学成分及抗氧化活性的测定；
(4)苦荞茶的制备
将步骤(3)制得的苦荞茎叶发酵液于60℃条件下烘至恒重，得苦荞茎叶发酵物即苦荞茶。
实施例2
利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，包括以下步骤：
(1)黑曲霉的分离纯化
将黑茶烘干，称取1g，用100mL浓度为0.9％的无菌生理盐水浸泡，以浸泡液作为母液，然后对母液依次进行10倍浓度梯度稀释，直至浓度为10-7g/mL，分别吸取各浓度浸泡液100μL，涂布于PDA平板培养基，于30℃条件下培养1-2天，然后挑取菌落，分离、纯化，鉴定，得黑曲霉；
(2)黑曲霉孢子悬液的制备
将步骤(1)分离纯化得到的黑曲霉接种于PDA试管培养基，在30℃条件下培养3-5天，产生成熟的黑曲霉孢子，然后用浓度为0.9％的无菌生理盐水冲洗培养基，并同时将悬液调至OD600为2.2，得黑曲霉孢子悬液；
(3)苦荞茎叶发酵液的制备
取苦荞茎叶，清洗干净后干燥，粉碎至5目，得苦荞茎叶粉，将苦荞茎叶粉置于121℃条件下灭菌20min，冷却后按体积分数为8％向灭菌的苦荞茎叶粉中接种黑曲霉孢子悬液，得混合物，然后向混合物中加入等重量的无菌水，搅拌均匀，于30℃条件下发酵1-25天，得苦荞茎叶发酵液；其中每隔24h取样1g，进行化学成分及抗氧化活性的测定；
(4)苦荞茶的制备
将步骤(3)制得的苦荞茎叶发酵液于60℃条件下烘至恒重，得苦荞茎叶发酵物即苦荞茶。
实施例3
利用黑曲霉发酵苦荞茎叶制备苦荞茶的方法，包括以下步骤：
(1)黑曲霉的分离纯化
将普洱茶烘干，称取1g，用100mL浓度为0.9％的无菌生理盐水浸泡，以浸泡液作为母液，然后对母液依次进行10倍浓度梯度稀释，直至浓度为10-7g/mL，分别吸取各浓度浸泡液100μL，涂布于PDA平板培养基，于28℃条件下培养1-2天，然后挑取菌落，分离、纯化，鉴定，得黑曲霉；
(2)黑曲霉孢子悬液的制备
将步骤(1)分离纯化得到的黑曲霉接种于PDA试管培养基，在28℃条件下培养3-5天，产生成熟的黑曲霉孢子，然后用浓度为0.9％的无菌生理盐水冲洗培养基，并同时将悬液调至OD600为2.0，得黑曲霉孢子悬液；
(3)苦荞茎叶发酵液的制备
取苦荞茎叶，清洗干净后干燥，粉碎至5目，得苦荞茎叶粉，将苦荞茎叶粉置于121℃条件下灭菌20min，冷却后按体积分数为5％向灭菌的苦荞茎叶粉中接种黑曲霉孢子悬液，得混合物，然后向混合物中加入等重量的无菌水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵1-25天，得苦荞茎叶发酵液；其中每隔24h取样1g，进行化学成分及抗氧化活性的测定；
(4)苦荞茶的制备
将步骤(3)制得的苦荞茎叶发酵液于60℃条件下烘至恒重，得苦荞茎叶发酵物即苦荞茶。
实验例1
1、苦荞茎叶发酵物提取液的制备
将实施例3中每隔1h取的样品分别于60℃条件下烘至恒重，接着研钵磨碎并过筛，然后分别取500mg，加入95％乙醇45mL，进行超声提取(300w，40℃，40min)，提取结束后，将提取液冷却至室温，置于50mL容量瓶中，并用95％乙醇定容，混合均匀，得苦荞茎叶发酵物提取液。
2、总多酚含量的测定
采用福林酚法测定苦荞茎叶发酵物随发酵时间的变化，其总多酚含量的变化。
具体操作如下：取苦荞茎叶发酵物提取液1mL，加入FC试剂5mL，混合均匀后，静置5min，然后缓慢加入浓度为7.5％的Na2CO3溶液4mL，混匀，暗反应60min，于700nm波长下测定其吸光度值；以95％乙醇作为空白对照，以没食子酸为标准品，进行标准曲线的制作，标准曲线为y＝0.0021x+0.001，R2＝0.9993(y为A700，x为没食子酸浓度)。
总多酚单位为每g苦荞茎叶发酵物干重中所含没食子酸当量(mgGAE/gDW)，其结果见图1。
由图1可知，黑曲霉发酵苦荞茎叶，可增强苦荞茎叶中的多酚含量，随着发酵天数的增加苦荞茎叶中的多酚含量呈现先上升后下降的趋势，当发酵第4天时，多酚含量最高，由16.5±1.25mg/g增加到27.8±1.48mg/g，但随着发酵时间的增加，苦荞茎叶中的多酚含量逐渐降低，当发酵至第24天时，多酚含量仅为1.89±0.48mg/g。
3、总黄酮含量的测定
取苦荞茎叶发酵物提取液2mL，加入浓度为5％的亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀后静置6min，接着加入浓度为10％的硝酸铝溶液0.5mL，混匀后静置6min，再加入浓度为4％的NaOH溶液4mL和60％乙醇3mL，混匀后静置15min，于510nm波长下测定其吸光度值；以芦丁为标准品进行标准曲线的制作，标准曲线为：y＝0.0021x+0.0021，R2＝0.9996(y为A510，x为芦丁浓度)。
总黄酮单位为每g苦荞茎叶发酵物干重中所含芦丁当量(mg RE/g DW)，其结果见图2。
由图2可知，黑曲霉发酵苦荞茎叶，可增强苦荞茎叶中的黄酮含量，随着发酵天数的增加苦荞茎叶中的黄酮含量呈现先上升后下降最后无明显变化的趋势，当发酵第4天时，黄酮含量最高，由42.1±1.68mg/g增加到62.4±2.14mg/g，但随着发酵时间的增加，苦荞茎叶中的黄酮含量逐渐降低，当发酵至第16天时，黄酮含量仅为11.24±0.89mg/g，而在随后的发酵过程中，黄酮含量维持在10mg/g左右。
4、芦丁、槲皮素含量的测定
分别对芦丁标准品和槲皮素标准品进行色谱分析，其中色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18(250mm＊4.6mm，5.0um)，以流动相A(乙腈)和流动相B(2％醋酸)，进行梯度洗脱(0min：17％A；18min：40％A；40min：90％A)，流速为1mL/min，柱温为25℃，确定芦丁和槲皮素所对应的色谱峰，并绘制标准曲线：
芦丁标准曲线：y＝13.114x+83.052，R2＝0.9991；
槲皮素标准曲线：y＝31.158x+62.944，R2＝0.9997；
以上y为不同浓度标准品所对应的峰面积，x为浓度；最终结果记为mg/g，按标准曲线计算并绘制发酵过程中芦丁和槲皮素含量的变化，并按下式计算总芦丁含量的变化：
芦丁标准品、槲皮素标准品和发酵样品的色谱图见图3；由图3可知，6.9min所对应的色谱峰为芦丁，16.0所对应的色谱峰为槲皮素，并根据标准曲线计算黑曲霉发酵过程中苦荞茎叶中的芦丁、槲皮素和总芦丁含量变化，其结果见图4。
苦荞茎叶中含有的主要活性成分为芦丁，而黑曲霉可产生水解芦丁的酶即α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，可将芦丁水解为槲皮素。
由图4可知，黑曲霉发酵前期，苦荞茎叶中芦丁、槲皮素和总芦丁含量随发酵的进行而逐渐增加，当发酵第3天时，芦丁含量由17.8±1.64mg/g增加到33.9±2.18mg/g，槲皮素含量由3.68±0.49mg/g增加到8.1±0.57mg/g，而总芦丁含量则由26.48±2.48mg/g增加到51.4±1.89mg/g。随着发酵的进一步进行，苦荞茎叶中芦丁的含量却呈现下降的趋势，到发酵第13天时，基本没有芦丁；槲皮素因其是由芦丁转化而来，其含量受芦丁含量影响较大，在发酵第8天左右达到最高，为13.8±2.48mg/g，最后呈现下降趋势；总芦丁含量在发酵前期有所增加，主要来源于芦丁含量的增加，然后也呈现下降趋势。
5、DPPH自由基清除实验
以苦荞茎叶发酵物提取液进行DPPH自由基清除实验。
实验过程：称取DPPH 8.0mg，超声溶解于100mL 95％乙醇中，得浓度为80μg/mL的DPPH溶液，以95％乙醇为空白对照进行调零，在波长为517nm下测定吸光度值，具体操作按下表进行：
所测定的Ae、Ai、Aj按下式进行计算，得DPPH自由基清除率，用于衡量苦荞茎叶发酵过程中抗氧化活性的改变，不同发酵天数的苦荞茎叶发酵物对DPPH自由基清除率结果见图5。
由图5可知，黑曲霉发酵前期，苦荞茎叶提取液对DPPH自由基的清除能力逐渐增加，当发酵第6天时，其清除率由(37.5±1.59)％增加到(59.8±0.89)％，随着发酵的进一步进行，其抗氧化活性逐渐下降，当发酵第24时，其DPPH自由基的清除能力仅为(11.8±3.24)％。
6、铁氰化钾还原实验
取苦荞茎叶发酵物提取液0.1mL，加入0.9mL 95％乙醇进行稀释，接着加入2.5mL，pH值为6.6的PBS缓冲液和2.5mL浓度为1％的铁氰化钾溶液，混合均匀，在50℃下放置20min，然后冷却至室温，再加入2.5mL浓度为10％三氯乙酸溶液，混合均匀，4000r/min离心10min，取上清2.5mL，向其中加入2.5mL超纯水和1mL浓度为0.1％的三氯化铁，混合均匀后，在波长为700nm下测定吸光度值，其结果见图6。
由图6可知，黑曲霉发酵前期，苦荞茎叶提取物还原力逐渐增加，在发酵第4天达到最低，其吸光度值由原来的0.167±0.04增加到0.269±0.07，但随着发酵的进一步进行，其还原力逐渐下降，到发酵第24天时，其所对应的吸光度值仅为0.05±0.01。
综上所述，经过黑曲霉发酵的苦荞茎叶提取物与未经黑曲霉发酵的苦荞茎叶提取物相比，其总多酚含量、总黄酮含量、芦丁和槲皮素含量均有显著提高，其DPPH自由基清除率和铁氰化钾还原力也得到显著提高。
实验例2
将经过黑曲霉发酵的苦荞茶(本发明产品)与未经黑曲霉发酵的苦荞茶(对照品)进行外形比较，然后进行开水冲泡，观察其颜色及泡茶次数，结果如下：
本发明产品外形紧密结实，开水冲泡后茶水颜色清亮纯正，无肉眼可见杂质，浸泡几次后也无浑浊、散颗粒现象，具有苦荞特有的香味。
对照品外形紧密结实，开水冲泡后颜色清亮，无肉眼可见杂质，但浸泡几次后，茶水颜色明显比本发明产品先褪色，也有浑浊现象，有散颗粒现象，苦荞香味没有本发明产品浓厚，且香味消失较快。