一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法.pdf

《一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 103168676 B (45)授权公告日 2014.11.26 CN 103168676 B (21)申请号 201310073294.6 (22)申请日 2013.03.08 A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 湖北大学 地址 430062 湖北省武汉市武昌区友谊大道 368 号 (72)发明人 蔡得田 宋兆建 王维 王东鹏 陈小芳 潘超虎 屈海波 杜明芳 何玉池 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 42212 代理人 丁齐旭 CN 101897295 A,2010.12.01, CN 12666。

2、15 A,2000.09.20, 全文 . CN 101322474 A,2008.12.17, 全文 . CN 102150642 A,2011.08.17, 全文 . (54) 发明名称 一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂 种的方法 (57) 摘要 本发明提出了一种远缘杂交和多倍体化选育 构树桑树新杂种的方法， 它是通过生殖工程性品 种改良技术， 对远缘杂种进行胚胎工程、 组织培养 技术， 建立了诱导杂交果愈伤组织加倍形成远缘 杂交多倍体杂种系， 步骤为 ： a. 远缘杂种果实的 获得 ； b. 杂交果的愈伤组织诱导 ； c. 杂交果愈伤 组织的秋水仙素处理 ； d. 处理后愈伤组织的。

3、恢复 培养 ； e.愈伤组织分化出芽苗 ； f.芽苗分化出根 ； g. 组培植株的移植 ； h. 成活植株的比较观察与选 择 ； i. 选株的无性扩繁成稳定品种 （系） 。本发明 解决了现有桑树生长缓慢， 适应性不强和构树主 干不明， 材质较差的问题， 而培育出主干明显、 适 应性强、 材质较好的多倍体构树桑树新杂种。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姜岚 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书4页 附图5页 (10)授权公告号 CN 103168676 B CN 103168676 B。

4、 1/2 页 2 1. 一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法， 其特征在于选育过程为 ： a. 远缘杂种果实的获得 远缘杂种是以生长旺盛， 无病虫害的优良桑树品种和野生构树为亲本， 利用构树桑树 雌雄异株的特性， 选用雌构树为母本进行套袋， 父本桑树的花粉采集于初花期， 取出花药于 干燥处晾干， 待花药开裂、 花粉散出后将花药用纸包好， 放在底层有干燥剂的干燥器中储 存 ； 在构树品种始花至终花、 柱头上出现粘液时， 分 2 次 3 次授粉， 授粉后每隔一天对杂 交果喷施 50mg/L-100mg/LGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA 的激素， 2 周后 , 获得杂交果 。

5、； b. 杂交果的愈伤组织诱导 取回杂交果经流水冲净后， 先在 0.1% 新洁尔灭溶液中浸泡 30 min， 然后用 0.1% 升汞 消毒810min ， 再用无菌水洗 3次4 次， 将消毒后的杂交果， 放在超净工作台上除去果 实外绒毛， 切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm叶柄， 再将切好的果子切割面朝下水平放 入到杂交果愈伤组织诱导培养基中， 置于 20001x 光照 10hr/d， 25条件下培养， 20 天 -25 天果实发生膨大并在果实中心处或切面出现紧密的乳白色团状愈伤组织 ； 所述杂交果的愈伤组织诱导培养基配方为 ： MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-B。

6、A + 0.1mg/ L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 琼脂 ， pH5.8 ； c杂交果愈伤组织的秋水仙素处理 当杂交果愈伤组织生长到 40 天 -45 天时， 将愈伤组织置于添加 500mg/L 750mg/L 秋水仙素， 不加琼脂的杂交果愈伤组织加倍培养液中， 放在温室 26的摇床上， 在 100 转 120 转 / 分钟的速度下旋转培养处理 48hr 60hr ； 所述加倍培养液配方为 ： MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L-0.5mg/L NAA + 500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 蔗糖 ， pH5.8。

7、 ； d处理后愈伤组织的恢复培养 杂交果愈伤组织加倍处理完毕， 取出愈伤组织经无菌水冲洗和吸干表面水分后， 接种 到杂交果愈伤组织诱导培养基上， 恢复培养 7 天 ； e愈伤组织分化出芽苗 经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养， 15 天 -20 天后愈伤组织出现绿 芽， 25 天 -35 天后陆续分化出芽苗， 并可见丛苗出现 ； 所述分化培养基配方为 ： MS + 2.0mg/L 3.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L-0.3mg/L NAA + 3% 蔗糖 + 0.75% 琼脂 ,pH5.8 ； f芽苗分化出根 当芽苗分化生长到 2.0cm-5.0cm 高时， 将芽苗靠近愈。

8、伤组织处剪断移植于生根培养基 中， 25 天 -30 天后芽苗基部分化出根而形成完整的组织培养植株 ； 所述生根培养基配方为 :1/2 MS +0.1mg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA + 2% 蔗糖 + 0.75% 琼脂， pH5.8 ； g组培植株的移植 当组培植株生长到 8.0cm-12.0cm 高、 具有 1 条 3 条根的时候， 将进行组培植株的移 植， 首先将要移植植株的培养瓶盖打开， 每瓶添加 10ml 15ml 无菌水， 放到常温的实验室 内缓苗 2 天， 然后充分清洗掉植株根部的培养基， 将植株移栽到灭菌的 70% 蛭石 +15% 。

9、细砂 +15%园土的基质中， 浇上1/10MS大量元素溶液， 盖上薄膜和50%遮光率的黑网 ； 然后每2天 权 利 要 求 书 CN 103168676 B 2 2/2 页 3 喷洒 1/10MS 大量元素溶液， 直至植株成活， 再逐步揭开黑网和薄膜， 使组培苗健壮生长 ； h成活植株的比较观察与选择 根据杂种植株和亲本植株外部形态的差异， 选取叶片上面光滑无毛， 下面沿叶脉疏生 毛形似桑树的植株为初选杂合体株， 再将杂合体叶片和亲本叶片的DNA提取出来,采用SSR 分子标记对其进行序列比对， 即使用同一 SSR 引物对杂种和亲本基因组体外扩增， 将扩增 产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 比较杂。

10、种和亲本基因组标记序列相似度， 结果被测植株 显示两个亲本植物的标记而确定为杂合体 , 经根尖染色体检查区分二倍体杂种和多倍体 杂种 ； i. 选株经无性扩繁成稳定品种 当已确定为构树桑树杂合体的单株生长到80cm-100cm时截取枝条， 按每茎段含3个芽 作为繁殖茎段， 于立春后的3天-15天内插植于苗床上进行无性扩繁， 而成为稳定的杂合体 构树桑树品种。 权 利 要 求 书 CN 103168676 B 3 1/4 页 4 一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法， 属于现代农业 的树木育种技术领域。 背景。

11、技术 0002 构树是桑科 (Moraceae) 构树属落叶乔灌木， 根系发达， 韧皮纤维极发达， 其适应 性极强， 极耐干旱、 瘠薄和湿热， 极少有病虫害， 而且叶含丰富蛋白质， 被誉为 “生态恢复先 锋” ， 并广泛用于饲料工业， 但其木质较差， 主干性不明显， 局限了其在木材市场和行道园林 上的应用。而桑树作为我国重要的经济林木之一 , 材质优良、 主干性明显， 其最主要价值在 于养蚕和高档家具市场用材， 但它在抗病虫害方面表现较差， 易被桑天牛等害虫取食， 其在 生态适应性上也存在一定的局限。有必要对栽培桑树和构树进行生殖工程性的品种改良。 0003 本方法利用生殖工程技术， 突破栽培。

12、桑树与野生构树杂交障碍， 通过构树和栽培 桑树的远缘杂交和多倍体化， 充分整合二者之间的优势， 将两者的优异基因结合在远缘杂 交多倍体杂种中， 培育出丰产速生、 材质优良、 适应性强的优良经济型新树种。既为桑树和 构树育种开创新途径， 也为新杂种广泛应用于木材加工、 行道园林、 饲料工业和生态恢复工 程创造良好条件。 发明内容 0004 本发明的目的是提出一种远缘杂交和多倍体化选育构树和桑树新杂种的方法 , 是通过生殖工程性品种改良技术， 对远缘杂种进行胚胎工程、 组织培养技术， 建立获得杂交 果、 诱导杂交果愈伤组织加倍形成远缘杂交多倍体杂种系， 以用于解决现有构树的主干不 明， 材质较差和。

13、桑树适应性不强的问题。 0005 本发明的技术方案为 ： a. 远缘杂种果实的获得 ； b. 杂交果的愈伤组织诱导 ； c. 杂 交果愈伤组织的秋水仙素处理 ； d. 处理后愈伤组织的恢复培养 ； e. 愈伤组织分化出芽苗 ； f. 芽苗分化出根 ； g. 组培植株的移植 ； h. 成活植株的比较观察与选择 ； i. 选株的无性扩繁 成稳定品种 （系） 。 0006 本发明的具体过程为 ： 0007 a. 远缘杂种果实的获得 0008 远缘杂种是以优良桑树品种和野生构树为亲本， 利用构树桑树雌雄异株的特性， 选用雌构树为母本进行套袋， 父本桑树的花粉采集于初花期， 取出花药于干燥处晾干， 待花。

14、 药开裂、 花粉散出后将花药用纸包好， 放在底层有干燥剂的干燥器中储存。 在构树品种始花 至终花、 柱头上出现粘液时， 分 2 次 3 次授粉 （用毛笔挑花粉散点于带粘液的柱头上） ， 授 粉后每隔一天对杂交果喷施激素 （50mg/L-100mg/lGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA） 2 周后 , 获 得杂交果 ； 0009 b. 杂交果的愈伤组织诱导 0010 取回杂交果经流水冲净后， 先在 0.1% 新洁尔灭 （5%） 溶液中浸泡 30 min， 然后用 说 明 书 CN 103168676 B 4 2/4 页 5 0.1% 升汞消毒 8 10min ， 再用无菌水洗 3 次。

15、 4 次。将消毒后的杂交果， 放在超净工作 台上除去果实外绒毛， 切成 1/2-1/4 大小并保留 0.5cm-0.8cm 叶柄。再将切好的果子切割 面朝下水平放入到杂交果愈伤组织诱导培养基中， 置于 20001X 光照 10hr/d， 25条件下培 养。20 天 -25 天果实发生膨大并在果实中心处或切面出现紧密的乳白色团状愈伤组织 ； 0011 所述杂交果的愈伤组织诱导培养基配方为 ： MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 琼脂 ， pH5.8 ； 0012 c杂交果愈伤组织的秋水仙素处理 0013 。

16、当杂交果愈伤组织生长到40天-45天时， 将愈伤组织置于添加500mg/L750mg/ L 秋水仙素， 不加琼脂的杂交果愈伤组织加倍培养液中， 放在温室 （26） 摇床上， 在 100 转 120 转 / 分钟的速度下旋转培养处理 48hr 60hr ； 0014 所述加倍培养基配方为 ： MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L-0.5mg/L NAA +500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 蔗糖 ， pH5.8 ； 0015 d处理后愈伤组织的恢复培养 0016 杂交果愈伤组织加倍处理完毕， 取出愈伤组织经无菌水冲洗和吸干表面水分后， 接种到杂交。

17、果愈伤组织诱导培养基上， 恢复培养 7 天 ； 0017 e愈伤组织分化出芽苗 0018 经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养， 15 天 -20 天后愈伤组织出 现绿芽， 25 天 -35 天后陆续分化出芽苗， 并可见丛苗出现 ； 0019 所述分化培养基配方为 ： MS + 2.0mg/L3.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L-0.3mg/L NAA + 3% 蔗糖 + 0.75% 琼脂 ,pH5.8 ； 0020 f芽苗分化出根 0021 当芽苗分化生长到 2.0cm-5.0cm 高时， 将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培 养基中， 25 天 -30 天后芽苗基部分化出。

18、根而形成完整的组织培养植株 ； 0022 所述生根培养基配方为 :1/2 MS +0.1mg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA + 2% 蔗糖 + 0.75% 琼脂， pH5.8 0023 g组培植株的移植 0024 当组培植株生长到 8.0cm-12.0cm 高、 具有 1 条 3 条根的时候， 将进行组培植株 的移植， 首先将要移植植株的培养瓶盖打开， 每瓶添加 10ml 15ml 无菌水， 放到常温的实 验室内缓苗 2 天， 然后充分清洗掉植株根部的培养基， 将植株移栽到灭菌的 70% 蛭石 +15% 细砂 +15% 园土的基质中， 浇上 1/10。

19、MS 大量元素溶液， 盖上薄膜和黑网 （50% 遮光率） ； 然后 每2天喷洒1/10MS大量元素溶液， 直至植株成活， 再逐步揭开黑网和薄膜， 使组培苗健壮生 长 ； 0025 h成活植株的比较观察与选择 0026 根据杂种植株和亲本植株外部形态的差异， 选取叶片上面光滑无毛， 下面沿叶脉 疏生毛形似桑树的植株为初选杂合体株， 再将杂合体叶片和亲本叶片的 DNA 提取出来 , 采 用SSR分子标记对其进行序列比对， 即使用同一SSR引物对杂种和亲本基因组体外扩增， 将 扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 比较杂种和亲本基因组标记序列相似度， 结果被测 植株显示两个亲本植物的标记而确定为构桑杂。

20、种 ； 经根尖染色体检查区分二倍体杂种和多 倍体杂种 ； 说 明 书 CN 103168676 B 5 3/4 页 6 0027 i. 选株经无性扩繁成稳定品种 （系） 0028 将已确定为构树桑树杂种 （2X,4X） 的单株生长到 80cm-100cm 时截取枝条， 按每茎 段含 3 个芽作为繁殖茎段， 于立春后的 3 天 -15 天内插植于苗床上进行无性扩繁， 而成为稳 定的杂合体构树桑树品种 （系） 。 0029 经上述步骤选育的多倍体构树桑树杂种品种 （系） 具有几种优良效果 ： 0030 1. 利用杂交果诱导愈伤组织， 诱导频率高， 而且能够在培养基中生长， 吸收营养 快， 生长速度。

21、快。 0031 2. 用杂交果愈伤组织进行染色体加倍， 诱导效果比整体小苗处理效果好， 而且再 分化出苗后产生嵌合体的频率低。 0032 3. 通过生殖工程技术培育的远缘杂种具有主干明显， 材质优良， 适应性极强， 极耐 干旱、 瘠薄和湿热， 少有病虫害的显著优势， 因此在木材加工和高档家具市场极具潜力， 拥 有的广阔的市场前景 ； 0033 4. 远缘新杂种多倍体化后韧皮纤维发达， 枝干粗壮， 枝叶繁茂既具有抗折断、 荫蔽 面积大的优势， 又是非常优良的行道树种， 在行道园林上有很大的推广价值 ； 0034 5. 远缘杂交多倍体品种蛋白质含量高， 是十分理想的饲料工业原料， 杂种可能出 现不。

22、育现象而无果不会被鸟类所取食， 具有很好的经济价值和环境保护效果。 附图说明 0035 图 1 为本发明杂交果图片 ； 0036 图 2 为本发明杂交果培养产生的乳白色团状愈伤组织图片 ； 0037 图 3 为本发明杂交果愈伤组织分化出芽图片 ； 0038 图 4 为本发明杂交果愈伤组织分化出丛芽图片 ； 0039 图 5 为本发明芽分化出根成完整构树桑树杂交苗图片。 具体实施方式 0040 下面以实施例对本发明进一步说明 ： 0041 a. 远缘杂种果实的获得 0042 选择湖北省农科院桑树种质资源库中优良桑树品种鄂桑2号、 湖桑32号和在中国 农科院油料所中的野生构树 GSf-01 为亲本。

23、， 利用构树桑树雌雄异株的特性， 以构树为母本 进行套袋处理 ； 父本桑树花粉采集于初花期， 取出花药于干燥处晾干， 待花药开裂、 花粉散 出后将花药用纸包好， 放在有生石灰的干燥器中储存。在构树 GSf-01 始花至终花、 柱头上 出现粘液时， 分 3 次授粉 （用毛笔挑花粉散点于带粘液的柱头上） ， 授粉后每隔一天对杂交 果喷施激素液 2 周， 获得杂交果 （附图片 1） ； 0043 b. 杂交果的愈伤组织诱导 0044 取回杂交果经流水冲净后， 先在 0.1% 新洁尔灭 （5%） 溶液中浸泡 30 min， 然后用 0.1% 升汞消毒 10min ， 再用无菌水洗 4 次。将消毒后的杂。

24、交果， 放在超净工作台上除去果 实外绒毛， 切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm叶柄。 再将切好的果子切割面朝下水平放 入到杂交果愈伤组织诱导培养基中， 置于 20001X 光照 10hr/d， 25条件下培养。20 天 -25 天果实发生膨大并在果实中心处或切面出现紧密的乳白色愈伤组织 （附图片 2） ； 所述杂交 说 明 书 CN 103168676 B 6 4/4 页 7 果的愈伤组织诱导培养基配方为 ： MS +2.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 琼脂 ， pH5.8 ； 0045 c杂交果愈伤组织的秋水仙素处理 0046。

25、 当 杂 交 果 愈 伤 组 织 生 长 到 40 天 45 天 时， 将 愈 伤 组 织 置 于 MS+2.0mg/ L6-BA+0.1mg/LNAA+750mg/L 秋水仙素 +4% 蔗糖， pH5.8， 不加琼脂的杂交果愈伤组织加倍培 养液中， 放在温室 （26） 摇床上， 在 100 转 / 分钟的速度下旋转培养 48hr ； 0047 d处理后愈伤组织的恢复培养 0048 杂交果愈伤组织加倍处理完毕， 取出愈伤组织经无菌水冲洗和表面水分后， 接种 到杂交果愈伤组织诱导培养基上， 恢复培养 7 天 ； 0049 e愈伤组织分化出芽苗 0050 经恢复培养的愈伤组织接种到 MS+3.0m。

26、g/L6-BA+0.1mg/LNAA +3% 蔗糖 +0.75% 琼 脂 ,pH5.8 的分化培养基中分化培养。15 天 -20 天后愈伤组织出现绿芽附图片 3， 25 天 -35 天后陆续分化出芽苗， 并可见丛苗出现 （附图片 4） ； 0051 f芽苗分化出根 0052 当芽苗分化生长到 2.0cm-5.0cm 时， 将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培养 基 （1/2MS+0.3mg/LNAA+1mg/L IBA+2% 蔗糖 +0.75% 琼脂， pH5.8） 中， 25 天 -30 天后芽苗基 部分化出根而形成完整的组织培养植株 （附图片 5） ； 0053 g组培植株的移植 0054。

27、 当组培植株生长到8.0cm12.0cm高， 具有1条3条的时候， 将进行组培植株的 移植， 首先将要移植植株的培养瓶盖打开， 每瓶添加 15ml 无菌水， 放到常温的实验室内缓 苗 2 天， 然后充分清洗掉植株根部的培养基， 将植株移栽到灭菌的 70% 蛭石 +15% 细砂 +15% 园土的基质中， 浇上 1/10MS 大量元素溶液， 盖上薄膜和黑网 （50% 遮光率） 。然后每 2 天喷 洒 1/10MS 大量元素溶液， 直至植株成活， 再逐步揭开黑网和薄膜， 使组培苗健壮生长 ； 0055 h成活植株的比较观察与选择 0056 根据杂种植株和亲本植株外部形态的差异， 选取叶片上面光滑无毛。

28、， 下面沿叶脉 疏生毛形似桑树的植株为初选杂合体株， 再将杂合体叶片和亲本叶片的 DNA 提取出来采用 SSR 分子标记对其进行序列比对， 将扩增产物经 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 所得结果显 示被测植株表现出父母本特有谱带的确定为构桑杂种 ； 经根尖染色体检查区分二倍体杂种 和多倍体杂种 ； 0057 i. 选株经无性扩繁成稳定品种 （系） 0058 将已确定为构树桑树杂种 （2X,4X） 的单株生长到 80cm-100cm 时截取枝条， 按每茎 段含 3 个芽作为繁殖茎段， 于立春后的 3 天 -15 天内插植于苗床上进行无性扩繁， 而成为稳 定的构树桑树杂种品种 （系） 。 说 明 书 CN 103168676 B 7 1/5 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103168676 B 8 2/5 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103168676 B 9 3/5 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103168676 B 10 4/5 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103168676 B 11 5/5 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103168676 B 12 。