野生水麻叶提取物及其新用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810332312.0 (22)申请日 2018.04.13 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市雁塔区长延堡 办长安南路199号 (72)发明人 李建科 王国良 侯晨 (74)专利代理机构 西安佩腾特知识产权代理事 务所(普通合伙) 61226 代理人 曹宇飞 (51)Int.Cl. A23L 33/105(2016.01) (54)发明名称 野生水麻叶提取物及其新用途 (57)摘要 本发明涉及野生水麻叶提取物， 其是以野生 水麻叶为原料经干燥、。

2、 粉碎、 超声波辅助溶剂萃 取、 过滤、 离心、 减压蒸馏、 大孔树脂吸附和解吸 附、 减压蒸馏、 真空冷冻干燥制得， 本发明的野生 水麻叶提取物中特定多酚含量高， 富含绿原酸、 咖啡酸等酚酸物质， 尤其是绿原酸含量丰富， 是 一种具有较高生物活性的天然活性产物， 可作为 在制备抗氧化功能的保健食品和预防癌细胞增 殖的保健食品的有效成分， 可应用于食品及生物 药物领域， 并具有很好应用前景。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 108634309 A 2018.10.12 CN 108634309 A 1.野生水麻叶提取物在制备用于以下的组合物中的用途： (1)抗氧化功能的保健食品； 。

3、或 (2)预防癌细胞增殖的保健食品。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述野生水麻叶提取物包含没食子酸、 原儿 茶酸、 表没食子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶 素、 没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。 3.如权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于 70， 以干重计， 每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20， 咖啡酸含量不少于 10， 原儿茶酸含量不少于10。 4.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述野生水麻叶提取物通过以下方法制备： (1)水麻叶。

4、预处理 将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干， 用粉碎机粉碎， 过80120目筛， 得到水麻叶 粉末； (2)超声波提取 将步骤(1)的水麻叶粉末装入容器内， 加入提取溶剂， 水麻叶粉末与提取溶剂的质量比 为1： 2035， 升温至3070， 用超声波发生器功率为50250W的超声波处理2050分钟， 收集提取液； (3)提取物浓缩、 纯化 将提取液用纱布过滤， 离心机15004000转/分钟离心处理1030分钟， 4050减压 蒸馏， 再用大孔树脂纯化， 得到纯化的野生水麻叶提取物。 5.一种野生水麻叶提取物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)水麻叶预处理 将新鲜的野生水麻叶于室。

5、温条件下阴干， 用粉碎机粉碎， 过80120目筛， 得到水麻叶 粉末； (2)超声波提取 水麻叶粉末装入容器内， 加入提取溶剂， 水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1： 2035， 升温至3070， 用超声波发生器功率为50250W的超声波处理2050分钟， 收集提取液； (3)提取物浓缩 步骤(2)的提取液过100250目纱布过滤， 收集滤液， 用离心机15004000转/分钟离 心1030分钟， 收集上清液， 在4050减压蒸馏回收提取溶剂， 得水麻叶提取物浓缩液； (4)提取物纯化 将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化， 真空冷冻干燥， 得到纯化的野生水 麻叶提取物。 6.根据权利。

6、要求5所述的野生水麻叶提取物的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(2)的 提取溶剂为水或体积浓度为30100乙醇或体积浓度为30100甲醇或丙酮或水与乙 醇的混合液或水与甲醇的混合液。 7.根据权利要求5所述的野生水麻叶提取物的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(4)具 体为： 将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过型号为D160或HP-10或D101B或LSA-10或X-5或 XDA-6或LSA-5B的大孔树脂进行纯化， 吸附条件为： 上样液总酚浓度为0.52.5mg/mL、 上样 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108634309 A 2 液pH值为2.58.5、 上样温度2535、。

7、 上样流速为16BV/h； 解吸附条件为： 30100乙 醇溶液作脱附剂， 洗脱流速13BV/h， 将所得解吸附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干燥， 得到水麻叶提取物纯化产品。 8.一种通过权利要求57任一项所述的方法所制备的野生水麻叶提取物。 9.根据权利要求8所述的野生水麻叶提取物， 其特征在于， 所述野生水麻叶提取物包含 没食子酸、 原儿茶酸、 表没食子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食 子酸酯、 表儿茶素、 没食子儿茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多 种。 10.根据权利要求9所述的野生水麻叶提取物， 其特征在于， 所述野生水麻叶提取物中。

8、 总酚含量不少于70， 以干重计， 每100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20， 咖 啡酸含量不少于10， 原儿茶酸含量不少于10。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108634309 A 3 野生水麻叶提取物及其新用途 技术领域 0001 本发明属于食品与生物医药技术领域， 特别涉及一种天然野生水麻叶提取物及其 在抗氧化和预防癌细胞增殖等方面的新用途。 背景技术 0002 水麻(Debregeasia orientalis C.J.Chen)， 别名： 柳莓或水马桑、 比满(苗族名)、 水麻柳、 水苏麻， 荨麻科水麻属， 沟边木、 假密蒙、 折骨藤、 水细麻、 水玄麻。 药。

9、材基源为荨麻 科植物大叶苎麻的全草， 主以茎皮、 叶入药。 清热利湿， 止血解毒， 主治小儿急惊风， 风湿关 节痛， 咳血， 痈疖肿毒。 水麻根或根皮名为冬里麻根， 水麻根常入药， 有祛风、 透疹、 活血、 化 癖的功能， 药性微苦、 辛， 平。 具有祛风除湿， 活血消肿的功效； 主治风湿痹痛， 跌打骨折， 疮 痈肿毒等。 水麻的叶子可以用做饲料， 或者入药， 民间将叶子晒干用做草药， 具有解热、 活 血、 止血、 利湿等多种功效。 水麻主要分布区在我国四川、 云南， 陕西南部等地山区， 秦岭南 坡是水麻分布的最北限， 主要呈野生自然分别， 未得到开发利用。 0003 目前对水麻的研究很少。 。

10、刘睿等人以长叶水麻的干燥茎皮为实验原料， 分离出没 食子酸、 3,5-二甲氧基没食子酸-4-O- -D-吡喃葡萄糖苷和(-)-表儿茶素三个酚酸化合物， 并测试了这三个化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的抗肿瘤活性， 发现没食子酸在12.5 g/mL时对tsFT210细胞有抑制作用。 肖艳华等人从水麻地上部分95乙醇提取物中分离得 到18个化合物， 主要为酚酸类、 三萜类、 甾体、 黄酮醇、 黄酮醇苷及长链脂肪酸类化合物等， 包括表儿茶素、 儿茶素和槲皮素等， 所得提取物具有较强的ACE抑制活性。 0004 目前植物多酚的提取方法主要有有机溶剂萃取法、 超临界流体萃取法和制备型高 效液相色谱分。

11、离技术等， 辅助提取技术主要有超声波及微波等方法的应用。 对提取物的纯 化方面， 大孔树脂纯化技术已得到广泛应用。 由于其成本低、 选择性好、 吸附容量大、 易再 生、 吸附速度快、 洗脱容易等优点， 使其成为适合工业生产的分离纯化技术。 但关于超声波 辅助提取水麻叶多酚尚未见报道， 也未见关于大孔树脂纯化水麻叶提取物的报道， 更未见 水麻叶提取物在抗氧化及抗癌方面新用途的报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种野生水麻叶提取物及其在抗氧化及预防癌细胞增殖 的保健食品中的新用途。 0006 本发明所采用的技术方案是： 0007 该野生水麻叶提取物在制备用于以下的组合物中的用途： 0。

12、008 (1)抗氧化功能的保健食品； 0009 (2)预防癌细胞增殖的保健食品。 0010 进一步限定， 所述野生水麻叶提取物包含没食子酸、 原儿茶酸、 表没食子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素、 没食子儿茶素没食子 酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。 说 明 书 1/7 页 4 CN 108634309 A 4 0011 再进一步限定， 所述野生水麻叶提取物中总酚含量不少于70， 以干重计， 每 100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20， 咖啡酸含量不少于10， 原儿茶酸含量 不少于10。 0012 进一步限定， 所述野。

13、生水麻叶提取物通过以下方法制备： 0013 (1)水麻叶预处理 0014 将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干， 用粉碎机粉碎， 过80120目筛， 得到水 麻叶粉末； 0015 (2)超声波提取 0016 将步骤(1)的水麻叶粉末装入容器内， 加入提取溶剂， 水麻叶粉末与提取溶剂的质 量比为1： 2035， 升温至3070， 用超声波发生器功率为50250W的超声波处理2050 分钟， 收集提取液； 0017 (3)提取物浓缩、 纯化 0018 将提取液用纱布过滤， 离心机15004000转/分钟离心处理1030分钟， 4050 减压蒸馏， 再用大孔树脂纯化， 得到纯化的野生水麻叶提取物。 0。

14、019 一种野生水麻叶提取物的制备方法， 包括以下步骤： 0020 (1)水麻叶预处理 0021 将新鲜的野生水麻叶于室温条件下阴干， 用粉碎机粉碎， 过80120目筛， 得到水 麻叶粉末； 0022 (2)超声波提取 0023 水麻叶粉末装入容器内， 加入提取溶剂， 水麻叶粉末与提取溶剂的质量比为1： 20 35， 升温至3070， 用超声波发生器功率为50250W的超声波处理2050分钟， 收集提 取液； 0024 (3)提取物浓缩 0025 步骤(2)的提取液过100250目纱布过滤， 收集滤液， 用离心机15004000转/分 钟离心1030分钟， 收集上清液， 在4050减压蒸馏回收。

15、提取溶剂， 得水麻叶提取物浓缩 液； 0026 (4)提取物纯化 0027 将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化， 真空冷冻干燥， 得到纯化的野 生水麻叶提取物。 0028 进一步限定， 所述步骤(2)的提取溶剂为水或体积浓度为30100乙醇或体积浓 度为30100甲醇或丙酮或水与乙醇的混合液或水与甲醇的混合液。 0029 进一步限定， 所述步骤(4)具体为： 将步骤(3)的水麻叶提取物浓缩液过型号为 D160或HP-10或D101B或LSA-10或X-5或XDA-6或LSA-5B的大孔树脂进行纯化， 吸附条件为： 上样液总酚浓度为0.52.5mg/mL、 上样液pH值为2.58.5。

16、、 上样温度2535、 上样流速 为16BV/h； 解吸附条件为： 30100乙醇溶液作脱附剂， 洗脱流速13BV/h， 将所得解吸 附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干燥， 得到水麻叶提取物纯化产品。 0030 一种通过上述的方法所制备的野生水麻叶提取物。 0031 进一步限定， 该野生水麻叶提取物包含没食子酸、 原儿茶酸、 表没食子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素、 没食子儿茶素没食子 说 明 书 2/7 页 5 CN 108634309 A 5 酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种。 0032 再进一步限定， 所述野生水麻叶提取物中。

17、总酚含量不少于70， 以干重计， 每 100mg野生水麻叶提取物中绿原酸含量不少于20， 咖啡酸含量不少于10， 原儿茶酸含量 不少于10。 0033 本发明的野生水麻叶提取物是以野生水麻叶为原料利用超声提取、 减压蒸馏浓 缩、 大孔树脂纯化的方法制得， 其制备工艺步骤简便、 提取率高、 产品纯度高、 提取时间短、 生产成本低， 而且所得产品中绿原酸、 咖啡酸、 原儿茶酸等酚酸物质含量高， 具有较强的生 物活性， 可作为抗氧化功能的保健食品和预防癌细胞增殖的保健食品的有效成分， 具有良 好的抗氧化及抑制癌细胞活性， 可应用于食品及生物药物领域， 该技术首次提出对野生水 麻叶进行开发利用， 可促。

18、进野生植物资源的开发和利用， 使农业、 林业及药业等增值增效， 具有很好应用前景。 附图说明 0034 图1为野生水麻叶提取物中多酚类化合物的HPLC色谱图， (图1中A为水麻叶提取物 色谱图， B为多酚标准品色谱图， 1代表没食子酸； 2代表原儿茶酸； 3代表表没食子儿茶素； 4 代表(+)-儿茶素； 5代表咖啡酸； 6代表绿原酸； 7代表表没食子儿茶素没食子酸酯； 8代表表 儿茶素； 9代表没食子儿茶素没食子酸酯； 10代表表儿茶素没食子酸酯)。 0035 图2为不同浓度的野生水麻叶提取物使A549肺癌细胞的凋亡形态与对照。 0036 图3为不同浓度的野生水麻叶提取物使Hela宫颈癌细胞的。

19、凋亡形态与对照。 具体实施方式 0037 现结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步说明。 0038 新鲜水麻叶： 采摘自陕西省略阳山区， 水麻种属由陕西师范大学生命科学学院植 物分类学教授田先华鉴定。 0039 本发明的野生水麻叶提取物通过下述的方法制得： 0040 (1)水麻叶预处理 0041 将新鲜野生水麻叶置于室温(2528)条件下阴干， 用粉碎机粉碎， 过80120目 筛， 得到水麻叶粉末。 0042 (2)超声波提取 0043 水麻叶粉末装入容器内， 加入提取溶剂， 升温至3070， 利用超声波发生器超声 处理一定时间， 收集提取液。 0044 (3)提取物浓缩 0045 将提。

20、取液用35层100250目纱布过滤， 收集滤液， 用离心机离心一定时间， 收集 上清液， 在一定温度下减压蒸馏回收提取溶剂， 得水麻叶提取物浓缩液。 0046 (4)提取物纯化 0047 将水麻叶提取物浓缩液过大孔树脂纯化， 吸附： 上样液总酚浓度为0.52.5mg/ mL、 上样液pH值为2.58.5、 上样温度2535、 上样流速为16BV/h； 解吸附： 30100 乙醇溶液作脱附剂， 洗脱流速13BV/h， 将所得解吸附液浓缩回收乙醇后进行真空冷冻干 燥， 得到水麻叶提取物纯化产品。 说 明 书 3/7 页 6 CN 108634309 A 6 0048 用上述方法的各实施例的工艺条件。

21、及所得产率如表1所示。 0049 表1为各实施例的工艺条件及对应野生水麻叶提取物的产率 0050 0051 0052 从表1的可以看出， 本发明各实施例的野生水麻叶提取物的得率在10以上， 且野 生水麻叶提取物中的总酚含量均在70以上。 0053 上述各实施例只是示例， 并非穷举， 在步骤(2)中， 超声提取所用提取溶剂可以是 上述的水或体积浓度为30100乙醇或体积浓度为30100甲醇或丙酮， 任意一种均 可， 还可以是水与体积浓度为30100乙醇的混合液或水与体积浓度为30100甲醇的 混合液， 对于提取液的选择， 甲醇提取为效果最佳。 说 明 书 4/7 页 7 CN 108634309。

22、 A 7 0054 此外， 对于步骤(4)所用的大孔树脂， 除了上述实施例列举的D160、 HP-10、 D101B、 LSA-10、 LSA-5B型号之外， 还可以采用X-5、 XDA-6型号的大孔树脂， 只是不同树脂型号的吸 附、 解吸特性不同， 对纯化物的总多酚含量会产生影响， 参见下表2。 0055 表2七种大孔树脂静态吸附和解吸特性及其提取纯化物总多酚含量分析 0056 0057 由表2可见， 以D101B、 D160、 LSA-5B、 HP-10、 X-5、 LSA-10和XDA-6七种大孔树脂纯化 水麻叶提取物多酚， 水麻叶提取纯化物中总酚含量相对较高， 其中LSA-5B大孔树脂。

23、对水麻 叶提取物多酚有最大吸附率和最大解吸附率， 所得提取纯化物总酚含量最高。 0058 为了了解本发明的野生水麻叶提取纯化物的主要成分， 进行了HPLC分析检测。 0059 材料： 没食子酸、 原儿茶酸、 表没食子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食 子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素、 没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素没食子酸酯标准品： 购自Sigma公司， 纯度98。 0060 试剂： 甲醇、 乙腈、 三氟乙酸等色谱用试剂为色谱纯， 其他试剂均为分析纯。 0061 进一步分析， 用高效液相色谱法对本发明制备所得水麻叶提取物中多酚组成进行 了分析。 色谱条件： 色谱系统为L。

24、C-20AR高效液相色谱系统； 色谱柱为InertSustain C18柱 (4.6mm i.d.250mm， 5mm， 岛津， 日本)； 用0.1TFA(三氟乙酸)和20甲醇作为流动相A， 乙腈作为流动相B， 流速为0.8mL/min。 梯度程序设定如下： 030min， 03B； 3060min， 3 5B； 6080min， 57B， 8090min， 710B， 在278nm处检测吸收峰。 每个样品和标 准品溶液的进样量为10 L， 柱温为30。 结果参见图1。 0062 由图1可见， 野生水麻叶提取物中多酚的组成成分包括： 没食子酸、 原儿茶酸、 表没 食子儿茶素、 (+)-儿茶素、。

25、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素、 没食子 儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯等， 其中绿原酸是水麻叶提取物中含量最高的活 性成分， 其次是咖啡酸， 再次是原儿茶酸。 可见水麻叶提取物富含多种酚酸物质， 具有较强 的生物活性。 0063 以实施例5所得产品为例， 进一步确定中野生水麻叶提取物中多酚的组成成分各 物质含量如下表3所示。 0064 表3水麻叶提取物多酚组成成分及含量分析结果 说 明 书 5/7 页 8 CN 108634309 A 8 0065 0066 0067 用同样的方法对上述实施例14的野生水麻叶提取物进行分析， 其多酚的组成成 分跟上述结果相似。

26、。 在本发明的野生水麻叶提取物中， 包含有没食子酸、 原儿茶酸、 表没食 子儿茶素、 (+)-儿茶素、 咖啡酸、 绿原酸、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 表儿茶素、 没食子儿 茶素没食子酸酯以及表儿茶素没食子酸酯中的至少一种或多种的组合， 此外， 以干重计， 每 100mg本发明的野生水麻叶提取物中包含： 绿原酸不少于20， 咖啡酸不少于10， 原儿茶 酸不少于10。 可见水麻叶提取物富含多种酚酸物质， 其是绿原酸含量丰富， 是一种具有较 高生物活性的天然活性产物， 在食品及生物医药领域具有良好的应用前景。 0068 进一步对本发明的野生水麻叶提取物(简称水麻叶提取物)进行了功能活性测试， 各种。

27、测试如下： 0069 1、 野生水麻叶提取物抗氧化及清除自由基作用 0070 表4水麻叶提取物总还原力测定 0071 0072 表5水麻叶提取物清除羟基自由基能力测定 0073 说 明 书 6/7 页 9 CN 108634309 A 9 0074 0075 表6水麻叶提取物清除DPPH自由基能力测定 0076 0077 表7水麻叶提取物清除ABTS自由基能力测定 0078 0079 由表4、 5、 6、 7可见， 本发明的野生水麻叶提取物的总还原力强于维生素C， 虽然野 生水麻叶提取物的清除羟基自由基的能力要弱于维生素C， 但野生水麻叶提取物的清除 DPPH自由基和ABTS自由基的能力要强于。

28、维生素C。 由此可见， 本发明的野生水麻叶提取物具 有较强的抗氧化和清除自由基活性， 可作为抗氧化功能的保健食品的有效成分之一， 制备 抗氧化功能的保健食品。 0080 2、 野生水麻叶提取物对人非小肺癌A549细胞及人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作 用， 参见下表8和图2和图3， 图2为不同浓度水麻叶提取物对A549肺癌细胞的凋亡形态， 图3 为不同浓度水麻叶提取物对Hela宫颈癌细胞的凋亡形态。 0081 表8水麻叶提取物对A549细胞、 Hela细胞的增殖抑制作用 0082 0083 结合表8与图2、 3可见， 水麻叶提取物在100-400 g/mL浓度范围内可有效诱导人非 小肺癌A549细胞、 人宫颈癌Hela细胞凋亡， 且诱导凋亡作用呈剂量依赖性。 此外， 水麻叶提 取物可导致A549人肺癌细胞和Hela人宫颈癌细胞形态发生明显的凋亡变化， 出现细胞变 形、 细胞核深染、 缩小、 染色质边聚等癌细胞凋亡特征， 因此本发明的野生水麻叶提取物还 可在制备预防和抑制癌细胞增殖的保健食品中作为有效成分， 起到预防和抑制癌细胞增殖 的作用。 说 明 书 7/7 页 10 CN 108634309 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 108634309 A 11 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 108634309 A 12 。