一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖技术.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103718964 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103718964 A (21)申请号 201310725609.0 (22)申请日 2013.12.25 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 吉首大学 地址 416000 湖南省湘西土家族苗族自治州 吉首市人民南路 120 号 (72)发明人 田宏现 (54) 发明名称 一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖技术 (57) 摘要 本发明公开了一种组织培养式峨眉双蝴蝶的 种子繁殖方法， 该方法包括 （1） 幼苗的获得和培 养 ；（2） 生根培养 ；（3） 炼苗移栽。本发明采用组 培的方式进行峨。

2、眉双蝴蝶的人工育苗更有利于苗 种的规模化、 标准化和工厂化生产， 同时提高了出 芽的整齐度和成活率 ； 本发明采用种子连同胎座 一起进行培养的新技术， 种子发芽率在 99% 以上， 并且出芽非常整齐和一致， 从接种到苗高 5 厘米， 4-5 片叶只要 4-5 个月， 成苗率可达 90% 以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103718964 A CN 103718964 A 1/1 页 2 1. 一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖方法， 其特征在于包含以下几个。

3、步骤 ： （1） 幼苗的获得和培养 ： 每年 12 月至次年 2 月采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害 的紫红色果实， 先用自来水洗净， 后用饱和洗衣粉溶液漂洗 5-6 分钟， 再用自来水流水冲洗 20-30分钟， 滤干水， 放在干净组培瓶中带入无菌室， 在超净工作台上用75%的乙醇浸50-60 秒后， 转入 0.1% 的升汞溶液中浸泡 16-20 分钟， 其间不断地摇动， 以便充分杀菌 ； 升汞溶液灭菌后， 用无菌水反复冲洗， 打开干燥的无菌滤纸本， 夹于滤纸本中， 打开滤 纸本用无菌解剖刀和镊子， 剥除紫红色外果皮， 露出白色棒状的胎座， 用刀轻轻将胎座纵向 切开， 露出芝麻大小紫黑色的种子。

4、， 种子在胎座内纵向排列成 4 行， 用刀沿种子排列的纵 缝， 将胎座连同种子切成 4 条， 每条胎座都有一定数量的种子 ； 用镊子将胎座放在萌发培 养基上， 盖上瓶盖， 并用封口膜加强， 22-28条件下， 暗培养至种子萌发， 萌发后每天给予 1500-2500LX 光照， 直至分化长出幼小真叶 ； （2） 生根培养 ： 当有幼小真叶分化出来时， 将小苗连同胎座整块取出， 放在打开的无菌 滤纸本中， 用镊子和小刀把小苗互相分开， 接种于生根壮苗培养基上， 盖上瓶盖， 并用封口 膜加强， 22-28， 每天 1500-2500LX 光强照射 10-20 小时， 培养至苗高 4-5 厘米并有 4。

5、-5 片 真叶 ； （3） 炼苗移栽 ： 先在荫蔽度 70-80% 的塑料大棚内闭瓶炼苗 4-5 天， 再将瓶盖完全旋松， 但不拿开， 炼苗两天， 再开瓶炼苗两天， 然后将苗从瓶中取出， 用水将根部培养基洗干净， 栽 于装有蛭石 ： 红壤土 ： 细河沙的塑料袋中， 每袋栽一株， 其中蛭石、 红壤土和细河沙的比例 为 1:2:2， 并事先用高锰酸钾水溶液处理 ； 栽好后用 0.2%-0.3% 的花宝 3 号水溶液喷雾， 洗净植株表面， 并使基质下沉， 紧密与根 接触， 基质含水量达到 55-60%， 再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内， 大棚内做 40-50 公分高 的支架， 上面覆盖农膜， 使植株。

6、置于农膜的下面， 覆盖农膜 48 小时内， 膜内空气相对湿度控 制在 90%， 温度 25-30， 过高时揭膜调温调湿， 以后逐渐降低空气相对湿度， 15 天后降低到 70%， 此时去掉农膜继续炼苗 20-40 天， 即可起苗定植。 2. 根据权利要求 1 所述峨眉双蝴蝶种子繁殖方法所述的萌发培养基， 其特征在于 ： 萌 发培养基配方为 1/2MS+20% 香蕉提取液 +6-BA2.0mg.L-1+NAA0.2mg. L-1+2% 蔗糖 + 琼脂 6g. L-1。 3. 根据权利要求 1 所述峨眉双蝴蝶种子繁殖方法所述的生根壮苗培养基， 其特征在 于 ： 生根壮苗培养基的配方为花宝3号3g. 。

7、L-1+20%香蕉提取液+IBA0.2mg. L-1+活性碳2g. L-1+2%蔗糖+琼脂6g. L-1， 花宝3号是指美国进口速效复合肥， 氮、 磷、 钾三要素含量比例分 别为 10 30 20。 权 利 要 求 书 CN 103718964 A 2 1/4 页 3 一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖技术 技术领域 0001 本发明涉及一种采用组织培养的器材和方法进行峨眉双蝴蝶种子繁殖的方法。 背景技术 0002 龙胆科植物峨眉双蝴蝶， 喜阴暗潮湿， 常生于海拔500600米的山坡茶树林下和 灌丛中， 其叶、 茎、 根均可入药， 具清肺止咳、 止血、 解毒、 散结的功效， 用于肺结核、 咯血、 肺 脓。

8、疡、 疗疖疮毒、 支气管炎、 败毒抗癌等都有很好的效果。 0003 峨眉双蝴蝶属大宗常用中药材， 是百余种中药的主要原料，本草纲目 中的正品。 但因多年来土地开垦， 畜牧业发展， 及过度采伐等原因， 使其资源遭到严重破坏， 其产量由 过去的26.7万公斤下降到10.75万公斤， 市场价也由每公斤1.7元上升到每公斤28-35元， 89 年已被国家医药部门列入重点发展和保护品种， 多年来因峨眉双蝴蝶繁殖难度大和生长 条件的限制一直未发展成大规模人工生产。近几年来随着医药需求量增加， 也只能少部分 地方小面积栽培。 0004 峨眉黄蝴蝶的种子微小， 近黑色， 椭圆形， 长约 2mm， 宽 1.2-。

9、0.3mm， 每年国庆节前 后开始开花， 果实至元月底前后成熟， 果实长， 种子千粒重 0.95g ， 自然条件下发芽时间长， 极不整齐， 发芽率很低， 发芽率约 1%， 发芽后 6 个月长不出完全的真叶。我们用河沙、 珍珠 岩、 加原产地土壤做了 3 年种子繁殖试验， 最后没有得到一株苗， 说明自然条件下峨眉双蝴 蝶的种子繁殖很难， 它有一个非常明显的无效幼苗期， 制约着峨眉双蝴蝶大规模人工生产。 0005 因此， 为了保护和发展双蝴蝶属的野生资源， 为其人工栽培提供足量的苗木， 开发 高效、 实用的峨眉双蝴蝶种子繁殖技术是十分必要的。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题就是针对峨眉。

10、双蝴蝶在自然条件下发芽率低、 发芽后生 长周期长、 成苗率低的缺陷， 建立一种高效、 实用的峨眉双蝴蝶种子繁殖方法， 为峨眉双蝴 蝶人工栽培提供大量苗木。 0007 本发明包括以下几个步骤 ： （1） 幼苗的获得和培养 ： 每年 12 月至次年 2 月采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害 的紫红色果实， 先用自来水洗净， 后用饱和洗衣粉溶液漂洗 5-6 分钟， 再用自来水流水冲洗 20-30分钟， 滤干水， 放在干净组培瓶中带入无菌室， 在超净工作台上用75%的乙醇浸50-60 秒后， 转入 0.1% 的升汞溶液中浸泡 16-20 分钟， 其间不断地摇动， 以便充分杀菌。 0008 升汞溶液灭菌后。

11、， 用无菌水反复冲洗， 打开干燥的无菌滤纸本， 夹于滤纸本中。打 开滤纸本用无菌解剖刀和镊子， 剥除紫红色外果皮， 露出白色棒状的胎座， 用刀轻轻将胎座 纵向切开， 露出芝麻大小紫黑色的种子， 种子在胎座内纵向排列成 4 行， 用刀沿种子排列的 纵缝， 将胎座连同种子切成 4 条， 每条胎座都有一定数量的种子。用镊子将胎座放在萌发培 养基上， 盖上瓶盖， 并用封口膜加强， 防止瓶内水分挥发和杂菌感染。 0009 所 述 萌 发 培 养 基 的 优 选 配 方 为 ： 1/2MS+20% 香 蕉 提 取 液 +6-BA2.0mg. 说 明 书 CN 103718964 A 3 2/4 页 4 L。

12、-1+NAA0.2mg. L-1+2% 蔗糖 + 琼脂 6g. L-1。 0010 22-28条件下， 暗培养至种子萌发， 萌发后每天给予 1500-2500LX 光照， 直至分 化长出幼小真叶。一般情况下， 种子约 20 天发芽， 约 30 天子叶完全展开， 形成有两片子叶 的无菌峨眉双蝴蝶幼苗， 发芽率 99% 以上， 约 50 天分化出两片幼小真叶。 （2） 生根培养 ： 当有幼小真叶分化出来时， 将小苗连同胎座整块取出， 放在打开的无菌 滤纸本中， 用镊子和小刀把小苗互相分开， 接种于生根壮苗培养基上， 盖上瓶盖， 并用封口 膜加强， 防止瓶内水分挥发和杂菌感染。22-28， 每天 1。

13、500-2500LX 光强照射 10-20 小时， 培养至苗高 4-5 厘米并有 4-5 片真叶。 0011 所述生根壮苗培养基的优选配方为 ： 花宝3号3g. L-1+20%香蕉提取液+IBA0.2mg. L-1+活性碳2g. L-1+2%蔗糖+琼脂6g. L-1， 花宝3号是指美国进口速效复合肥， 氮、 磷、 钾三 要素含量比例分别为 10 30 20。 0012 培养过程中， 10-15 天可见根系大量发生， 50-70 天可长出 4-5 片真叶， 苗高 4.5-5.5 厘米。 0013 （3）炼苗移栽 ： 当苗高 4-5 厘米、 有 4-5 片真叶时进行练苗移栽， 先在荫蔽度 70-8。

14、0% 的塑料大棚内闭瓶炼苗 4-5 天， 再将瓶盖完全旋松， 但不拿开， 炼苗两天， 再开瓶炼 苗两天， 然后将苗从瓶中取出， 用水将根部培养基洗干净， 栽于装有蛭石 ： 红壤土 ： 细河沙 的塑料袋中， 每袋栽一株， 其中蛭石、 红壤土和细河沙的比例为 1:2:2， 并事先用高锰酸钾水 溶液处理。 0014 栽好后用 0.2%-0.3% 的花宝 3 号水溶液喷雾， 洗净植株表面， 并使基质下沉， 紧密 与根接触， 基质含水量达到 55-60%， 再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内， 大棚内做 40-50 公 分高的支架， 上面覆盖农膜， 使植株置于农膜的下面。覆盖农膜 48 小时内， 膜内空气相。

15、对湿 度控制在 90%， 温度 25-30， 过高时揭膜调温调湿， 以后逐渐降低空气相对湿度， 15 天后降 低到 70%， 此时去掉农膜继续炼苗 20-40 天， 即可起苗定植。 0015 本发明的特点是采用组织培养的方式对峨眉双蝴蝶进行种子繁殖育苗， 特别是将 种子连同胎座共同置于培养基上进行出苗的方式， 克服了峨眉双蝴蝶种子出芽非常不整 齐， 成活率低的缺陷， 使得本发明在峨眉双蝴蝶的育苗过程中具有十分重要的实用价值， 本 发明同时也有利于发展和保护峨眉双蝴蝶这一重要中草药植物。 0016 采用组培的方法， 将种子连同胎座共同置于培养基上进行出苗可以克服峨眉双蝴 蝶自然繁殖状态下种子出芽。

16、非常不整齐， 成活率低的缺陷的原因， 我们经研究和分析， 原因 很可能是 ： 在自然状态下， 由于胎座很快坏死和脱落， 并且无法吸收培养基中的养分， 因而 无法产生某种植物激素， 这种植物激素能够使峨眉双蝴蝶种子出芽整齐， 成活率提高 ； 而在 本发明的人工条件下， 其胎座可以吸收培养基中的养分， 从而向种子分离植物激素， 使种子 出芽整齐， 成活率提高。 0017 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 采用组培的方式进行峨眉双蝴蝶的人工 育苗更有利于苗种的规模化、 标准化和工厂化生产， 同时提高了出芽的整齐度和成活率。 采 用本技术， 种子发芽率在 99% 以上， 并且出芽非常整齐和一致。

17、， 从接种到苗高 5 厘米， 4-5 片 叶只要 4-5 个月， 成苗率可达 90% 以上。 具体实施方式 说 明 书 CN 103718964 A 4 3/4 页 5 0018 以下对峨眉双蝴蝶的种子繁殖方法进行详细说明。 0019 实施例 1 ： （1） 幼苗的获得和培养 ： 12 月 22 日采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果 实， 先用自来水洗净， 后用饱和洗衣粉溶液漂洗 5.8 分钟， 再用自来水流水冲洗 22 分钟， 滤 干水， 放在干净组培瓶中带入无菌室， 在超净工作台上用 75% 的乙醇浸 52 秒后， 转入 0.1% 的升汞溶液中浸泡 17 分钟， 其间不断地摇动， 。

18、以便充分杀菌 ； 升汞溶液灭菌后， 用无菌水反复冲洗， 打开干燥的无菌滤纸本， 夹于滤纸本中， 打开滤 纸本用无菌解剖刀和镊子， 剥除紫红色外果皮， 露出白色棒状的胎座， 用刀轻轻将胎座纵向 切开， 露出芝麻大小紫黑色的种子， 种子在胎座内纵向排列成 4 行， 用刀沿种子排列的纵 缝， 将胎座连同种子切成 4 条， 每条胎座都有一定数量的种子 ； 用镊子将胎座放在萌发培养 基上， 盖上瓶盖， 并用封口膜加强， 25条件下， 暗培养至种子萌发， 萌发后每天给予 1600LX 光照， 直至分化长出幼小真叶 ； （2） 生根培养 ： 当有幼小真叶分化出来时， 将小苗连同胎座整块取出， 放在打开的无菌。

19、 滤纸本中， 用镊子和小刀把小苗互相分开， 接种于生根壮苗培养基上， 盖上瓶盖， 并用封口 膜加强， 23， 每天 1800LX 光强照射 12 小时， 培养至苗高 4-5 厘米并有 4-5 片真叶 ； （3） 炼苗移栽 ： 先在荫蔽度 72% 的塑料大棚内闭瓶炼苗 4.5 天， 再将瓶盖完全旋松， 但 不拿开， 炼苗两天， 再开瓶炼苗两天， 然后将苗从瓶中取出， 用水将根部培养基洗干净， 栽于 装有蛭石 ： 红壤土 ： 细河沙的塑料袋中， 每袋栽一株， 其中蛭石、 红壤土和细河沙的比例为 1:2:2， 并事先用高锰酸钾水溶液处理 ； 栽好后用0.21%的花宝3号水溶液喷雾， 洗净植株表面， 。

20、并使基质下沉， 紧密与根接触， 基质含水量达到 57%， 再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内， 大棚内做 43 公分高的支架， 上面 覆盖农膜， 使植株置于农膜的下面， 覆盖农膜 48 小时内， 膜内空气相对湿度控制在 90%， 温 度 26， 过高时揭膜调温调湿， 以后逐渐降低空气相对湿度， 15 天后降低到 70%， 此时去掉 农膜继续炼苗 25 天， 即可起苗定植。 0020 本实施例中生根壮苗培养基的配方为花宝 3 号 3g. L-1+20% 香蕉提取液 +IBA0.2mg. L-1+ 活性碳 2g. L-1+2% 蔗糖 + 琼脂 6g. L-1； 萌发培养基配方为 1/2MS+20% 香。

21、 蕉提取液 +6-BA2.0mg.L-1+NAA0.2mg. L-1+2% 蔗糖 + 琼脂 6g. L-1。 0021 实施例 2 ： （1） 幼苗的获得和培养 ： 1 月 16 日采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果实， 先用自来水洗净， 后用饱和洗衣粉溶液漂洗 5.2 分钟， 再用自来水流水冲洗 27 分钟， 滤干 水， 放在干净组培瓶中带入无菌室， 在超净工作台上用 75% 的乙醇浸 59 秒后， 转入 0.1% 的 升汞溶液中浸泡 19 分钟， 其间不断地摇动， 以便充分杀菌 ； 升汞溶液灭菌后， 用无菌水反复冲洗， 打开干燥的无菌滤纸本， 夹于滤纸本中， 打开滤 纸本用无菌解剖。

22、刀和镊子， 剥除紫红色外果皮， 露出白色棒状的胎座， 用刀轻轻将胎座纵向 切开， 露出芝麻大小紫黑色的种子， 种子在胎座内纵向排列成 4 行， 用刀沿种子排列的纵 缝， 将胎座连同种子切成 4 条， 每条胎座都有一定数量的种子 ； 用镊子将胎座放在萌发培养 基上， 盖上瓶盖， 并用封口膜加强， 27条件下， 暗培养至种子萌发， 萌发后每天给予 2300LX 光照， 直至分化长出幼小真叶 ； （2） 生根培养 ： 当有幼小真叶分化出来时， 将小苗连同胎座整块取出， 放在打开的无菌 说 明 书 CN 103718964 A 5 4/4 页 6 滤纸本中， 用镊子和小刀把小苗互相分开， 接种于生根壮。

23、苗培养基上， 盖上瓶盖， 并用封口 膜加强， 26， 每天 2400LX 光强照射 17 小时， 培养至苗高 4-5 厘米并有 4-5 片真叶 ； （3） 炼苗移栽 ： 先在荫蔽度 79% 的塑料大棚内闭瓶炼苗 4.8 天， 再将瓶盖完全旋松， 但 不拿开， 炼苗两天， 再开瓶炼苗两天， 然后将苗从瓶中取出， 用水将根部培养基洗干净， 栽于 装有蛭石 ： 红壤土 ： 细河沙的塑料袋中， 每袋栽一株， 其中蛭石、 红壤土和细河沙的比例为 1:2:2， 并事先用高锰酸钾水溶液处理 ； 栽好后用0.27%的花宝3号水溶液喷雾， 洗净植株表面， 并使基质下沉， 紧密与根接触， 基质含水量达到 59%， 再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内， 大棚内做 48 公分高的支架， 上面 覆盖农膜， 使植株置于农膜的下面， 覆盖农膜 48 小时内， 膜内空气相对湿度控制在 90%， 温 度 28， 过高时揭膜调温调湿， 以后逐渐降低空气相对湿度， 15 天后降低到 70%， 此时去掉 农膜继续炼苗 34 天， 即可起苗定植。 说 明 书 CN 103718964 A 6 。