一种雪落樱组培快速繁殖方法.pdf

《一种雪落樱组培快速繁殖方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种雪落樱组培快速繁殖方法.pdf（7页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510860385.3 (22)申请日 2015.12.01 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159 号 (72)发明人 王华辰 王贤荣 伊贤贵 张开文 袁长权 (74)专利代理机构 江苏圣典律师事务所 32237 代理人 贺翔 (54) 发明名称 一种雪落樱组培快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明公开了一种雪落樱组培快速繁殖方 法， 包括以下步骤 ： A 叶片、 茎段灭菌， B 不定芽诱 导及增殖， C 抗褐化试验， D 愈伤组织诱导及增殖， E愈伤。

2、组织分化丛芽试验， F壮苗及生根培养， G胚 性愈伤组织诱导及分化试验 ； 采用植物组织培养 的方法繁殖雪落樱， 不仅可以节约大量外汇， 而且 受外界影响较小， 四季皆可进行， 节约育苗占地， 降低成本， 并且保存了母体的全部优良性状及遗 传稳定性。这种快速的繁殖方法在短期内可以进 行大量的试管苗规模化、 工厂化生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105359977 A 2016.03.02 CN 105359977 A 1/1 页 2 1.一种雪落樱组培快速繁殖方法， 其特征在于， 包括以下步。

3、骤 ： 1） 剪取春季雪落樱幼嫩的茎段， 消毒洗净， 剪成带芽茎段， 放入配方为 1/4MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L+6.8 g/L 琼脂 +30 g/L 蔗糖的培养基中， 培养一周后诱导出丛芽 ； 2） 将生长健壮的丛芽块放入配方为 MS+ 6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L +TDZ 0.1 mg/L+6.4 g/L 琼脂 +30 g/L 蔗糖的培养基中培养， 每 25d 继代一次直至培养出小苗 ； 3） 将小苗培养在壮苗培养基 MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L中。

4、， 当单个不定芽生长到1.53 cm规格时， 转入生根培养基3/4MS+NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖 15 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 中， 生根培养 40 d ； 4） 将生长健壮的苗子在培养室中炼苗 35d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽 后适当遮阴， 保持湿度， 移栽成活。 2.一种雪落樱组培快速繁殖方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 取幼嫩叶片， 消毒洗净， 剪成小叶片放入配方为 MS +6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/ L+2,4-D 2.0 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 的培养基中培养， 每 25 天继代一次直。

5、至培 养出愈伤组织 ； 2） 将愈伤组织放入丛芽增殖培养基 MS+6-BA 0.52.0 mg/L+NAA 0.050.2 mg/L+TDZ 0.11.0 mg/L+Vc 20 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 中培养， 每 25 d 继代一次直至培 养出小苗 ； 3） 将小苗培养在配方为 MS+6-BA 0.050.1 mg/L+IBA 0.010.1 mg/L 的壮苗培养基 中， 当单个不定芽生长到 1.53cm 时， 然后转入配方为 3/4 MS+NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖 15 g/ L+ 琼脂 6.4 g/L 的培养基中， 进行生根培养 40 d ； 4）。

6、 将生长健壮的苗子在培养室中炼苗35 d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽 后适当遮阴， 保持湿度， 移栽成活。 3.根据权利要求 2 所述的雪落樱组培快速繁殖方法， 其特征在于， 步骤 2） 中， 丛芽增 殖培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+Vc 20 mg/L+ 琼脂 6.4 g/L+ 蔗糖 30 g/L。 4.根据权利要求 1 或 2 所述的雪落樱组培快速繁殖方法， 其特征在于， 步骤 1） 中， 消毒 洗净的方法为 ： 用洗洁精浸泡 24 min， 用软毛刷轻轻刷除茎段表面的污染物， 再于流水下 冲洗13 h ； 茎。

7、段以75 %的酒精30 s， 用无菌水清洗35次， 然后0.1% HgCl2 10 min， 用无 菌水清洗 58 次。 5.根据权利要求2所述的雪落樱组培快速繁殖方法， 其特征在于， 步骤3） 中， 壮苗培养 基配方为 ： MS+ 6-BA 0.1 mg/L+ IBA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L。 权 利 要 求 书 CN 105359977 A 2 1/4 页 3 一种雪落樱组培快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及植物无性繁殖技术领域， 尤其涉及一种雪落樱组培快速繁殖方法。 背景技术 0002 带芽茎段是目前使用最多的离体快繁外植体， 众多试验。

8、表明樱花以茎段或芽心为 外植体时可成功的诱导出丛生芽。愈伤培养是组织培养中非常常见并且也是重要的环节。 任何外植体均可以通过愈伤组织培养诱导出芽和根。 当外植体为叶片、 叶柄、 花瓣、 花柄、 子 房等只能通过愈伤组织途径培养， 很难直接诱导出丛芽， 这可能与外植体的基因型、 生理状 态、 生长调节剂配比、 培养条件、 继代周期等方面有关， 仍需要进一步深入研究。尤其是褐 化、 污染、 玻璃化是组织培养再生体系建立过程中常见的问题。 0003 雪落樱 （Cerasus xueluoensis C.H.Nan & X.R.Wang） 为蔷薇科樱属矮生樱亚属 新种， 具有极大的观赏价值， 但目前存。

9、在繁殖障碍， 市场无商品苗提供。 发明内容 0004 发明目的 ： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种雪落樱组培快 速繁殖方法， 建立雪落樱的再生体系， 获得优质的雪落樱种苗。 0005 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 一种雪落樱组培快速繁殖方法， 包括以下步骤 ： 1） 剪取春季雪落樱幼嫩的茎段， 消毒洗净， 剪成带芽茎段， 放入配方为 1/4MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L+6.4 g/L 琼脂 +30 g/L 蔗糖的培养基中， 培养一周后诱导出丛芽 ； 2） 将生长健壮的丛芽块放入配方为 MS+ 6-BA 0。

10、.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L +TDZ 0.1 mg/L+6.4 g/L 琼脂 +30 g/L 蔗糖的培养基中培养， 每 25d 继代一次直至培养出小苗 ； 3） 将小苗培养在壮苗培养基 MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L中， 当单个不定芽生长到1.53 cm规格时， 转入生根培养基3/4MS+NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖 15 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 中， 生根培养 40 d ； 4） 将生长健壮的苗子在培养室中炼苗35 d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽 后适当遮阴， 保持湿度， 。

11、移栽成活。 0006 一种雪落樱组培快速繁殖方法， 包括以下步骤 ： 1） 取幼嫩叶片， 消毒洗净， 剪成小叶片放入配方为 MS +6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/ L+2,4-D 2.0 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 的培养基中培养， 每 25 天继代一次直至培 养出愈伤组织 ； 2） 将愈伤组织放入丛芽增殖培养基 MS+6-BA 0.52.0 mg/L+NAA 0.050.2 mg/L+TDZ 0.11.0 mg/L+Vc 20 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 中培养， 每 25 d 继代一次直至培 养出小苗 ； 3） 将。

12、小苗培养在配方为 MS+6-BA 0.050.1 mg/L+IBA 0.010.1 mg/L 的壮苗培养基 中， 当单个不定芽生长到 1.53cm 时， 然后转入配方为 3/4 MS+NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖 15 g/ 说 明 书 CN 105359977 A 3 2/4 页 4 L+ 琼脂 6.4 g/L 的培养基中， 进行生根培养 40 d ； 4） 将生长健壮的苗子在培养室中炼苗35 d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽 后适当遮阴， 保持湿度， 移栽成活。 0007 步骤 2） 中， 丛芽增殖培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05 mg/L+TDZ。

13、 0.1 mg/ L+Vc 20 mg/L+ 琼脂 6.4 g/L+ 蔗糖 30 g/L。 0008 步骤 1） 中， 消毒洗净的方法为 ： 用洗洁精浸泡 24 min， 用软毛刷轻轻刷除茎段表 面的污染物， 再于流水下冲洗 13 h ； 茎段以 75 % 的酒精 30 s， 用无菌水清洗 35 次， 然后 0.1% HgCl2 10 min， 用无菌水清洗 58 次。 0009 步骤 3） 中， 壮苗培养基配方为 ： MS+ 6-BA 0.1 mg/L+ IBA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30 g/ L+ 琼脂 6.4 g/L。 0010 有益效果 ： 与现有的技术相比， 本发明的雪落樱组。

14、培快速繁殖方法， 有效建立出雪 落樱的再生体系， 能快速高效的获得优质种苗， 解决了实生苗生长周期长的问题， 为工厂化 育苗缩短了时间、 提高了效率、 降低了成本， 同时保留了母本的优良性状。研究中发现丛芽 诱导效率较高为 95.38%、 增殖量大， 愈伤组织的诱导与分化成功实现了无菌苗的大量培育， 得出了较佳的培育体系 ； 胚性愈伤组织的诱导及分化初探也得出了较为理想的胚状体。 附图说明 0011 图 1 是茎段培养培养图 ； 图 2 是生根图 ； 图 3 是移栽图 ； 图 4 是愈伤诱导图 ； 图 5 是愈伤增殖图 ； 图 6 愈伤分化图。 具体实施方式 0012 下面结合具体实施例对本发。

15、明做进一步的说明。 0013 实施例 1 一种雪落樱组培快速繁殖方法， 包括以下步骤 ： 1） 茎段芽诱导培养 ： 1） 剪取春季雪落樱幼嫩的茎段， 消毒洗净， 剪成带 1-2 个芽的 1.5 cm 的茎段， 以竖插和横放方式接种到以 MS、 1/2MS、 1/4MS、 改良 MS（硝酸铵减半） 为基本培 养基， 以 6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L 为激素组合的启动培养基中 ； 其中添加 6.4 g/L 琼脂和 30 g/L 蔗糖。结果表明 ： MS、 1/2MS、 1/4MS、 改良 MS 培养基的出芽率分别为 75.35%、 88.46%、 97.75%、 84.9。

16、2%， 其中 1/4MS 培养基出芽时间最短， 在一周左右， 其他 3 种培养基出 芽时间在 13 d 左右， 如图 1 所示。 0014 2） 将生长健壮的丛芽块 （3 5 芽） 作为外植体进行丛芽增殖， 以 MS 为基本培养 基， 以 6-BA（0.5、 1.0、 1.5 mg/L） +IBA（0.01、 0.05、 0.1、 0.2 mg/L） 组合的 12 组培养基和 6-BA（0.5、 1.0、 1.5 mg/L） +NAA（0.05、 0.1、 0.2 mg/L） +TDZ（0.1、 0.5、 1.0 mg/L）组 合 的 9 组培养基中进行丛芽增殖试验， 另外添加琼脂 6.4 g。

17、/L、 碳源 （蔗糖、 葡糖糖、 麦芽糖） 30 g/L。25 天后统计丛芽增殖系数及生长情况。结果表明 ： 在 6-BA 和 IBA 的激素组合中 MS+ 说 明 书 CN 105359977 A 4 3/4 页 5 6-BA 1.5 mg/L+ IBA 0.01 mg/L 的培养基丛芽增殖系数最高， 为 13.71， 但增殖慢， 叶片细 小， 节间短 ； 在6-BA和NAA和TDZ的激素组合中MS+ 6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L +TDZ 0.1 mg/L 的培养基中丛芽增殖系数最高， 为 28.37， 丛芽增殖快速， 新生丛芽多， 叶片狭小， 茎段细弱， 生长。

18、健康。 0015 3） 壮苗及生根培养 ： 将小苗培养在壮苗及生根培养基中， 确定 MS+6-BA 0.1 mg/ L+IBA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 培养基壮苗效果理想， 3/4 MS+NAA 0.1 mg/ L+ 蔗糖 15 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 为最佳的生根培养基。生根率达 100%， 如图 2 所示。采用 1/2 MS 培养基添加 NAA（0.1、 0.5、 1.0 mg/L） ， 生根率最高达 95.56%。采用 1/4 MS 培养基 添加 NAA（0.1、 0.5、 1.0 mg/L） ， 生根率最高达 94.81%。 0016 。

19、4） 试管苗的移栽 ： 移栽前将穴盘和基质高温曝晒灭菌， 将生长健壮的苗子在培养 室中炼苗35 d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽后适当遮阴， 保持湿度， 移栽成活 率达 90%， 如图 3 所示。 0017 实施例 2 一种雪落樱组培快速繁殖方法， 包括以下步骤 ： 1） 愈伤组织诱导培养 ： 取幼嫩叶片流水下冲洗13 h。 以75%酒精30 s， 用无菌水清洗 35 次， 然后 0.1% HgCl2 7 min， 用无菌水清洗 58 次 ； 剪成 1 cm2的大小的小叶片， 边缘刻 伤， 主脉和叶柄处刻伤， 接种于以 MS、 B5、 N6、 WPM 为基本培养基， 激素配比为 6。

20、-BA 1.0 mg/ L+NAA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0mg/L的培养基中， 培养基中均添加6.8 g/L琼脂和30g/L蔗糖， pH5.8， 121， 20 kg/cm2高温高压灭菌 20 min， 培养温度 (252) ， 于黑暗和光下进行 培养， 每 25 天继代一次。结果表明 ： MS 培养基 10 d 后外植体伤口处出现愈伤组织， 生长健 康快速， 呈淡乳白色 ； B5 培养基的出愈率仅次于 MS 培养基， 但愈伤组织质地较 MS 稍硬， 呈 淡黄白色 ； N6 和 WPM 的诱导效果不理想， 外植体褐化较严重， 出愈时间较长。在 MS + 6-BA 1.0 mg/L。

21、+ NAA 1.0 mg/L+ 2,4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.4 g/L的培养基中， 诱导 率达 86% 以上， 如图 4 所示。 0018 2） 愈伤组织的分化 ： 挑选部分生长健康的淡乳白色的愈伤组织接种于含有不同激 素组合的培养基中进行诱导不定芽试验。 以MS为基本培养基， 以6-BA （0.5、 1.0、 2.0 mg/L） + TDZ（0.1、 0.5、 1.0 mg/L） 组合和 6-BA（0.5、 1.0、 2.0 mg/L） + NAA（0.05、 0.1、 0.2 mg/ L） +TDZ（0.1、 0.5、 1.0 mg/L） 组合和 TDZ（0.1。

22、、 0.5、 1.0 mg/L） +NAA（0.05、 0.1、 0.2 mg/ L） 组合的培养基进行不定芽诱导。每组培养基中均添加 6.4 g/L 琼脂、 Vc 20 mg/L、 蔗糖 30g/L， pH 5.8， 121 ， 20 kg/cm2高温高压灭菌 20 min， 培养温度 252， 于光下进行培 养， 25 d继代一次， 置于连续光照下培养， 光照强度约为12.5 molm-2s-1， 光照时间13 h/ d。 结果表明 ： 6-BA+ TDZ组合愈伤组织生长缓慢， 几无芽体分化 ； TDZ+ NAA组合愈伤组织增 殖一般， 无芽分化， 部分褐化 ； 6-BA+ NAA+ TD。

23、Z 组合有明显芽的分化， 在 MS+ 6-BA 0.5 mg/ L+ NAA 0.05 mg/L+ TDZ 0.1 mg/L+ Vc 20 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂6.4g/L的培养基上愈 伤增殖快， 丛芽分化， 生长健壮， 诱导丛芽效果理想， 分化的丛芽生长健壮。培养 50 d 后， 丛 芽长约 1 cm， 增殖系数为 28.37， 如图 5 和图 6 所示。 0019 3） 壮苗及生根培养 ： 将无菌丛芽块或长势柔弱小苗培养在MS+6-BA （0.05、 0.1 mg/ L） +IBA（0.01、 0.05、 0.1 mg/L） 的培养基中进行壮苗生长， 结果表明 ： 当 6-BA。

24、 浓度为 0.05 mg/L， IBA 浓度分别为 0.01、 0.05、 0.1 mg/L 时丛芽无增加， 茎叶短小 ； 当 6-BA 浓度为 0.1 说 明 书 CN 105359977 A 5 4/4 页 6 mg/L， IBA 浓度为 0.01mg/L 时， 丛芽无增加， 茎叶偶有伸长 ； 当 6-BA 浓度为 0.1 mg/L， IBA 浓度为 0.05mg/L 时， 丛芽无增加， 但茎叶伸长变壮 ； 当 6-BA 浓度为 0.1 mg/L， IBA 浓度为 0.1mg/L 时， 丛芽无增加， 仅有部分茎叶伸长变壮。 0020 MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.05 mg。

25、/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.4g/L 培养基壮苗效果理 想。 0021 单个不定芽生长到 1.53 cm 规格时， 转移到以 3/4 MS、 1/2 MS、 1/4 MS 为基本培 养基， NAA（0、 0.1、 0.5、 1.0 mg/L） 或 IBA（0、 0.2、 0.4、 0.6 mg/L） 为激素组合的培养基上 进行生根培养 10-20 d。同时研究蔗糖 （30.0、 20.0、 15.0、 10.0 mg/L） 不同浓度梯度对生根 诱导的影响。结果表明 ： 当基本培养基添加NAA时， 3/4 MS的平均生根率为100%， 生根快且健壮 ； 1/2 MS的平均 生根率 92。

26、.5%， 生根快且健壮 ； 1/4 MS 的平均生根率 90.0%， 生根快， 主根不发达。以 3/4 MS 为基本培养基， 当 NAA 浓度为 0.1 mg/L 时， 生根时间约 9 d， 须根多且发达 ； NAA 为 0.5 mg/ L 时， 生根时间约 9 d， 须根少 ； NAA 为 1 mg/L 时， 生根时间约 8.5 d 主根变粗， 须根少。 0022 当基本培养基添加 IBA 时， 3/4 MS 的平均生根率为 84.5%， 生根快但粘粘 ； 1/2 MS 的平均生根率 83.5%， 生根快但根系粘粘 ； 1/4 MS 的平均生根率 81.6%， 生根一般且无须根。 以 3/4。

27、 MS 为基本培养基， 当 IBA 浓度为 0.2 mg/L 时， 生根时间约 10 d， 须根淡红色 ； 当 IBA 为 0.4 mg/L 时， 生根时间约 10.67 d， 少量须根淡红色 ； 当 IBA 为 0.6 mg/L 时， 生根时间约 10 d， 少量须根淡红色。 0023 3/4MS+ NAA 0.1 mg/L+ 蔗糖 15 g/L+ 琼脂 6.4 g/L 为最佳的生根培养基， 生根率 100%。 0024 4） 生根培养 40 d 后， 去掉茎叶根系均生长健壮小苗的培养瓶上的封口膜， 在培养 室中炼苗35 d， 清洗干净根系间的培养基进行移栽， 移栽后适当遮阴， 保持湿度， 。

28、移栽成活 率达 90%。 0025 实施例 3 将实施例 2 诱导得到的生长健康淡乳白色的愈伤组织接种到含有不同防褐化剂添的 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.4g/L愈伤增殖培养基中共12种组合， 于黑暗条件中培养， 每 25 天继代一次。每个处理作 5 个重复， 每 7 天统计 1 次， 总共统计 3 次。 0026 防褐化剂种类如下 VC（5、 10、 20 mg/L） 、 CA（10、 50、 100 mg/L） 、 AC（100、 500、 800 mg/L） 、 PVP（50、 100、 200 mg/L） 。 0027 结果表明 ： Vc 20mg/L 的防褐化效果较柠檬酸钠 （CA） 理想 ； 比较 2 种吸附剂， PVP 的防褐化效果优于活性炭 （AC） 。 说 明 书 CN 105359977 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 105359977 A 7 。