技术领域
本发明涉及药物-低聚物共轭物，并且更特定地涉及胰岛素药物- 低聚物共轭物。
背景技术
糖尿病——糖代谢的病症，从古代起就是已知的。糖尿病是由于胰 岛素产量不足或对胰岛素的敏感性下降而导致的。胰岛素分子由通过 二硫化物键相连的氨基酸双链所组成(mw 6,000)。胰岛β细胞分泌一种 被称为胰岛素原的单链胰岛素前体。胰岛素原的蛋白水解作用使得除 去了四个碱性氨基酸(在胰岛素原链上的号码为31、32、64和65，其 分别是：Arg、Arg、Lys、Arg)和连接(“C”)多肽。在所得的双链胰 岛素分子中，A链在氨基末端具有甘氨酸，并且B链在其氨基末端具有 苯丙氨酸。
胰岛素可以以单体、二聚物或由三个二聚物所形成的六聚体的形 式存在。该六聚体与两个Zn2+原子配位。生物活性存在于该单体中。虽 然到目前为止几乎仅用牛和猪胰岛素来治疗人的糖尿病，但是种属间 胰岛素的许多差异是已知的。猪胰岛素与人胰岛素最相似，其与人胰 岛素的区别仅在于其在B-链C-末端上具有丙氨酸而不是苏氨酸残基。 尽管有这种差异，大多数哺乳动物胰岛素具有类似的特定活性。到目 前为止，动物提取物提供了用于治疗该疾病的所有胰岛素。重组技术 的出现使得可以大规模制造人胰岛素(例如，HumulinTM胰岛素，其可由 Eli Lilly and Company，Indianapolis，IN商业获得)。
胰岛素对于体内大多数细胞对葡萄糖的正常利用而言是必需的。 对于患有糖尿病的患者而言，其利用葡萄糖的正常能力受到了抑制， 从而使得血糖水平增加(高血糖)。随着葡萄糖在血液内的积聚，尿中 排泄的糖水平过量(糖尿)。糖尿病的其它症状包括尿量和频率增加、 口渴、瘙氧、饥饿、体重下降、和虚弱。
有两种类型的糖尿病。I型是胰岛素-依赖性糖尿病，或IDDM。IDDM 在以前被称为青少年起病型糖尿病。在IDDM中，胰腺不分泌胰岛素， 胰岛素必需由外部来源提供。虽然在一些严重情况中需要使用胰岛 素，但是II型成人起病型糖尿病通常可以通过饮食来进行控制。
在二十世纪二十年代将胰岛素分离出来之前，大多数患者在发病 后短时间内死亡。未进行治疗的糖尿病会导致酮症，脂肪分解的产物— —酮在血液中的积聚；之后会出现伴有恶心和呕吐的酸中毒(酸在血液 中的积聚)。随着紊乱的糖代谢和脂肪代谢的毒性产物的增加，患者陷 入糖尿病昏迷。
糖尿病的治疗一般需要规律注射胰岛素。当Banting等人(“在糖 尿病治疗中的胰腺提取物，(Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus)” Can.Med.Assoc.J.，12：141-146(1922)) 表明从胰腺中获得的活性提取物对糖尿病狗有疗效时，胰岛素才在 1922年被用于糖尿病的治疗。在同一年，用胰腺提取物对糖尿病患者 进行的治疗产生了显著的救生临床改善。由于胰岛素注射不便，所以 已经进行了大量努力来改善胰岛素给药和生物同化。
已经尝试通过口服给药来进行胰岛素的传递。在药学和医学文献 中广泛记录了与通过胰岛素口服给药来使糖尿病患者血糖正常时有关 的问题。在GI道中的消化酶使胰岛素迅速降解，产生生物学无效的分 解产物。例如，在胃中，口服给药的胰岛素经受了酶的蛋白水解和酸 降解。小肠中的幸存者被进一步蛋白水解。在该腔中，胰岛素受到了 包括胃酶和胰酶、外肽酶和内肽酶、以及刷状缘肽酶在内的酶的干扰。 即使胰岛素幸运地逃过了这种酶攻击，胰岛素在体内达到其受体前所 必须穿越的生物屏障也可能限制胰岛素的口服给药。例如，胰岛素可 能具有限制其通过脉管到达血液能力的低的膜渗透性。
已经将药学活性的多肽如胰岛素与多分散的聚乙二醇混合物或多 分散的包含聚乙二醇的聚合物进行配合来提供多分散的药物-低聚物 共轭物混合物。例如，US 4,179,337，Davis等人提出了与各种聚乙二 醇如由Union Carbide提供的MPEG-1900和MPEG-5000共轭的多肽如 胰岛素。
US 5,567,422，Greenwald提出了与聚乙二醇如m-PEG-OH(Union Carbide)共轭的生理活性的亲核试剂，其具有5,000道尔顿的数均分 子量。
US 5,359,030，Ekwuribe提出了与聚乙二醇改性的糖脂聚合物和 聚乙二醇改性的脂肪酸聚合物共轭的多肽。由各组合所产生的聚合物 具有约500至约10,000道尔顿的数均分子量。
聚乙二醇一般是通过碱催化的环氧乙烷的开环聚合来进行制备 的。该反应是通过在用氢氧化钾作为催化剂的情况下向乙二醇中加入 环氧乙烷来开始的。这种过程产生一种多分散的具有给定范围的数均 分子量的聚乙二醇的混合物。例如，由Milwaukee提供的PEG产 品，Wisconsin是以多分散混合物的形式被提供的，如PEG 400(Mn 380-420)；PEG 1,000(Mn 950-1,050)；PEG 1,500(Mn 1,400-1,600)； 和PEG 2,000(Mn 1,900-2,200)。
希望提供非多分散的其中该低聚物包含聚乙二醇的胰岛素-低聚 物共轭物的混合物。
本发明的概述
已经出乎意料地发现本发明实施方案的非多分散的包含聚乙二醇 的胰岛素-低聚物共轭物的混合物在体内表现出比具有相同数均分子 量的类似共轭物的多分散混合物的活性更高的活性。这种增加的活性 可以满足较低剂量的需要。此外，本发明实施方案包含聚乙二醇的胰 岛素-低聚物共轭物的非多分散的混合物在肠消化的体外模型中一般 比类似共轭物的多分散混合物更有效。此外，本发明实施方案包含聚乙 二醇的胰岛素-低聚物共轭物的非多分散的混合物在产生个体间差异 方面一般也低于类似共轭物的多分散的混合物。
根据本发明的实施方案，提供了共轭物基本单分散的混合物，其中 所说的共轭物各自包含与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药 物。该聚乙二醇部分优选地具有至少两个、三个或四个聚乙二醇亚基， 更优选地具有至少七个聚乙二醇亚基。该低聚物优选地进一步包含一 种亲脂性部分。该胰岛素药物优选地是人胰岛素。该低聚物优选地与 人胰岛素的LysB29共价偶合。该共轭物优选地具有亲油亲水平衡从而使 得该共轭物是水溶性的并能穿透生物膜。该混合物优选地是一种单分 散的混合物并且最优选地一种纯单分散的混合物。在一些实施方案中， 该低聚物包含通过一种不可水解的键与胰岛素共价偶合的第一聚乙二 醇部分和通过一种可水解的键与该第一聚乙二醇部分偶合的第二聚乙 二醇部分。
根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的基本单分散混 合物，其中各共轭物包括在人胰岛素的LysB29上与一种低聚物的羧酸部 分共价偶合的人胰岛素，其中所说的低聚物包含一种在该羧酸部分的 远末端上与具有至少7个聚乙二醇亚基的甲基结尾的聚乙二醇部分共 价偶合的己酸。
当与多分散混合物的这些性质相比时，本发明这些实施方案基本 单分散的共轭物混合物具有得到了改善的性质。在一个实施方案中，提 供了一种基本单分散的共轭物混合物，其中各共轭物包含一种与包含 聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药物，并且该聚合物具有比与该 基本单分散的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低 聚物共轭物混合物的体内活性高的体内活性。
在另外的实施方案中，提供了一种基本单分散的共轭物混合物， 其中各共轭物包含一种与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药 物，并且该混合物具有比与该基本单分散的混合物具有相同数均分子 量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的体外活性高的体外 活性。
还是在另外的实施方案中，提供了一种基本单分散的共轭物混合 物，其中各共轭物包含一种与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛 素药物，并且当和与该基本单分散的混合物具有相同数均分子量的多 分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力相 比时，该聚合物具有增强的对抗糜蛋白酶降解的能力。
还是在另外的实施方案中，提供了一种基本单分散的共轭物混合 物，其中各共轭物包含一种与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛 素药物，并且该混合物具有比与该基本单分散的混合物具有相同数均 分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的个体间差异低的个体 间差异。
本发明实施方案基本单分散的共轭物混合物优选地具有两种或多 种上述性质。更优选地，本发明实施方案基本单分散的共轭物混合物具 有三种或多种上述性质。最优选地，本发明实施方案基本单分散的共轭 物混合物具有所有的上述四种性质。
还是根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物，其 中各共轭物包括一种与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药物， 并且该混合物具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布。
还是根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物， 其中各共轭物包括一种与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药 物，并且该混合物具有高于10,000的分散系数(DC)，其中
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 ]]>
其中：
n是样品中不同分子的数目；
Ni是样品中i th 分子的数目；和
Mi是i th 分子的质量。
根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物，其中各 共轭物包括一种与低聚物偶合的胰岛素药物并具有相同的聚乙二醇亚 基数。
还是根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物，其 中各共轭物是相同的并如下式所示：
胰岛素药物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p (A)
其中：
B是一种结合部分；
L是一种衔接物部分；
G、G′和G″各自是一种所选择的间隔部分；
R是一种亲脂性部分并且R′是一种聚亚烷基二醇部分，或R′是亲脂 性部分并且R是聚亚烷基二醇部分；
T是一种终止部分；
j、k、m和n各自是0或1；和
p是一个1至该胰岛素药物上的亲核性残基数目之间的整数。
还提供了包含本发明共轭物混合物的药物组合物以及通过使用有 效量的该类药物组合物对需要进行该类治疗的个体的胰岛素不足进行 治疗的方法。此外，还提供了合成该类共轭物混合物的方法。
与常规的多分散的胰岛素-低聚物共轭物混合物系相比，本发明实 施方案的胰岛素-低聚物共轭物混合物可以提供增加的体内活性和/或 降低的个体间差异和/或降低的糜蛋白酶降解性。
附图简要说明
图1说明了用于合成本发明实施方案包含聚乙二醇部分和脂肪酸 部分的活性聚合物混合物的一般流程图；
图2说明了用于合成本发明实施方案的mPEG混合物的流程图；
图3说明了用于合成本发明实施方案活性mPEG7-己基低聚物混合 物的流程图；
图4说明了用于合成本发明实施方案活性mPEG7-辛基低聚物混合 物的流程图；
图5说明了用于合成本发明实施方案活性mPEG-癸基低聚物混合 物的流程图；
图6说明了用于合成本发明实施方案活性硬脂酸酯-PEG6低聚物 混合物的流程图；
图7说明了用于合成本发明实施方案活性硬脂酸酯-PEG8低聚物 混合物的流程图；
图8说明了用于合成本发明实施方案活性PEG3低聚物混合物的流 程图；
图9说明了用于合成本发明实施方案活性棕榈酸酯-PEG3低聚物 混合物的流程图；
图10说明了用于合成本发明实施方案活性PEG6低聚物混合物的 流程图；
图11说明了用于合成本发明实施方案各种丙二醇单体的流程图；
图12说明了用于合成本发明实施方案各种丙二醇聚合物的流程 图；
图13说明了用于合成本发明实施方案各种丙二醇聚合物的流程 图；
图14说明了用为化合物活性提供了一种指示的CytosensorMicrophysiometer所得的结果的比较，将本发明实施方案的胰岛素- 低聚物共轭物混合物与仅仅是为了进行比较而不是本发明组成部分的 多分散的共轭物混合物和胰岛素进行了比较；
图15说明了本发明实施方案的胰岛素-低聚物共轭物的糜蛋白酶 降解与仅仅是为了进行比较而不是本发明组成部分的常规多分散的胰 岛素-低聚物共轭物混合物的糜蛋白酶降解的比较；
图16说明了本发明实施方案的mPEG7-己基-胰岛素，单共轭物混 合物对禁食的比格尔犬血浆葡萄糖的影响；
图17说明了用于进行比较的不是本发明的组成部分的多分散的 mPEG7avg-己基-胰岛素，单共轭物混合物对禁食比尔格犬血浆葡萄糖的 影响；
图18说明了被给药于禁食比格尔犬的本发明实施方案的mPEG4- 己基-胰岛素单共轭物混合物的个体间差异；
图19说明了被给药于禁食比格尔犬的本发明实施方案的mPEG7- 己基-胰岛素单共轭物混合物的个体间差异；
图20说明了被给药于禁食比格尔犬的本发明实施方案的mPEG10- 己基-胰岛素单共轭物混合物的个体间差异；和
图21说明了被给药于禁食比格尔犬的用于进行比较的不是本发明 组成部分的多分散的mPEG7avg-己基-胰岛素单共轭物混合物的个体间 差异。
优选实施方案的详细说明
现在将对本发明在这里所描述的优选实施方案进行说明。但是， 应当意识到的是这些实施方案是为了对本发明进行说明，而不能被认 为是要对权利要求所确定的本发明的范围进行限制。
这里所用的术语“非多分散的”是用来描述一种具有与US 4,179,337，Davis等人；US 5,567,422，Greenwald；US 5,405,877， Greenwald等人；和US 5,359,030，Ekwuribe所描述的多分散混合物 相对的分散性的化合物的混合物。
这里所用的术语“基本单分散的”是用来描述一种其中在所说的 混合物中至少约95％的化合物具有相同分子量的化合物混合物。
这里所用的术语“单分散的”是用来描述一种其中在所说的混合 物中约100％的化合物具有相同分子量的化合物混合物。
这里所用的术语“基本纯单分散的”是用来描述一种其中在所说 的混合物中至少约95％的化合物具有相同分子量并且具有相同分子结 构的化合物混合物。因此，基本纯单分散的混合物是一种基本单分散 的混合物，但是基本单分散的混合物却不一定是一种基本纯单分散的 混合物。
这里所用的术语“纯单分散的”是用来描述一种其中在所说的混 合物中约100％的化合物具有相同的分子量并具有相同的分子结构的 化合物混合物。因此，纯单分散的混合物是一种单分散的混合物，但是 单分散的混合物却不一定是一种纯单分散的混合物。
这里所用的术语“重均分子量”被定义为在混合物中所给出分子 的重量分数乘以混合物中各分子分子重量的结果的和。“重均分子量” 用符号Mw来进行表示。
这里所用的术语“数均分子量”被定义为混合物的总重量除以该 混合物的分子数，其用符号Mn来进行表示。
这里所用的术语“分散系数”(DC)是用下式来进行定义的：
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 ]]>
其中：
n是样品中不同分子的数目；
Ni是样品中第i个分子的数目；和
Mi是第i个分子的质量。
这里所用的术语“个体内差异”指的是当该个体在不同的时间使 用相同剂量的药物或药物组合物时在相同个体间发生的活性差异。
这里所用的术语“个体间差异”指的是当各个体使用相同剂量的 药物或药物组合物时在两个或多个个体之间活性的差异。
这里所用的术语“胰岛素药物”指的是具有胰岛素生物活性的全 部或一部分的药物。
这里所用的术语“胰岛素”指的是人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛 素或鲸胰岛素，其是由天然、合成或基因工程来源提供的。
这里所用的术语“胰岛素类似物”指的是其中一个或多个氨基酸 已经被替换但保留了胰岛素的一些或全部活性的胰岛素。该类似物是 通过标明替换氨基酸以及其后用上标表示的胰岛素替换位来进行描述 的。例如，“ProB29胰岛素，人”指的是通常出现在人胰岛素分子B29 位上的赖氨酸已经被脯氨酸所替换。
正如本领域技术人员所知道的那样，胰岛素类似物可以通过各种 方法来获得。例如，胰岛素结构中的某些氨基酸可被其它氨基酸替换， 而其与如，例如抗体的抗原结合区或底物分子结合部位之类的结构进 行相互结合的能力不会产生可察觉的降低。因为胰岛素相互作用的能 力和性质确定了其生物学功能活性，所以可以在氨基酸序列中进行某 些氨基酸序列的替换并仍然保留具有相似性质的多肽。
在进行该类替换时，可以考虑氨基酸的亲水指数。在现有技术中 通常理解亲水性氨基酸指数在使多肽具有相互作用的生物学功能中的 重要性。公认该氨基酸的相对亲水性有助于所得多肽的二级结构，其 又确定了蛋白质与其它分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等 等的相互作用。已经根据其疏水性和电荷特性而指定了各氨基酸的亲 水指数，各氨基酸的亲水指数如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)； 亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸 (+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)； 色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸 (-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸 (-3.9)；和精氨酸(-4.5)。正如本领域技术人员所知道的那样，某些氨 基酸可以被具有相似亲水性指数或得分的氨基酸所替换并仍然能产生 具有相似生物学活性的多肽，即，仍然获得生物学功能相等的多肽。在 进行该类变化时，优选其亲水性指数在彼此±2之内的氨基酸的替换， 特别优选这些在彼此±1之内的这些物质的替换，并且更特别优选在彼 此±0.5之内的这些物质的替换。
在现有技术中还知道可以在亲水性基础上有效进行相似氨基酸的 取代。US 4,554,101提出，在被其相邻氨基酸的亲水性所控制时，蛋 白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质有关。正如在US 4,554,101中所详细描述的那样，给氨基酸残基指定了下面的亲水性 值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0 ±1)；丝氨酸(seine)(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨 酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(- 0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)； 异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。正 如本领域技术人员所知道的那样，可以将氨基酸替换成另一种具有相 似亲水性值的氨基酸并仍然可获得生物等效，并且特别是免疫学等效 的多肽。在该类变化中，优选其亲水性值在彼此±2之内的氨基酸的替 换，并且特别优选在彼此±1之间的这些替换，并且更特别优选在彼此 ±0.5之内的这些替换。
正如上面所概括的那样，氨基酸替换一般是以氨基酸侧链取代基 的相对相似性为基础的，例如以其疏水性、亲水性、电荷、大小等等 的相似性为基础。考虑各种上述特性进行的实例性的替换(即，可以相 互替换而不会显著改变该多肽的生物学活性的氨基酸)对于本领域技 术人员而言是众所周知的，并且包括，例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和 天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸 和异亮氨酸。
这里所用的术语“胰岛素片段”指的是在胰岛素中发现的保留了 该胰岛素的一些或全部活性的氨基酸序列的片段。胰岛素片段是通过 表明在氨基酸序列上的位置(位置们)，然后在对该氨基酸进行描述来 进行表示的。例如，“B25-B30人胰岛素”片段是相应于在人胰岛素氨 基酸序列中B25、B26、B27、B28、B29和B30位上的六个氨基酸序列。
这里所用的术语“胰岛素片段类似物”指的是在该胰岛素分子中 发现的胰岛素序列的片段，其中在该片段中的一个或多个氨基酸已经 被替换而同时保留了胰岛素的一些或全部活性。
这里所用的术语“PEG”指的是直链或支链的聚乙二醇聚合物，并 且包聚乙二醇(mPEG)的单甲醚。术语“PEG亚基”和聚乙二醇亚基指 的是单个的聚乙二醇单元，即，-(CH2CH2O)-。
这里所用的术语“亲脂性”指的是能溶解于脂类物质的能力和/或 渗透到生物膜、与生物膜相互作用和/或穿越生物膜的能力，“亲脂性 部分”或“亲脂体”指的是为亲脂性的部分和/或当与其它化学部分相 连时增加了该类化学实体的亲脂性的部分。亲脂性部分的实例非限制 性地包括烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、胆甾烯基、金刚烷基(adamantly) 等等。
这里所用的术语“低级烷基”指的是具有一至五个碳原子的被取 代或未被取代的烷基部分。
这里所用的术语“高级烷基”指的是具有六个或更多个碳原子的 被取代或未被取代的烷基部分。
在本发明的实施方案中，提供了一种基本单分散的胰岛素-低聚物 共轭物的混合物。优选地，该混合物中至少约96、97、98或99％的共 轭物具有相同的分子量。更优选地，该混合物是一种单分散的混合物。 更优选地，该混合物是一种基本纯单分散的混合物。还更优选地，该混 合物中至少约96、97、98或99％的共轭物具有相同的分子量并具有 相同的分子结构。最优选地，该混合物是一种纯单分散的混合物。
该胰岛素药物优选地是胰岛素。更优选地，该胰岛素药物是人胰岛 素。但是，应当清楚的是，该胰岛素药物可以选自对于本领域技术人 员而言公知的各种胰岛素药物，包括，例如，胰岛素原、胰岛素类似物、 胰岛素片段、和胰岛素片段类似物。胰岛素类似物非限制性地包括 AspB28人胰岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、 AlaB28人胰岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、 LeuB28ProB29人胰岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素、 以及用上述替换准则所提供的类似物。胰岛素片段非限制性地包括 B22-B30人胰岛素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30 人胰岛素、B27-B30人胰岛素、B29-B30人胰岛素、人胰岛素的A链、 和人胰岛素的B链。胰岛素片段类似物可以通过在胰岛素片段中如上 所述的替换一个或多个氨基酸来获得。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以是包含聚乙二 醇部分的各种低聚物。优选地，该低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、 3或4个聚乙二醇亚基。更优选地，该聚乙二醇部分具有至少5或6个 聚乙二醇亚基并且，最优选地，该聚乙二醇部分具有至少7个聚乙二醇 亚基。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以包含一个或多 个其它部分，所说的其它部分非限制性地包括另外的亲水性部分、亲 脂性部分、间隔部分、衔接物部分、和终端部分。在该低聚物中的各 部分可以通过可水解或不可水解的键彼此共价结合。
该低聚物可进一步包含一个或多个另外的亲水性部分(即，除该聚 乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括，糖类、聚环氧烷、和多元 胺/PEG共聚物。因为聚乙二醇是一种聚环氧烷，所以该另外的亲水性部 分也可以是一种聚乙二醇部分。如果毗连的聚乙二醇部分是通过醚键 相结合的，则将认为其是相同的部分。例如，
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一种具有六个 聚乙二醇亚基的单一的聚乙二醇部分。如果这种部分是该低聚物中唯 一的亲水性部分，则该低聚物将不包含另外的亲水性部分。如果该毗 连的聚乙二醇部分不是通过醚键相连的，则认为该部分是不同的部 分。例如，
是一种具有四个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有两个聚乙二醇亚 基的另外的亲水性部分。优选地，本发明实施方案的低聚物包含一种 聚乙二醇部分并且不包含另外的亲水性部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个亲脂性部分。该亲脂性部分优选地是一种饱和或不饱和的直链 或支链烷基部分或饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸部分。当该亲脂 性部分是一种烷基部分时，其优选地是一种具有1至28个碳原子的直 链的饱和或不饱和烷基部分。更优选地，该烷基部分具有2至12个碳 原子。当该亲脂性部分是一种脂肪酸部分时，其优选地是一种具有2至 18个碳原子的直链的饱和或不饱和的天然脂肪酸部分。更优选地，该脂 肪酸部分具有3至14个碳原子。最优选地，该脂肪酸部分具有至少4、 5或6个碳原子。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个间隔部分。例如，间隔部分可以被用来将亲水性部分与亲脂性 部分分离开、将亲脂性部分或亲水性部分与胰岛素药物分离开、将第 一亲水性或亲脂性部分与第二亲水性或亲脂性部分分离开、或将亲水 性部分或亲脂性部分与衔接物部分分离开。间隔部分优选地选自糖、 胆固醇和甘油部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个用于将该低聚物与胰岛素药物连接起来的衔接物部分。该衔接 物部分优选地选自烷基和脂肪酸部分。
该低聚物可进一步包含位于未与胰岛素药物进行连接的低聚物的 一个或多个末端上的一个或多个终端部分。该终端部分优选地是一种 烷基或烷氧基部分，并且更优选地是低级烷基或低级烷氧基部分。最 优选地，该终端部分是甲基或甲氧基。虽然该终端部分优选地是烷基或 烷氧基部分，当应当清楚的是，正如本领域技术人员所理解的那样，该 终端部分可以是各种部分，其非限制性地包括，糖、胆固醇、醇类、或 脂肪酸类。
该低聚物优选地与胰岛素药物共价结合。在一些实施方案中，用可 水解的键(例如酯或碳酸酯键)将该胰岛素药物与该低聚物进行连接。 可水解的连接可以提供一种作为前体药物的胰岛素药物-低聚物共轭 物。在某些情况中，例如在该胰岛素药物-低聚物共轭物没有活性的情 况中(即，该共轭物缺乏通过胰岛素药物的主要作用机理来影响机体的 能力)，可水解的连接可以提供一种缓释放或控制释放作用，在给定时 间内以一种或多种低聚物形式进行给药的该胰岛素药物从其各自的胰 岛素药物-低聚物共轭物上裂解下来从而提供了活性药物。在其它实施 方案中，用一种不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将该胰岛 素药物与该低聚物进行连接。当需要使该胰岛素药物-低聚物共轭物在 血液中长时间循环，优选至少循环2小时时，可优选地使用不可水解 的键。正如本领域技术人员所理解的那样，当该低聚物与胰岛素药物 共价结合时，该低聚物进一步包含一个或多个用来将该低聚物与该胰 岛素药物共价结合的结合部分。结合部分优选地选自共价键(共价键 们)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分。 该低聚物一种以上的部分可以与该胰岛素药物共价结合。
虽然该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合，但是应当清楚的 是，该低聚物可以不与该胰岛素药物共价结合地形成一种非共价结合 的共轭的胰岛素药物-低聚物复合体。正如本领域技术人员所理解的那 样，非共价结合非限制性地包括氢键、离子键、Van der Waals键、 或胶束或脂质体包封。正如本领域技术人员所理解的那样，根据本发 明的实施方案，可以适宜地对低聚物进行构造、改性和/或适宜的功能 化从而使其具有以所选择的方式非共价结合的能力(例如，使其具有能 形成氢键的能力)。根据本发明的其它实施方案，可以用各种化合物对 低聚物进行衍生化，其中所说的各种化合物非限制性地包括，氨基酸 类、寡肽类、肽类、胆汁酸类、胆汁酸衍生物类、脂肪酸类、脂肪酸 衍生物类、水杨酸类、水杨酸衍生物类、氨基水杨酸类、和氨基水杨 酸衍生物类。所得的低聚物可与药物分子、药用产品、和/或药用赋形 剂非共价地结合(复合体)。所得的复合体优选地具有平衡的亲脂性和 亲水性。还是根据本发明的其它实施方案，可以用胺和/或烷基胺类对 低聚物进行衍生化。在适宜的酸性条件下，所得的低聚物可以与药物分 子、药用产品和/或药用赋形剂非共价地形成共轭的复合体。得自该类 络合作用的产品优选地具有平衡的亲脂性和亲水性。
一种以上的低聚物(即，许多低聚物)可以与胰岛素药物进行结 合。这些低聚物优选地是相同的。但是，应当清楚的是这些低聚物可 以彼此不同，或者这些低聚物中的一些可以相同而一些可以不同。当 有一些低聚物与胰岛素药物进行结合时，优选地用可水解的键将一个 或多个低聚物和该胰岛素药物进行结合并用不可水解的键将一个或多 个低聚物和该胰岛素药物进行结合。或者，将这些低聚物与该胰岛素 药物结合起来的所有键都是可水解的，但是各键具有不同的可水解 度，例如一个或多个低聚物在体内通过水解迅速从该胰岛素药物上除 去而一个或多个低聚物在体内通过水解缓慢地从该胰岛素药物上除 去。
该低聚物可以与该胰岛素药物在该胰岛素药物的各种亲核残基上 进行结合，其非限制性地包括，亲核的羟基官能基和/或氨基官能基。 当该胰岛素药物是多肽时，可以发现亲核的羟基官能基，例如，可在丝 氨酸和/或酪氨酸残基上发现该基团，并可以发现亲核的氨基官能基， 例如，可以在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或在该多肽的一个或多个N- 末端上发现该基团。当该低聚物与一个或多个胰岛素多肽的N-末端相 结合时，该连接优选地形成一种仲胺。当该胰岛素药物是人胰岛素时， 例如，该低聚物可以与该胰岛素的氨基官能度相连，其中所说的氨基官 能团包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、以及LysB29的氨基 官能度。当一个低聚物与人胰岛素相结合时，该低聚物优选地与LysB29的氨基官能度相结合。当两个低聚物与人胰岛素相结合时，该低聚物 优选地与PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相结合。虽然可以 有一种以上的低聚物与人胰岛素相连，但是观察到单共轭的人胰岛素 活性较高(改善的葡萄糖降低能力)。
本发明基本单分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物可以用 各种方法来合成。例如，由羧酸和聚乙二醇所组成的基本单分散的低聚 物混合物可以通过将基本单分散的羧酸混合物与基本单分散的聚乙二 醇混合物在足以提供一种单分散的低聚物混合物的情况下进行接触来 进行合成。然后，将该基本单分散混合物的低聚物进行活化以使其能 与胰岛素药物进行反应从而提供一种胰岛素药物-低聚物共轭物。图3 说明了用于提供基本单分散的活性聚合物混合物的合成途径的一个实 施方案并在下面的实施例11-18中进行了描述。图4说明了用于提供 基本单分散的活性聚合物混合物的合成途径的另一个实施方案并且在 下面的实施例19-24中进行了描述。图5也说明了用于提供基本单分 散的活性聚合物混合物的合成途径的另一个实施方案并且在下面的实 施例25-29中进行了描述。图6也说明了用于提供基本单分散的活性 聚合物混合物的合成途径的另一个实施方案并且在下面的实施例30- 31中进行了描述。图7说明了用于提供基本单分散的活性聚合物混合 物的合成途径的另一个实施方案并且在下面的实施例32-37中进行了 描述。图8也说明了用于提供基本单分散的活性聚合物混合物的合成 途径的另一个实施方案并且在下面的实施例38中进行了描述。图9也 说明了用于提供基本单分散的活性聚合物混合物的合成途径的另一个 实施方案并且在下面的实施例39中进行了描述。图10说明了用于提 供基本单分散的活性聚合物混合物的合成途径的另一个实施方案并且 在下面的实施例40中进行了描述。
可以将该基本单分散的活性低聚物的混合物与基本单分散的胰岛 素药物的混合物在足以提供胰岛素药物-低聚物共轭物的条件下进行 反应。在下面的实施例41中对一种优选的合成进行了描述。正如本领 域技术人员所理解的那样，可以对该反应条件进行控制(例如，所选择 的摩尔比例、溶剂混合物和/或pH)以使得得自该基本单分散的活性低 聚物混合和基本单分散的胰岛素药物混合物的反应的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物是一种基本单分散的混合物。例如，通过将反应溶 液的pH维持在低于赖氨酸pKa的水平上就可以抑制在赖氨酸氨基官能 度上的结合。或者，可以使用例如下面实施例50中所描述的HPLC将 该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物分离并离析出来从而得到基本 单分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物，所说的共轭物例如单 -、二-、或三-共轭物。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各 种技术对特定分离出来的共轭物的共轭度(例如所分离出来的分子是 单、二-、还是三-共轭物)进行测定和/或验证，所说的各种技术非限 制性地包括，质谱。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种技 术对特定共轭物结构(例如，该低聚物是在人胰岛素单共轭物的GlyA1、 PheB1还是LysB29上)进行测定和/或验证，所说的各种技术非限制性地 包括序列分析、肽谱图、选择性酶裂解、和/或内肽酶裂解。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以阻断位于胰岛素药物上 的一个或多个反应部位，例如可以通过将该胰岛素药物与适宜的试剂 进行反应来进行阻断，所说的适宜试剂如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、 或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)。当该胰岛素药物是一种多肽并且 希望形成一种在该多肽的N-末端上具有低聚物的不饱和共轭物(即，其 中不是所有的亲核残基都被共轭)时可优选这种方法。在该类阻断后， 可以将该基本单分散的进行了阻断的胰岛素药物的混合物与基本单分 散的活性低聚物的混合物进行反应从而得到具有与一个或多个亲核性 残基相结合的低聚物(低聚物们)和与其它亲核性残基相结合的阻断部 分的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。正如本领域技术人员所理解 的那样，在该共轭反应后，可以将该胰岛素药物-低聚物共轭物去阻 断。如果需要的话，然后可以将该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物 如上所述的那样进行分离从而得到一种基本单分散的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物。或者可以在去阻断之前对该胰岛素药物-低聚物 共轭物的混合物进行分离。
根据本发明的其它实施方案，提供了一种基本单分散的共轭物混 合物，其中各共轭物包括在该胰岛素的LysB29上与低聚物的羧酸部分共 价结合的人胰岛素，其中所说的低聚物包含在该羧酸部分远侧末端上 与具有至少7个聚乙二醇亚基的甲基结尾的聚乙二醇部分共价结合的 己酸。在该基本单分散的混合物中的各共轭物优选地由在胰岛素的 LysB29上与低聚物的羧酸部分共价结合的人胰岛素所组成，其中所说的 低聚物由在羧酸部分的远侧末端上与具有7个聚乙二醇亚基的甲基结 尾的聚乙二醇部分共价结合的己酸所组成。
当与多分散混合物的这些性质相比时，本发明这些实施方案基本 单分散的共轭物混合物具有改善的性质。例如，基本单分散的胰岛素药 物-低聚物共轭物混合物优选地具有比和该基本单分散的混合物具有 相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的体内 活性高的体内活性。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方 法来对该基本单分散的混合物的数均分子量和该多分散混合物的数均 分子量进行测量，其中所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱 法如凝胶渗透色谱法，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe， CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)中所述的 方法。
作为另一个实例，基本单分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合 物优选地具有比与该基本单分散的混合物具有相同数均分子量的多分 散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的体外活性高的体外活性。正如 本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对该基本单分散的混 合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量，所说的各 种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对特定混合 物的体外活性进行测量。优选地，体外活性是用一种可以从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亚，商业获得的 Cytosensor Microphysiometer来测量的。作为向transwell中所 培养的细胞中加入的药物的响应，Microphysiometer监测器以细胞外 酸化的速率发生微小的改变。这种响应与所研究分子的活性成比例。 优选地，该基本单分散的混合物的体外活性比该多分散混合物的体外 活性高至少约5％。更优选地，该基本单分散的混合物的体外活性比该 多分散混合物的体外活性高至少约10％。
作为另一个实例，和与该基本单分散的混合物具有相同数均分子 量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物对于糜蛋白酶降解的 抵抗力相比，基本单分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地 具有增强的糜蛋白酶降解抵抗力。对糜蛋白酶的抵抗力相当于用与下 面实施例52所概述的方法将试验分子用糜蛋白酶进行消解时剩余的百 分比。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对该基本单 分散的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量， 所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。优选地，该基本单 分散的混合物对于糜蛋白酶降解的抵抗力比该多分散混合物对糜蛋白 酶降解的抵抗力高至少约10％。更优选地，该基本单分散的混合物对于 糜蛋白酶降解的抵抗力比该多分散混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力高 至少约20％。
还是作为另一个实例，基本单分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物优选地具有比和该基本单分散的混合物具有相同数均分子量的 多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异低的个体间 差异。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对该基本单 分散的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量， 所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。正如本领域技术人 员所理解的那样，可以用各种方法对个体间差异进行测量。该个体间 差异优选地计算如下。测定各个体的剂量响应曲线下面积(AUC)(即在 剂量响应曲线和基准值之间的面积)。通过将各个体的AUCs相加求和 并用该和除以个体数来测定所有个体的平均AUC。然后测定个体的AUC 和平均AUC之间差异的绝对值。然后将所得差异的绝对值求和得到表 示个体间差异的值。较低的值表示较低的个体间差异，较高的值表示 较高的个体间差异。优选地，该基本单分散的混合物的个体间差异比 多分散混合物的个体间差异低至少约10％。更优选地，该基本分散的混 合物的个体间差异比多分散混合物的个体间差异低至少约25％。
本发明实施方案基本单分散的共轭物混合物优选地具有两种或多 种上述性质。更优选地，本发明实施方案基本单分散的共轭物混合物具 有三种或多种上述性质。最优选地，本发明实施方案基本单分散的共轭 物混合物具有所有上述四种性质。
还是在本发明其它的实施方案中，提供了具有标准偏差小于约22 道尔顿的分子量分布的共轭物的混合物。在该混合物中的各共轭物包 括与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药物。该标准偏差优选 地小于约14道尔顿并且更优选地小于约11道尔顿。可以用本领域技 术人员所公知的方法来测定分子量分布，其中所说的方法非限制性地 包括，大小排阻色谱法如例如H.R.Allcock & F.W.Lampe， CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)所述的凝 胶渗透色谱法。正如本领域技术人员所理解的那样，然后可以用统计 学方法对该分子量分布的标准偏差进行测定。
该胰岛素药物优选地是胰岛素。更优选地，该胰岛素药物是人胰岛 素。但是，应当清楚的是该胰岛素药物可以选自本领域技术人员所公 知的各种胰岛素药物，其包括例如，胰岛素原、胰岛素类似物、胰岛素 片段、和胰岛素片段类似物。胰岛素类似物非限制性地包括AspB28人胰 岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、AlaB28人胰 岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、LeuB28ProB29人胰 岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素、以及用上述的替 换准则提供的类似物。胰岛素片段非限制性地包括B22-B30人胰岛 素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30人胰岛素、B27-B30 人胰岛素、B29-B30人胰岛素、人胰岛素的A链、和人胰岛素的B链。 可以通过如上所述的那样将胰岛素片段中的一个或多个氨基酸进行替 换来获得胰岛素片段类似物。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以是各种包含聚 乙二醇部分的低聚物。优选地，该低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、 3或4个聚乙二醇亚基。更优选地，该聚乙二醇部分具有至少5或6个 聚乙二醇亚基并且，最优选地，该聚乙二醇部分具有至少7个聚乙二醇 亚基。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以包含一个或多 个其它部分，所说的其它部分非限制性地包括，另外的亲水性部分、亲 脂性部分、间隔部分、衔接物部分、和终端部分。在该低聚物中的各 种部分可以通过可水解的或不可水解的键彼此共价结合。
该低聚物可进一步包含一个或多个另外的亲水性部分(即，除该聚 乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括糖、聚环氧烷、和多元胺/PEG 共聚物。因为聚乙二醇是一种聚环氧烷，所以该另外的亲水性部分可以 是一种聚乙二醇部分。如果毗连的聚乙二醇部分是通过醚键相连的， 则将认为其是相同的部分。例如，
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一种具有六个 聚乙二醇亚基的单一的聚乙二醇部分。如果这种部分是该低聚物中唯 一的亲水性部分，则该低聚物将不包含另外的亲水性部分。如果毗连的 聚乙二醇部分不是通过醚键相连的，则认为其是不同的部分。例如，
是具有四个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有两个聚乙二醇亚基的 另外的亲水性部分。优选地，本发明实施方案的低聚物包含聚乙二醇 部分并且不包含另外的亲水性部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个亲脂性部分。该亲脂性部分优选地是饱和或不饱和的直链或支 链烷基部分或饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸部分。当该亲脂性部 分是一种烷基部分时，其优选地是具有1至28个碳原子的直链饱和或 不饱和烷基部分。更优选地，该烷基部分具有2至12个碳原子。当该 亲脂性部分是一种脂肪酸部分时，其优选地是具有2至18个碳原子的 直链饱和或不饱和的天然脂肪酸部分。更优选地，该脂肪酸部分具有3 至14个碳原子。最优选地，该脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个间隔部分。例如可以用间隔部分将亲水性部分与亲脂性部分分 离开、将亲脂性部分或亲水性部分与胰岛素药物分离开、将第一亲水 或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分分离开、将亲水性部分或亲脂性部 分与衔接物部分分离开。间隔部分优选地选自糖、胆固醇和甘油部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个用于将低聚物与该胰岛素药物结合起来的衔接物部分。衔接物 部分优选地选自烷基和脂肪酸部分。
该低聚物可以进一步在未与该胰岛素药物相结合的低聚物的一个 或多个末端上包含一个或多个终端部分。该终端部分优选地是烷基或 烷氧基部分，并且更优选地是低级烷基或低级烷氧基部分。最优选地， 该终端部分是甲基或甲氧基、虽然该终端部分优选地是烷基或烷氧基 部分，但正如本领域技术人员所理解的那样，该终端部分可以是各种部 分，其非限制性地包括，糖、胆固醇、醇类、和脂肪酸类。
该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合。在一些实施方案中，用 可水解的键(例如，酯或碳酸酯键)将该胰岛素药物与低聚物相结合。 可水解的连接可以提供一种作为前体药物的胰岛素药物-低聚物共轭 物。在某些情况中，例如在该胰岛素药物-低聚物共轭物无活性(即，该 共轭物缺乏通过胰岛素药物的主要作用机理来影响机体的能力)的情 况中，可水解的结合可以提供缓释放或控制释放作用，在给定时期内将 一种或多种低聚物形式进行给药的胰岛素药物从其各自的胰岛素药物 -低聚物共轭物上裂解下来从而提供了该活性药物。在其它实施方案中， 用不可水解的键(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将该胰岛素药物与 低聚物结合起来。当其需要使得该胰岛素药物-低聚物共聚物长期在血 液中循环时，可优选使用不可水解的键，其中所说的长期优选至少2 小时。正如本领域技术人员所理解的那样，当该低聚物与该胰岛素药 物共价结合时，该低聚物进一步包含一个或多个用于将该低聚物与该 胰岛素药物共价结合的结合部分。结合部分优选地选自共价键(共价键 们)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分。 可以将一种以上的低聚物与该胰岛素药物共价结合。
虽然该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合，但应当清楚的是 该低聚物可以与该胰岛素药物非共价结合形成一种非共价结合的共轭 的胰岛素药物-低聚物复合体。正如本领域技术人员所理解的那样，非 共价结合非限制性地包括氢键、离子键、范德华键(Van der Waals) 键、和胶束或脂质体包封。正如本领域技术人员所理解的那样，根据本 发明的实施方案，可以对该低聚物进行适宜地构造、改性和/或功能化 从而赋予其以以所选择方式非共价结合的能力(例如，使其具有产生氢 键的能力)。根据本发明的其它实施方案，可以用各种化合物对低聚物 进行衍生化，所说的各种化合物非限制性地包括，氨基酸类、寡肽类、 肽类、胆汁酸类、胆汁酸衍生物类、脂肪酸类、脂肪酸衍生物类、水 杨酸类、水杨酸衍生物类、氨基水杨酸类、和氨基水杨酸衍生物类。 所得的低聚物可以与药物分子、药用产品和/或药用赋形剂非共价结合 (复合体)。所得的复合体优选地具有平衡的亲脂性和亲水性。还是根 据本发明的其它实施方案，可以用胺和/或烷基胺对低聚物进行衍生 化。在适宜的酸性条件下，所得聚合物可以与药物分子、药用产品和/ 或药用赋形剂形成非共价共轭的复合体。得自该类络合作用的产物优 选地具有平衡的亲脂性或亲水性。
可以将一种以上的低聚物(即，许多低聚物)与该胰岛素药物进行 结合。这些低聚物优选地是相同的。但是，应当清楚的是这些低聚物 可以彼此不同，或者这些低聚物中的一些相同而另一些不相同。当有 许多低聚物与该胰岛素药物相结合时，优选地将一个或多个低聚物用 可水解的键与该胰岛素药物进行结合并且将一个或多个低聚物用不可 水解的键与该胰岛素药物进行结合。或者，将许多低聚物与胰岛素药 物进行结合的所有键可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，从 而使得，例如，一个或多个低聚物可以通过体内水解迅速从该胰岛素药 物上被除去并且一个或多个低聚物可以通过体内水解缓慢地从该胰岛 素药物上被除去。
可以将该低聚物在该胰岛素药物的各种亲核性残基上与该胰岛素 药物进行结合，所说的亲核性残基非限制性地包括亲核的羟基官能团 和/或氨基官能团。当该胰岛素药物是一种多肽时，可发现亲核的羟基 官能团，例如可以在丝氨酸和/或酪氨酸残基上发现该基团，并且可发 现亲核的氨基官能团，例如，可在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或该 多肽的一个或多个N-末端上发现该基团。当将低聚物与该胰岛素多肽 的一个或多个N-末端相结合时，该结合优选地形成一种仲胺。当该胰 岛素药物是一种人胰岛素时，例如，该低聚物可以与该胰岛素的氨基官 能度相结合，包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。当一个低聚物与人胰岛素相结合时，该低聚物优选地 与LysB29的氨基官能度相结合。当两个低聚物与人胰岛素相结合时，该 低聚物优选地与PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相结合。虽 然可以将一种以上的低聚物与人胰岛素相结合，但是观测到单共轭的 人胰岛素具有较高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各种方法来合成具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分 布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。例如，由羧酸或聚乙二醇组 成的具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的低聚物混合物是通 过将具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的羧酸混合物与具有 标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的聚乙二醇混合物在足以提供 具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的低聚物混合物的条件下 进行接触来合成。然后，将具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分 布的混合物的低聚物进行活化以使得其能与胰岛素药物进行反应从而 提供一种胰岛素药物-低聚物共轭物。图3说明了用于提供一种具有标 准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途 径的一个实施方案并在下面的实施例11-18中进行了描述。图4说明 了用于提供一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低 聚物的混合物的合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例19-24 中进行了描述。图5也说明了用于提供一种具有标准偏差小于约22道 尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途径的另一个实施方 案并且在下面的实施例25-29中进行了描述。图6也说明了用于提供 一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合 物的合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例30-31中进行了描 述。图7也说明了用于提供一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分子 量分布的活性低聚物的混合物的合成途径的另一个实施方案并在下面 的实施例32-37中进行了描述。图8也说明了用于提供一种具有标准 偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途径 的另一个实施方案并且在下面的实施例38中进行了描述。图9也说明 了用于提供一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低 聚物的混合物的合成途径的另一个实施方案并且在下面的实施例39中 进行了描述。图10也说明了用于提供一种具有标准偏差小于约22道 尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合物的合成途径的另一个实施方 案并在下面的实施例40中进行了描述。
将具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低聚物的混 合物与具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物的混 合物在足以提供胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的情况下进行反 应。在下面的实施例41中对一种优选的合成进行了描述。正如本领域 技术人员所理解的那样，可以对反应条件(例如，所选择的摩尔比例、 溶剂混合物和/或pH)进行控制，从而使得由具有标准偏差小于约22 道尔顿的分子量分布的活性低聚物的混合物和具有标准偏差小于约22 道尔顿的分子量分布的胰岛素药物的混合物的反应而获得的胰岛素药 物-低聚物共轭物的混合物是一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分 子量分布的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH维持在低于该赖 氨酸的pKa的水平下来抑制在赖氨酸氨基官能度上的结合。或者，可 以用例如下面实施例50中所描述的HPLC来进行胰岛素药物-低聚物共 轭物的混合物的分离和离析从而得到具有标准偏差小于约22道尔顿的 分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物，所说的共轭物例如单-、二 -、或三-共轭物。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种技 术来对所分离出的特定共轭物的结合程度(例如，所分离出来的分子是 单-、二-还是三-共轭物)进行测定和/或确证，所说的各种技术非限制 性地包括，质谱。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种技术 对特定的共轭物结构(例如，该低聚物是在人胰岛素单共轭物的GlyA1、 PheB1还是LysB29上)进行测定，所说的各种技术非限制性地包括，序列 分析、作肽图、选择性酶裂解、和/或内肽酶裂解。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以阻断该胰岛素药物上的 一个或多个反应部位，例如可以通过将该胰岛素药物与适宜的阻断剂 如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)进 行反应来进行阻断。例如，当该胰岛素药物是一种多肽并希望形成一 种在该多肽的N-末端具有低聚物的不饱和共轭物(即，不是其中所有的 亲核残基都被结合的共轭物)时，可优选这种方法。在进行该类阻断后， 可以将具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的被阻断的胰岛素 药物的混合物与具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的活性低 聚物的混合物进行反应从而获得一种具有与一个或多个亲核残基相结 合的低聚物(低聚物们)和与其它亲核残基相结合的阻断部分的胰岛素 药物-低聚物共轭物的混合物。在该共轭反应后，正如本领域技术人员 所理解的那样，可以将该胰岛素药物-低聚物共轭物去阻断。如果需要 的话，然后可如上所述的那样对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物 进行分离，从而得到一种具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布 的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。或者，可以在去阻断之前对该 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离。
与多分散混合物的这些性质相比，本发明实施方案具有标准偏差 小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物 优选地具有得到了改善的性质。例如，具有标准偏差小于约22道尔顿 的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有比与 具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共 轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共 轭物的混合物的体外活性高的体外活性。正如本领域技术人员所理解 的那样，可以用各种方法对具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分 布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合 物的数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻 色谱法如，例如in H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有比与具有标准偏差小 于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具 有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的 体外活性高的体外活性。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各 种方法对具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物- 低聚物共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进 行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来测量特定 混合物的体外活性。优选地，用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亚，商业获得的CytosensorMicrophysiometer来对体外活性进行测量。作为对添加到培养于 transwell中的细胞中的药物的响应，该Microphysiometer监测器以 细胞外酸化的速率发生微小的变化。这种响应与所研究分子的活性成 比例。优选地，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素 药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性比多分散混合物的体外活性 高至少约5％。更优选地，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布 的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性比多分散混合物的 体外活性高至少约10％。
还是作为另一个实例，和与具有标准偏差小于约22道尔顿的分子 量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的 多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物对糜蛋白酶降解的抵抗 力相比，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物- 低聚物共轭物的混合物优选地具有增加的糜蛋白酶降解抵抗力。对糜 蛋白酶的抵抗力相当于用与下面实施例52所概述的方法相似的方法用 糜蛋白酶对试验分子进行消解时剩余的百分比。正如本领域技术人员 所理解的那样，可以用各种方法对具有标准偏差小于约22道尔顿的分 子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的数均分子量或多分散 混合物的数均分子量进行测定，其中所说的各种方法非限制性地包括， 大小排阻色谱法。优选地，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分 布的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多 分散混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力高至少约10％。更优选地，具有标 准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物对糜蛋白酶降解的抵 抗力高至少约20％。
还是作为另一个实例，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分 布的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物优选地具有比与具有标准偏差 小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物具 有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个 体间差异低的个体间差异。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用 各种方法对具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物 -低聚物共轭物混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进 行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。正如本领 域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对个体间差异进行测量。个 体间差异优选地用如下的方法进行计算。测定各个体的剂量响应曲线 下面积(AUC)(即，剂量响应曲线和基准值之间的面积)。通过将各个体 的AUC相加求和并用该和除以个体的数目来测定对所有个体而言的平 均AUC。然后测定对于各个体而言个体AUC和平均AUC之间差异的绝 对值。然后对所得差异的绝对值求和从而得到表示个体间差异的值。 较低的值表示较低的个体间差异，较高的值表示较高的个体间差异。 优选地，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰岛素药物- 低聚物共轭物混合物的个体间差异比多分散混合物的个体间差异低至 少约10％。更优选地，具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的 胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异比多分散混合物的个 体间差异低至少约25％。
本发明实施方案具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有两种或多种上述性质。更 优选地，本发明实施方案具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布 的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有三种或多种上述性质。最优 选地，本发明实施方案具有标准偏差小于约22道尔顿的分子量分布的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有所有上述四种性质。
还是根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物，其 中各共轭物包括与包含聚乙二醇部分的低聚物偶合的胰岛素药物，并 且该混合物具有高于10,000的分散系数(DC)，其中
DC = ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 Σ i = 1 n N i M i 2 Σ i = 1 n N i - ( Σ i = 1 n N i M i ) 2 ]]>
其中：
n是样品中不同分子的数目；
Ni是样品中第i个分子的数目；和
Mi是第i个分子的质量。
共轭物混合物优选地具有一种高于100,000的分散系数。更优选 地，该共轭物混合物的分散系数高于500,000并且，最优选地，该分散 系数高于10,000,000。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各 种方法对变量n、Ni、和Mi进行测定，所说的各种方法非限制性地包括， 在下面实施例49中所述的方法。
该胰岛素药物优选地是胰岛素。更优选地，该胰岛素药物是人胰岛 素。但是，应当清楚的是该胰岛素药物可以选择各种对本领域技术人 员公知的胰岛素药物，其包括，例如，胰岛素原、胰岛素类似物、胰岛 素片段、和胰岛素片段类似物。胰岛素类似物非限制性地包括AspB28人胰岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、AlaB28人胰岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、LeuB28ProB29人胰岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素、以及用上诉 替代准则所提供的类似物。胰岛素片段非限制性地包括B22-B30人胰 岛素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30人胰岛素、 B27-B30人胰岛素、B29-B30人胰岛素、人胰岛素的A链、或人胰岛素 的B链。可以通过在胰岛素片段中如上所述的替换一个或多个氨基酸 来提供胰岛素片段类似物。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以是包含聚乙二 醇部分的各种低聚物。优选地，该低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、 3或4个聚乙二醇亚基。更优选地，该聚乙二醇部分具有至少5或6个 聚乙二醇亚基，并且最优选地，该聚乙二醇部分具有至少7个聚乙二醇 亚基。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可包含一个或多个 其它部分，所说的其它部分非限制性地包括，另外的亲水性部分、亲脂 性部分、间隔部分、衔接物部分、和终端部分。在该低聚物中的各种 部分可以通过可水解的或不可水解的键彼此共价结合。
该低聚物可进一步包含一个或多个另外的亲水性部分(即，除该聚 乙二醇部分外的部分)，所说的另外的亲水性部分非限制性地包括， 糖、聚环氧烷、或多元胺/PEG共聚物。因为聚乙二醇是一种聚环氧烷， 该另外的亲水性部分可以是一种聚乙二醇部分。
如果毗连的聚乙二醇部分是通过醚键相连的，则将认为其是相同 的部分。例如，
-O-C2H4-0-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一种具有六个 聚乙二醇亚基的单一的聚乙二醇部分。如果这种部分是该低聚物中唯 一的亲水性部分，则该低聚物将不包含另外的亲水性部分。如果毗连的 聚乙二醇部分不是通过醚键相连的，则认为其是不同的部分。例如，下 面的部分
是具有四个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有两个聚乙二醇亚基的 另外的亲水性部分。优选地，本发明实施方案的低聚物包含聚乙二醇 部分并且不包含另外的亲水性部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个亲脂性部分。该亲脂性部分优选地是饱和或不饱和的直链或支 链烷基部分或饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸部分。当该亲脂性部 分是一种烷基部分时，其优选地是具有1至28个碳原子的直链饱和或 不饱和烷基部分。更优选地，该烷基部分具有2至12个碳原子。当该 亲脂性部分是一种脂肪酸部分时，其优选地是具有2至18个碳原子的 直链饱和或不饱和的天然脂肪酸部分。更优选地，该脂肪酸部分具有3 至14个碳原子。最优选地，该脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个间隔部分。例如，可以用间隔部分将亲水性部分与亲脂性部分 分离开、将亲脂性部分或亲水性部分与胰岛素药物分离开、将第一亲 水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分分离开、将亲水性部分或亲脂性 部分与衔接物部分分离开。间隔部分优选地选自糖、胆固醇和甘油部 分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个用于将该低聚物与该胰岛素药物进行结合的衔接物部分。衔接 物部分优选地选自烷基和脂肪酸部分。
该低聚物可以进一步在未与该胰岛素药物相结合的低聚物的一个 或多个末端上包含一个或多个终端部分。该终端部分优选地是一种烷 基或烷氧基部分，并且更优选地是低级烷基或低级烷氧基部分。最优选 地，该终端部分是甲基或甲氧基。虽然该终端部分优选地是烷基或烷氧 基部分，但正如本领域技术人员所理解的那样，该终端部分可以是各种 部分，其非限制性地包括，糖、胆固醇、醇类、和脂肪酸类。
该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合。在一些实施方案中，用 可水解的键(例如，酯或碳酸酯键)将该胰岛素药物与低聚物相结合。 可水解的连接可以提供一种作为前体药物的胰岛素药物-低聚物共轭 物。在某些情况中，例如在该胰岛素药物-低聚物共轭物无活性(即，该 共轭物缺乏通过胰岛素药物的主要作用机理来影响机体的能力)的情 况中，可水解的结合可以提供缓释放或控制释放作用，在给定时期内将 一种或多种低聚物形式进行给药的胰岛素药物从其各自的胰岛素药物 -低聚物共轭物上裂解下来从而提供了该活性药物。在其它实施方案中， 用不可水解的键(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将该胰岛素药物与 低聚物结合起来。当其需要使得该胰岛素药物-低聚物共聚物长期在血 液中循环时，可优选使用不可水解的键，其中所说的长期优选至少2 小时。正如本领域技术人员所理解的那样，当该低聚物与该胰岛素药 物共价结合时，该低聚物进一步包含一个或多个用于将该低聚物与该 胰岛素药物共价结合的结合部分。结合部分优选地选自共价键(共价键 们)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分。 可以将一种以上的低聚物与该胰岛素药物共价结合。
虽然该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合，但应当清楚的是 该低聚物可以与该胰岛素药物非共价结合形成一种非共价结合的共轭 的胰岛素药物-低聚物复合体。正如本领域技术人员所理解的那样，非 共价结合非限制性地包括氢键、离子键、范德华键、和胶束或脂质体 包封。正如本领域技术人员所理解的那样，根据本发明的实施方案，可 以对该低聚物进行适宜地构造、改性和/或功能化从而赋予其以以所选 择方式非共价结合的能力(例如，使其具有产生氢键的能力)。根据本 发明的其它实施方案，可以用各种化合物对低聚物进行衍生化，所说的 各种化合物非限制性地包括，氨基酸类、寡肽类、肽类、胆汁酸类、胆 汁酸衍生物类、脂肪酸类、脂肪酸衍生物类、水杨酸类、水杨酸衍生 物类、氨基水杨酸类、和氨基水杨酸衍生物类。所得的低聚物可以与 药物分子、药用产品和/或药用赋形剂非共价结合(复合体)。所得的复 合体优选地具有平衡的亲脂性和亲水性。还是根据本发明的其它实施 方案，可以用胺和/或烷基胺对低聚物进行衍生化。在适宜的酸性条件 下，所得聚合物可以与药物分子、药用产品和/或药用赋形剂形成非共 价共轭的复合体。得自该类络合作用的产物优选地具有平衡的亲脂性 或亲水性。
可以将一种以上的低聚物(即，许多低聚物)与该胰岛素药物进行 结合。这些低聚物优选地是相同的。但是，应当清楚的是这些低聚物 可以彼此不同，或者这些低聚物中的一些相同而另一些不相同。当有 许多低聚物与该胰岛素药物相结合时，优选地将一个或多个低聚物用 可水解的键与该胰岛素药物进行结合并且将一个或多个低聚物用不可 水解的键与该胰岛素药物进行结合。或者，将许多低聚物与胰岛素药 物进行结合的所有键可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，从 而使得，例如，一个或多个低聚物可以通过体内水解迅速从该胰岛素药 物上被除去并且一个或多个低聚物可以通过体内水解缓慢地从该胰岛 素药物上被除去。
可以将该低聚物在该胰岛素药物的各种亲核性残基上与该胰岛素 药物进行结合，所说的亲核性残基非限制性地包括亲核的羟基官能团 和/或氨基官能团。当该胰岛素药物是一种多肽时，可发现亲核的羟基 官能团，例如可以在丝氨酸和/或酪氨酸残基上发现该基团，并且可发 现亲核的氨基官能团，例如，可在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或该 多肽的一个或多个N-末端上发现该基团。当将低聚物与该胰岛素多肽 的一个或多个N-末端相结合时，该结合优选地形成一种仲胺。当该胰 岛素药物是一种人胰岛素时，例如，该低聚物可以与该胰岛素的氨基官 能度相结合，包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基官能度、和LysB29的氨基官能度。当一个低聚物与人胰岛素相结合时，该低聚物优选地 与LysB29的氨基官能度相结合。当两个低聚物与人胰岛素相结合时，该 低聚物优选地与PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官能度相结合。虽 然可以将一种以上的低聚物与人胰岛素相结合，但是观测到单共轭的 人胰岛素具有较高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各种方法来合成分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚 物共轭物的混合物。例如，由羧酸和聚乙二醇所组成的分散系数高于 10,000的低聚物的混合物是通过将分散系数高于10,000的羧酸的混 合物与分散系数高于10,000的聚乙二醇的混合物在足以提供一种分 散系数高于10,000的低聚物的混合物的条件下进行接触来合成的。然 后，将该分散系数高于10,000的混合物的低聚物进行活化，从而使其 能与胰岛素药物进行反应从而提供一种胰岛素药物-低聚物共轭物。图 3说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成 途径的一个实施方案并在下面的实施例11-18中进行了描述。图4说 明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成途 径的另一个实施方案并在下面的实施例19-24中进行了描述。图5也 说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成 途径的另一个实施方案并在下面的实施例25-29中进行了描述。图6 也说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合 成途径的另一个实施方案并在下面的实施例30-31中进行了描述。图7 说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成 途径的另一个实施方案并在下面的实施例32-37中进行了描述。图8 也说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合 成途径的另一个实施方案并在下面的实施例38中进行了描述。图9也 说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成 途径的另一个实施方案并在下面的实施例39中进行了了描述。图10 说明了用于提供一种分散系数高于10,000的活性低聚物混合物合成 途径的另一个实施方案并在下面的实施例40中进行了描述。
将分散系数高于10,000的活性低聚物的混合物与分散系数高于 10,000的胰岛素药物的混合物在足以提供胰岛素药物-低聚物共轭物 混合物的情况下进行反应。在下面的实施例41中对一种优选的合成进 行了描述。正如本领域技术人员所理解的那样，可以对反应条件(例 如，所选择的摩尔比例、溶剂混合物和/或pH)进行控制以使得得自分 散系数高于10,000的活性低聚物的混合物和分散系数高于10,000的 胰岛素药物的混合物的反应的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物是 一种分散系数高于10,000的混合物。例如，可以通过将反应溶液的pH 维持在低于该赖氨酸的pKa的水平下来抑制在赖氨酸氨基官能度上的 结合。或者，可以用例如下面实施例50所描述的HPLC对该胰岛素药 物-低聚物共轭物的混合物进行分离和离析，从而得到分散系数高于 10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物，所说的共轭物例如单 -、二-或三-共轭物。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种 技术来对所分离出的特定共轭物的结合程度(例如，所分离出来的分子 是单-、二-还是三-共轭物)进行测定和/或确证，所说的各种技术非限 制性地包括，质谱。正如本领域技术人员所裂解的那样，可以用各种技 术来对特定的共轭物结构特定的共轭物结构(例如，该低聚物是在人胰 岛素单共轭物的GlyA1、PheB1还是LysB29上)进行测定和/或验证，所说 的各种技术非限制性地包括，序列分析、作肽图、选择性酶裂解、和/ 或内肽酶裂解。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以阻断该胰岛素药物上的 一个或多个反应部位，例如可以通过将该胰岛素药物与适宜的阻断剂 如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)进 行反应来进行阻断。例如，当该胰岛素药物是一种多肽并且需要形成一 种在该多肽的一个或多个N-末端上具有低聚物的不饱和共轭物(即，其 中不是所有的亲核残基都被共轭的共轭物)时，可优选这种方法。在进 行该类阻断后，可将分散系数高于10,000的被阻断的胰岛素药物的混 合物与分散系数高于10,000的活性低聚物的混合物进行反应从而得 到一种具有与一个或多个亲核残基相结合的低聚物(低聚物们)和与其 它亲核残基相结合的阻断部分的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合 物。在该共轭反应后，正如本领域技术人员所理解的那样，可以将该胰 岛素药物-低聚物共轭物去阻断。如果需要的话，然后可如上所述的那 样对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离，从而得到一种分 散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。或者，可 以在去阻断之前对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离。
与多分散混合物的这些性质相比，本发明实施方案分散系数高于 10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有改善的性 质。例如，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物 优选地具有比与分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物混 合物的体内活性高的体内活性。正如本领域技术人员所理解的那样，可 以用各种方法来对分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物 混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量，所说的 各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法如，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991) 所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共 轭物的混合物优选地具有比与分散系数高于10,000的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低 聚物共轭物混合物的体外活性高的体外活性。正如本领域技术人员所 理解的那样，可以用各种方法来对分散系数高于10,000的胰岛素药物 -低聚物共轭物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测 量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来测量特定 混合物的体外活性。优选地，用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亚，商业获得的CytosensorMicrophysiometer对体外活性进行测量。作为对添加到培养于 transwell中的细胞中的药物的响应，该Microphysiometer监测器以 细胞外酸化的速率发生微小的变化。这种响应与所研究分子的活性成 比例。优选地，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物的体外活性比多分散混合物的体外活性高至少约5％。更优选地， 分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活 性比多分散混合物的体外活性高至少约10％。
还是作为另一个实例，与和分散系数高于10,000的胰岛素药物- 低聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物- 低聚物共轭物混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力相比，分散系数高于 10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有增加的糜蛋 白酶降解抵抗力。对糜蛋白酶的抵抗力相当于用与下面实施例52所概 述的方法相似的方法用糜蛋白酶对试验分子进行消解时剩余的百分 比。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来对分散系 数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的数均分子量和多 分散混合物的数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括， 大小排阻色谱法。优选地，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚 物共轭物的混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物对糜蛋白 酶降解的抵抗力高至少约10％。更优选地，分散系数高于10,000的胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散 混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力高至少约20％。
还是作为另一个实例，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚 物共轭物的混合物优选地具有比与分散系数高于10,000的胰岛素药 物-低聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药 物-低聚物共轭物的混合物的个体间差异低的个体间差异。正如本领域 技术人员所理解的那样，可以用各种方法来对分散系数高于10,000的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合物的 数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱 法。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对个体间差异 进行测量。个体间差异优选地计算如下。测定各个体的剂量响应曲线 下面积(AUC)(即，剂量-响应曲线和基准值之间的面积)。通过将各个体 的AUCs相加求和并然后将该和除以个体数来测定对于所有个体而言的 平均AUC。然后测定对于各个体而言个体AUC和平均AUC之间差异的 绝对值。然后对所得差异的绝对值求和从而得到表示个体间差异的 值。较低的值表示较低的个体间差异，较高的值表示较高的个体间差 异。优选地，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物混合 物的个体间差异比多分散混合物的个体间差异低至少约10％。更优选 地，分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体 间差异比多分散混合物的个体间差异低至少约25％。
本发明实施方案分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物优选地具有两种或多种上述性质。更优选地，本发明实施方 案分散系数高于10,000的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有三 种或多种上述性质。最优选地，本发明实施方案分散系数高于10,000 的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有所有上述四种性质。
根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的低聚物，其中各 共轭物包括一种与低聚物相结合的胰岛素药物并具有相同的聚乙二醇 亚基数。
胰岛素药物优选地是胰岛素。更优选地，该胰岛素药物是人胰岛 素。但是，应当清楚的是该胰岛素药物可以选择各种对本领域技术人 员公知的胰岛素药物，其包括，例如，胰岛素原、胰岛素类似物、胰岛 素片段、和胰岛素片段类似物。胰岛素类似物非限制性地包括AspB28人胰岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、AlaB28人胰岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、LeuB28ProB29人胰岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素、以及用上诉 替代准则所提供的类似物。胰岛素片段非限制性地包括B22-B30人胰 岛素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30人胰岛素、 B27-B30人胰岛素、B29-B30人胰岛素、人胰岛素的A链、以及人胰岛 素的B链。可以通过在胰岛素片段中如上所述的替换一个或多个氨基 酸来提供胰岛素片段类似物。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可以是包含聚乙二 醇部分的各种低聚物。优选地，该低聚物的聚乙二醇部分具有至少2、 3或4个聚乙二醇亚基。更优选地，该聚乙二醇部分具有至少5或6个 聚乙二醇亚基并且，最优选地，该聚乙二醇部分具有至少7个聚乙二醇 亚基。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可包含一个或多个 其它部分，所说的其它部分非限制性地包括，另外的亲水性部分、亲脂 性部分、间隔部分、衔接物部分、和终端部分。在该低聚物中的各种 部分可以通过可水解的或不可水解的键彼此共价结合。
该低聚物可进一步包含一个或多个另外的亲水性部分(即，除该聚 乙二醇部分外的部分)，其非限制性地包括，糖、聚环氧烷、和多元胺 /PEG共聚物。因为聚乙二醇是一种聚环氧烷，该另外的亲水性部分可以 是一种聚乙二醇部分。如果毗连的聚乙二醇部分是通过醚键相连的， 则将认为其是相同的部分。例如，下面的部分
-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是一种具有六个聚 乙二醇亚基的单一的聚乙二醇部分。如果这种部分是该低聚物中唯一 的亲水性部分，则该低聚物将不包含另外的亲水性部分。如果毗连的聚 乙二醇部分不是通过醚键相连的，则认为其是不同的部分。例如，下面 的部分
是具有四个聚乙二醇亚基的聚乙二醇部分和具有两个聚乙二醇亚基的 另外的亲水性部分。优选地，本发明实施方案的低聚物包含聚乙二醇 部分并且不包含另外的亲水性部分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个亲脂性部分。该亲脂性部分优选地是饱和或不饱和的直链或支 链烷基部分或饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸部分。当该亲脂性部 分是一种烷基部分时，其优选地是具有1至28个碳原子的直链饱和或 不饱和烷基部分。更优选地，该烷基部分具有2至12个碳原子。当该 亲脂性部分是一种脂肪酸部分时，其优选地是具有2至18个碳原子的 直链饱和或不饱和的天然脂肪酸部分。更优选地，该脂肪酸部分具有3 至14个碳原子。最优选地，该脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳原子。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个间隔部分。例如，可以用间隔部分将亲水性部分与亲脂性部分 分离开、将亲脂性部分或亲水性部分与胰岛素药物分离开、将第一亲 水或亲脂部分与第二亲水或亲脂部分分离开、将亲水性部分或亲脂性 部分与衔接物部分分离开。间隔部分优选地选自糖、胆固醇和甘油部 分。
正如本领域技术人员所理解的那样，该低聚物可进一步包含一个 或多个用于将该低聚物与该胰岛素药物进行结合的衔接物部分。衔接 物部分优选地选自烷基和脂肪酸部分。
该低聚物可以进一步在未与该胰岛素药物相结合的低聚物的一个 或多个末端上包含一个或多个终端部分。该终端部分优选地是一种烷 基或烷氧基部分，并且更优选地是低级烷基或低级烷氧基部分。最优选 地，该终端部分是甲基或甲氧基。虽然该终端部分优选地是烷基或烷氧 基部分，但正如本领域技术人员所理解的那样，该终端部分可以是各种 部分，其非限制性地包括，糖、胆固醇、醇类、和脂肪酸类。
该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合。在一些实施方案中，用 可水解的键(例如，酯或碳酸酯键)将该胰岛素药物与低聚物相结合。 可水解的连接可以提供一种作为前体药物的胰岛素药物-低聚物共轭 物。在某些情况中，例如在该胰岛素药物-低聚物共轭物无活性(即，该 共轭物缺乏通过胰岛素药物的主要作用机理来影响机体的能力)的情 况中，可水解的结合可以提供缓释放或控制释放作用，在给定时期内将 一种或多种低聚物形式进行给药的胰岛素药物从其各自的胰岛素药物 -低聚物共轭物上裂解下来从而提供了该活性药物。在其它实施方案中， 用不可水解的键(例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将该胰岛素药物与 低聚物结合起来。当其需要使得该胰岛素药物-低聚物共聚物长期在血 液中循环时，可优选使用不可水解的键，其中所说的长期优选至少2 小时。正如本领域技术人员所理解的那样，当该低聚物与该胰岛素药 物共价结合时，该低聚物进一步包含一个或多个用于将该低聚物与该 胰岛素药物共价结合的结合部分。结合部分优选地选自共价键(共价键 们)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分或仲胺部分。 可以将一种以上的低聚物与该胰岛素药物共价结合。
虽然该低聚物优选地与该胰岛素药物共价结合，但应当清楚的是 该低聚物可以与该胰岛素药物非共价结合形成一种非共价结合的共轭 的胰岛素药物-低聚物复合体。正如本领域技术人员所理解的那样，非 共价结合非限制性地包括氢键、离子键、范德华键、和胶束或脂质体 包封。正如本领域技术人员所理解的那样，根据本发明的实施方案，可 以对该低聚物进行适宜地构造、改性和/或功能化从而赋予其以以所选 择方式非共价结合的能力(例如，使其具有产生氢键的能力)。根据本 发明的其它实施方案，可以用各种化合物对低聚物进行衍生化，所说的 各种化合物非限制性地包括，氨基酸类、寡肽类、肽类、胆汁酸类、胆 汁酸衍生物类、脂肪酸类、脂肪酸衍生物类、水杨酸类、水杨酸衍生 物类、氨基水杨酸类、和氨基水杨酸衍生物类。所得的低聚物可以与 药物分子、药用产品和/或药用赋形剂非共价结合(复合体)。所得的复 合体优选地具有平衡的亲脂性和亲水性。还是根据本发明的其它实施 方案，可以用胺和/或烷基胺对低聚物进行衍生化.在适宜的酸性条件 下，所得聚合物可以与药物分子、药用产品和/或药用赋形剂形成非共 价共轭的复合体。得自该类络合作用的产物优选地具有平衡的亲脂性 和亲水性。
可以将一种以上的低聚物(即，许多低聚物)与该胰岛素药物进行 结合。这些低聚物优选地是相同的。但是，应当清楚的是这些低聚物 可以彼此不同，或者这些低聚物中的一些相同而另一些不相同。当有 许多低聚物与该胰岛素药物相结合时，优选地将一个或多个低聚物用 可水解的键与该胰岛素药物进行结合并且将一个或多个低聚物用不可 水解的键与该胰岛素药物进行结合。或者，将许多低聚物与胰岛素药 物进行结合的所有键可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，从 而使得，例如，一个或多个低聚物可以通过体内水解迅速从该胰岛素药 物上被除去并且一个或多个低聚物可以通过体内水解缓慢地从该胰岛 素药物上被除去。
可以将该低聚物在该胰岛素药物的各种亲核性残基上与该胰岛素 药物进行结合，所说的亲核性残基非限制性地包括亲核的羟基官能团 和/或氨基官能团。当该胰岛素药物是一种多肽时，可发现亲核的羟基 官能团，例如可以在丝氨酸和/或酪氨酸残基上发现该基团，并且可发 现亲核的氨基官能团，例如，可在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或该 多肽的一个或多个N-末端上发现该基团。当将低聚物与该胰岛素多肽 的一个或多个N-末端相结合时，该结合优选地形成一种仲胺。当该胰 岛素药物是一种人胰岛素时，例如，该低聚物可以与该胰岛素的氨基官 能度相结合，所说的氨基官能度包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基 官能度、和LysB29的氨基官能度。当一个低聚物与人胰岛素相结合时， 该低聚物优选地与LysB29的氨基官能度相结合。当两个低聚物与人胰岛 素相结合时，该低聚物优选地与PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官 能度相结合。虽然可以将一种以上的低聚物与人胰岛素相结合，但是观 测到单共轭的人胰岛素具有较高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
其中混合物中的各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物 -低聚物共轭物的混合物可以用各种方法来进行合成。例如，其中混合 物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亚基数的由羧酸和聚乙二醇所组成 的低聚物的混合物是通过将羧酸的混合物与其中混合物中各聚乙二醇 分子具有相同聚乙二醇亚基数的聚乙二醇在足以产生其中混合物中的 各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数的低聚物混合物的条件下进行接 触来进行合成的。然后，将其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二 醇亚基数的混合物的低聚物进行活化，从而使其能与胰岛素药物进行 反应从而提供一种胰岛素药物-低聚物共轭物。图3说明了用于提供一 种其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数的活性低聚物 混合物合成途径的一个实施方案并在下面的实施例11-18中进行了描 述。图4说明了用于提供一种其中混合物中的各低聚物具有相同的聚 乙二醇亚基数的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下 面的实施例19-24中进行了描述。图5也说明了用于提供一种其中混 合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数的活性低聚物混合物合 成途径的另一个实施方案并在下面的实施例25-29中进行了描述。图6 也说明了用于提供一种其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇 亚基数的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实 施例30-31中进行了描述。图7说明了用于提供一种其中混合物中的 各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数的活性低聚物混合物合成途径的 另一个实施方案并在下面的实施例32-37中进行了描述。图8也说明 了用于提供一种其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数 的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例38 中进行了描述。图9也说明了用于提供一种其中混合物中的各低聚物 具有相同的聚乙二醇亚基数的活性低聚物混合物合成途径的另一个实 施方案并在下面的实施例39中进行了描述。图10说明了用于用于提 供一种其中混合物中的各低聚物具有相同的聚乙二醇亚基数的活性低 聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例40中进行了 说明。
将其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亚基数的活性低聚 物的混合物基与胰岛素药物的混合物在足以提供胰岛素药物-低聚物 共轭物混合物的情况下进行反应。在下面的实施例41中对一种优选的 合成进行了描述。正如本领域技术人员所理解的那样，可以对反应条件 (例如，所选择的摩尔比例、溶剂混合物和/或pH)进行控制以使得得自 其中各混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亚基数的活性低聚物的 活性混合物和其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亚基数的共 轭物的混合物的反应的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物是一种其 中混合物中的各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的共轭物混合物。例 如，可以通过将反应溶液的pH维持在低于该赖氨酸的pKa的水平下来 抑制在赖氨酸氨基官能度上的结合。或者，可以用力如下面实施例50 中所述的HPLC来对胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离和离 析从而得到其中混合物中的各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛 素药物-低聚物共轭物的混合物，例如单-、二-、或三-共轭物。正如 本领域技术人员所理解的那样，可以用各种技术来对所分离出的特定 共轭物的结合程度(例如，所分离出来的分子是单-、二-还是三-共轭 物)进行测定和/或验证，所说的各种技术非限制性地包括，质谱。正如 本领域技术人员所公知的那样，可以用各种技术来对特定的共轭物结 构(例如，该低聚物是在人胰岛素单共轭物的GlyA1、PheB1或LysB29上) 进行测定和/或验证，所说的各种技术非限制性地包括，序列分析、作 肽图、选择性酶裂解、和/或内肽酶裂解。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以对该胰岛素药物的一个 或多个反应位点进行阻断，例如，可以通过将胰岛素药物与适宜的阻 断试剂如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N- FMOC)进行反应来进行阻断。例如，当该胰岛素药物是一种多肽并且需 要形成一种在该多肽的一个或多个N-末端上具有低聚物的不饱和共轭 物(即，其中不是所有的亲核残基都被共轭的共轭物)时，可优选这种 方法。在进行该类阻断后，可以将进行了阻断的胰岛素药物的混合物与 其中混合物中的各低聚物具有相同聚乙二醇亚基数的活性低聚物的混 合物基进行反应，从而得到具有与一个或多个亲核残基相结合的低聚 物(低聚物们)和与其它亲核残基相结合的阻断部分的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物。在该共轭反应后，正如本领域技术人员所理解的 那样，可以将该胰岛素药物-低聚物共轭物去阻断。如果需要的话，然 后可如上所述的那样对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分 离从而得到其中混合物中的各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛 素药物-低聚物共轭物。或者，可以在去阻断之前对该胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物进行分离。
与多分散混合物的这些性质相比，本发明实施方案其中混合物中 各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混 合物优选地具有改善的性质。例如，其中混合物中各共轭物具有相同聚 乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有比与其中混 合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物的体内活性高的体内活性。正如本领域技术人员所理解的 那样，可以用各种方法来对其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇 亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的数均分子量和多分散混 合物的数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排 阻色谱法如，例如在H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)中所述的凝胶渗透色谱 法。
作为另一个实例，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基 数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有比与其中混合物 中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物的体外活性高的体外活性。正如本领域技术人员所理解的那样， 可以用各种方法对其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合物的 数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱 法。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来测量特定 混合物的体外活性。优选地，用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亚，商业获得的CytosensorMicrophysiometer对体外活性进行测量。为对添加到培养于 transwell中的细胞中的药物的响应，该Microphysiometer监测器以 细胞外酸化的速率发生微小的变化。这种响应与所研究分子的活性成 比例。优选地，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性比多分散混合物的体外 活性高至少约5％。更优选地，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二 醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性比多分散 混合物的体外活性高至少约10％。
还是作为另一个实例，当和与其中混合物中各共轭物具有相同聚 乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有相同数均分 子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物对糜蛋白酶降解 的抵抗力相比时，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有增加的糜蛋白酶降解 抵抗力。对糜蛋白酶的抵抗力相当于用与下面实施例52所概述的方法 相似的方法用糜蛋白酶对试验分子进行消解时剩余的百分比。正如本 领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对其中混合物中各共轭 物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的 数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量，所说的各种方法 非限制性地包括，大小排阻色谱法。优选地，其中混合物中各共轭物具 有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物对糜蛋 白酶降解的抵抗力比多分散混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力高至少约 10％。更优选地，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散 混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力高至少约20％。
还是作为另一个实例，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇 亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有比与其中混 合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物的个体间差异低的个体间差异。正如本领域技术人员所理 解的那样，可以用各种方法对其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二 醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的数均分子量和多分散 混合物的数均分子量进行测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小 排阻色谱法。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对个 体间差异进行测量。个体间差异优选地计算如下。测定各个体的剂量 响应曲线下面积(AUC)(即，剂量响应曲线和基准值之间的面积)。通过 将各个体的AUC相加求和并用该和除以个体的数目来测定对所有个体 而言的平均AUC。然后测定对于各个体而言个体AUC和平均AUC之间 差异的绝对值。然后对所得差异的绝对值求和从而得到表示个体间差 异的值。较低的值表示较低的个体间差异，较高的值表示较高的个体 间差异。优选地，其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数的 胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异比多分散混合物的个 体间差异低至少约10％。更优选地，其中混合物中各共轭物具有相同聚 乙二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异比多 分散混合物的个体间差异低至少约25％。
本发明实施方案其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二醇亚基数 的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有两种或多种上述性 质。更优选地，本发明实施方案其中混合物中各共轭物具有相同聚乙二 醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有三种或多种上述 性质。最优选地，本发明实施方案其中混合物中各共轭物具有相同聚乙 二醇亚基数的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有所有上述四种 性质。
还是根据本发明的其它实施方案，提供了一种共轭物的混合物，其 中各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构：
胰岛素药物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p (A)
其中：
B是一种结合部分；
L是一种衔接物部分；
G、G′和G″各自是一种所选择的间隔部分；
R是一种亲脂性部分并且R′是一种聚亚烷基二醇部分，或R′是亲脂 性部分并且R是聚亚烷基二醇部分；
T是一种终止部分；
j、k、m和n各自是0或1；和
p是一个1至该胰岛素药物上的亲核性残基数目之间的整数。
该胰岛素药物优选地是胰岛素。更优选地，该胰岛素药物是人胰岛 素。但是，应当清楚的是该胰岛素药物可以选择各种对本领域技术人 员公知的胰岛素药物，其包括，例如，胰岛素原、胰岛素类似物、胰岛 素片段、和胰岛素片段类似物。胰岛素类似物非限制性地包括AspB28人胰岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、AlaB28人胰岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、LeuB28ProB29人胰岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素，以及用上诉替 代准则所提供的类似物。胰岛素片段非限制性地包括B22-B30人胰岛 素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30人胰岛素、B27-B30 人胰岛素、B29-B30人胰岛素、人胰岛素的A链、以及人胰岛素的B 链。可以通过在胰岛素片段中如上所述的替换一个或多个氨基酸来提 供胰岛素片段类似物。
根据本发明的这些实施方案，该低聚物的聚亚烷基二醇部分优选 地具有至少2、3或4个聚亚烷基二醇亚基。更优选地，该聚亚烷基二 醇部分具有至少5或6个聚亚烷基二醇亚基并且，最优选地，该聚乙二 醇部分具有至少7个聚亚烷基二醇亚基。该聚亚烷基二醇部分优选地 是低级聚亚烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分、或聚丁二 醇部分。更优选地，该聚亚烷基二醇部分是聚乙二醇部分或聚丙二醇部 分。最优选地，该聚亚烷基二醇部分是聚乙二醇部分。当该聚亚烷基二 醇部分是聚丙二醇部分时，该部分优选地具有一种均匀的(即，非随机 的)结构。一种具有均匀结构的实例性的聚丙二醇部分如下所示：
这种均匀的聚丙二醇结构被描述为在该聚丙二醇链中毗邻各氧原子的 只有一个甲基取代的碳原子。该类均匀的聚丙二醇部分既可表现出亲 脂性又可表现出亲水性，因此可用于提供一种不使用亲脂性聚合物部 分的两亲性胰岛素药物-低聚物共轭物。此外，将该聚丙二醇的仲醇部 分与一种药物相结合可提供对酶所造成的降解具有改善的抵抗性的胰 岛素药物(例如，人胰岛素)，其中所说的酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶，例 如，在肠中所发现的这些酶。
本发明实施方案均匀的聚丙二醇优选地是如图11至13所示的那 样来进行合成的，现在将对其进行描述。正如图11所示的那样，将1，2- 丙二醇53与一种伯醇阻断剂进行反应以提供一种仲醇延伸单体54。正 如本领域技术人员所理解的那样，该伯醇阻断剂可以是各种伯醇阻断 剂，其非限制性地包括，甲硅烷基氯化物类化合物如叔-丁基二苯基甲 硅烷基氯化物和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物、以及酯化试剂如 Ac2O。优选地，该伯醇阻断剂是一种基本不与仲醇类物质发生反应的伯 醇阻断剂，如叔-丁基二苯基甲硅烷基氯化物或叔-丁基二甲基甲硅烷 基氯化物。可将该仲醇延伸单体(54)与甲磺酰氯(MeSO2Cl)进行反应， 从而得到伯醇延伸单体甲磺酸酯55。
或者，可将该仲醇延伸单体54与仲醇阻断剂进行反应以得到化合 物56。正如本领域技术人员所理解的那样，该仲醇阻断剂可以是各种 仲醇阻断剂，其非限制性地包括，苄基氯。可将化合物56与一种B1去 -阻断剂进行反应以除去阻断部分B1并提供一种伯醇延伸单体57。正 如本领域技术人员所理解的那样，该B1去-阻断剂可选自各种去-阻断 剂。当通过形成酯来对该伯醇进行阻断时，该B1去-阻断剂是一种去- 酯化剂试剂，如一种碱(例如，碳酸钾)。当用一种甲硅烷基氯化物来对 该伯醇进行阻断时，该B1去-阻断剂优选地是氟化四丁铵(TBAF)。可 将该伯醇延伸单体57与甲烷磺酰氯进行反应，从而获得一种仲醇延伸 单体甲磺酸酯58。
该伯醇延伸单体54和仲醇延伸单体57可如下所述的那样进行封 端。可将仲醇延伸单体54与一种封端剂进行反应，得到化合物59。正 如本领域技术人员所理解的那样，该封端剂可以是各种封端剂，其非 限制性地包括卤代烷如氯代甲烷。可将化合物59与一种B1去-阻断剂 进行反应从而得到伯醇封端的单体60。可将该伯醇封端的单体60与甲 烷磺酰氯进行反应，从而得到仲醇封端的单体甲磺酸酯61。可将伯醇 延伸单体57与一种封端剂进行反应，从而得到化合物62。该封端剂可 以是如上所述的各种封端剂。可将化合物62与B2去-阻断试剂进行反 应以除去阻断部分B2并提供一种仲醇封端的单体63。正如本领域技术 人员所理解的那样，该B2去-阻断试剂可以是各种去阻断剂，其非限 制性地包括，存在钯/活性碳催化剂情况下的H2。可将该仲醇封端的单 体与甲磺酰氯进行反应，从而得到一种伯醇封端的单体甲磺酸酯64。 虽然图11所说明的实施方案表明了封端单体的合成，但应当清楚的是 可以进行类似的反应来获得封端聚合物。
一般而言，可以通过将伯醇延伸单体或聚合物如伯醇延伸单体57 与伯醇延伸单体或聚合物甲磺酸酯如伯醇延伸单体甲磺酸酯55进行反 应来完成链延伸从而得到各种均匀的聚丙烯链，或者可以通过将仲醇 延伸单体或聚合物如仲醇延伸单体54与仲醇延伸单体或聚合物甲磺酸 酯如仲醇延伸单体甲磺酸酯58进行反应来完成链延伸。
例如，在图13中，将伯醇延伸单体甲磺酸酯55与伯醇延伸单体57 进行反应从而得到二聚物化合物65。或者，可以将仲醇延伸单体甲磺 酸酯58与仲醇延伸单体54进行反应从而得到二聚物化合物65。可以 用如上所述的B1去-阻断试剂除去该二聚物化合物上的B1阻断部分从 而得到上述伯醇延伸二聚物66。可将伯醇延伸二聚物66与甲烷磺酰氯 进行反应，从而得到仲醇延伸二聚物甲磺酸酯67。或者，可以用如上 所述的B2去-阻断试剂除去该二聚物化合物上的B2阻断部分，从而得 到仲醇延伸二聚物69。可将仲醇延伸二聚物69与甲烷磺酰氯进行反 应，从而得到伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以重复进行链延伸过程以 得到各种其它链长度。例如，如图13所说明的那样，可以将伯醇延伸二 聚物66与伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70进行反应，得到一种四聚物化 合物72。正如图13所进一步说明的那样，一般的链延伸反应流程图包 括将伯醇延伸单体或聚合物73与伯醇延伸单体或聚合物甲磺酸酯74 进行反应，从而得到均匀的聚丙烯聚合物75。m和n的值可以各自为0 至1000或更高。优选地，m和n各自为0至50。虽然图13所说明的 实施方案表示的是伯醇延伸单体和/或聚合物与伯醇延伸单体和/或聚 合物甲磺酸酯进行反应，但应当清楚的是可以用仲醇延伸单体和/或聚 合物和仲醇延伸单体和/或聚合物甲磺酸酯来进行类似的反应。
可以将伯醇延伸单体或聚合物的末端或伯醇延伸单体或聚合物甲 磺酸酯的末端分别与伯醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端单体 或聚合物进行反应，从而得到被封端的均匀的聚丙烯链。例如，如图12 所说明的那样，将伯醇延伸二聚物甲磺酸酯70与伯醇封端单体60进 行反应，得到被封端/被阻断的伯醇延伸三聚物71。正如本领域技术人 员所理解的那样，可将B1阻断部分除去并可将所得的封端伯醇延伸三 聚物与伯醇延伸单体或聚合物甲磺酸酯进行反应以延长被封端的三聚 物71的链。
可将仲醇延伸单体或聚合物的末端或仲醇延伸单体或聚合物甲磺 酸酯的末端与仲醇封端单体或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端单体或聚合 物进行反应，从而得到一种被封端的均匀的聚丙烯链。例如，如图12 所说明的那样，将仲醇延伸二聚物甲磺酸酯67与仲醇封端单体63进行 反应，得到被封端/被阻断的伯醇延伸三聚物68。可如上所述的那样除 去B2阻断部分并可将所得的被封端的仲醇延伸三聚物与仲醇延伸链节 甲磺酸酯进行反应以延长被封端的三聚物68的链。虽然图12所说明 的实施方案表明二聚物与封端单体的反应可提供一种三聚物，但应当 清楚的是可以在该均匀聚丙二醇部分合成中的任何点上来进行该封端 过程，或，另外可以提供一种未被封端的均匀的聚丙二醇部分。虽然 图12所说明的实施方案表明可通过用封端单体进行合成来完成聚丁烯 低聚物的封端，但应当清楚的是可以如上面图11中所述的那样用一种 封端剂将本发明的聚丁烯低聚物直接封端(即，不需要添加封端单 体)。
正如本领域技术人员所理解的那样，可用各种方法将本发明实施 方案均匀的聚丙二醇部分与胰岛素药物、亲脂性部分如羧酸、和/或各 种其它部分相结合，其中所说的各种部分非限制性地包括这里在涉及 聚乙二醇部分时所描述的这些方法。
根据本发明的这些实施方案，该亲脂性部分是一种本领域技术人 员所理解的亲脂性部分。该亲脂性部分优选地是饱和或不饱和的直链 或支链烷基部分或饱和或不饱和的直链或支链脂肪酸部分。当该亲脂 性部分是一种烷基部分时，其优选地是具有1至28个碳原子的直链饱 和或不饱和烷基部分。更优选地，该烷基部分具有2至12个碳原子。 当该亲脂性部分是一种脂肪酸部分时，其优选地是具有2至18个碳原 子的直链饱和或不饱和的天然脂肪酸部分。更优选地，该脂肪酸部分具 有3至14个碳原子。最优选地，该脂肪酸部分具有至少4、5或6个碳 原子。
根据本发明的这些实施方案，间隔部分——G、G′和G″，是本领域技 术人员所理解的间隔部分。间隔部分优选地选自糖、胆固醇和甘油部 分。优选地，这些实施方案的低聚物不包括间隔部分(即，k、m和n优 选地为0)。
根据本发明的这些实施方案，正如本领域技术人员所理解的那 样，可以用衔接物部分L将该低聚物与药物进行结合。衔接物部分优 选地选自烷基和脂肪酸部分。
根据本发明的这些实施方案，该终端部分优选地是一种烷基或烷 氧基部分，并且更优选地是低级烷基或低级烷氧基部分。最优选地，该 终端部分是甲基或甲氧基。虽然该终端部分优选地是烷基或烷氧基部 分，但正如本领域技术人员所理解的那样，该终端部分可以是各种部 分，其非限制性地包括，糖、胆固醇、醇类、和脂肪酸类。
根据本发明的这些实施方案，将由式A的结构的括号部分所表示的 低聚物与胰岛素药物共价结合。在一些实施方案中，用可水解的键(例 如，酯或碳酸酯键)将该胰岛素药物与低聚物相结合。可水解的连接可 以提供一种作为前体药物的胰岛素药物-低聚物共轭物。在某些情况中， 例如在胰岛素药物-低聚物共轭物无活性的情况中(即，该共轭物缺乏 通过胰岛素药物的主要作用机理来影响机体的能力)，可水解的结合可 以提供缓释放或控制释放作用，在给定时期内将一种或多种低聚物形 式进行给药的胰岛素药物从其各自的胰岛素药物-低聚物共轭物上裂 解下来从而提供了该活性药物。在其它实施方案中，用不可水解的键 (例如，氨基甲酸酯、酰胺或醚键)将该胰岛素药物与低聚物结合起来。 当其需要使得该胰岛素药物-低聚物共聚物长期在血液中循环时，可优 选使用不可水解的键，其中所说的长期优选至少2小时。正如本领域 技术人员所理解的那样，结合部分B可以是各种结合部分。结合部分 优选地选自共价键(共价键们)、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部 分、酰胺部分和仲胺部分。
变量p是从1至该胰岛素药物上亲核残基数的整数。当p大于1 时，有一个以上的低聚物(即多个低聚物)与药物相结合。根据本发明 的这些实施方案，这多个低聚物中的低聚物是相同的。当有许多低聚物 与该胰岛素药物相结合时，优选地将一个或多个低聚物用可水解的键 与该胰岛素药物进行结合并且将一个或多个低聚物用不可水解的键与 该胰岛素药物进行结合。或者，将这些低聚物与胰岛素药物进行结合 的所有键可都是可水解的，但是其具有不同的可水解度，从而使得，例 如，一个或多个低聚物可以通过体内水解迅速从该胰岛素药物上被除 去并且一个或多个低聚物可以通过体内水解缓慢地从该胰岛素药物上 被除去。
可以将该低聚物在该胰岛素药物的各种亲核性残基上与该胰岛素 药物进行结合，所说的亲核性残基非限制性地包括亲核的羟基官能团 和/或氨基官能团。当该胰岛素药物是一种多肽时，可发现亲核的羟基 官能团，例如可以在丝氨酸和/或酪氨酸残基上发现该基团，并且可发 现亲核的氨基官能团，例如，可在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或该 多肽的一个或多个N-末端上发现该基团。当将低聚物与该胰岛素多肽 的一个或多个N-末端相结合时，该结合优选地形成一种仲胺。当该胰 岛素药物是一种人胰岛素时，例如，该低聚物可以与该胰岛素的氨基官 能度相结合，所说的氨基官能度包括GlyA1的氨基官能度、PheB1的氨基 官能度、和LysB29的氨基官能度。当一个低聚物与人胰岛素相结合时， 该低聚物优选地与LysB29的氨基官能度相结合。当两个低聚物与人胰岛 素相结合时，该低聚物优选地与PheB1的氨基官能度和LysB29的氨基官 能度相结合。虽然可以将一种以上的低聚物与人胰岛素相结合，但是观 测到单共轭的人胰岛素具有较高的活性(改善的降低葡萄糖的能力)。
可以用各种方法来合成混合物中的各共轭物具有相同的分子量并 具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。例如，可以通 过将羧酸的混合物与聚乙二醇的混合物在足以提供低聚物混合物的条 件进行接触来合成由羧酸和聚乙二醇所组成的低聚物的混合物。然后 可将该混合物的低聚物进行活化，从而使其能与胰岛素药物进行反应 从而提供一种胰岛素药物-低聚物共轭物。图3说明了用于提供一种其 中各低聚物具有相同分子量并具有式A的结构的活性低聚物混合物合 成途径的一个实施方案并在下面的实施例11-18中进行了描述。图4 说明了用于提供一种其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的结构 的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例 19-24中进行了描述。图5也说明了用于提供一种其中各低聚物具有相 同分子量并具有式A的结构的活性低聚物混合物合成途径的另一个实 施方案并在下面的实施例25-29进行了描述。图6也说明了用于提供 一种其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的结构的活性低聚物混 合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例30-31中进行了描 述。图7说明了用于提供一种其中各低聚物具有相同分子量并具有式A 的结构的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实 施例32-37中进行了描述。图8也说明了用于提供一种其中各低聚物 具有相同分子量并具有式A的结构的活性低聚物混合物合成途径的另 一个实施方案并在下面的实施例38中进行了描述。图9也说明了用于 提供一种其中各低聚物具有相同分子量并具有式A的结构的活性低聚 物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的实施例39中进行了描 述。图10说明了用于提供一种其中各低聚物具有相同分子量并具有式 A的结构的活性低聚物混合物合成途径的另一个实施方案并在下面的 实施例40中进行了描述。
将其中各低聚物具有相同的分子量并具有式A的低聚物结构的活 性低聚物的混合物与其中混合物中各药物具有相同分子量的胰岛素药 物的混合物在足以提供胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的情况下进 行反应。在下面的实施例41中对一种优选的合成进行了描述。正如本 领域技术人员所理解的那样，可以对反应条件(例如，所选择的摩尔比 例、溶剂混合物和/或pH)进行控制，从而使得得自其中各低聚物具有 相同的分子量并具有式A的低聚物结构的活性低聚物的混合物和胰岛 素药物的混合物的反应的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物是一种 其中各共轭物具有相同分子量并具有式A的结构的共轭物的混合物。 例如，可以通过将反应溶液的pH维持在低于该赖氨酸的pKa的水平下 来抑制在赖氨酸氨基官能度上的结合。或者，可以用例如在实施例50 中所述的HPLC来对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离和 离析，从而得到其中混合物中的各共轭物具有相同分子量并具有式A 的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物，其中所说的共轭物例如 单-、二-、或三-共轭物。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用 各种技术来对所分离出的特定共轭物的结合程度(例如，所分离出来的 分子是单-、二-还是三-共轭物)进行测定和/或确证，所说的各种技术 非限制性地包括，质谱。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各 种技术对特定的共轭物结构(例如，该低聚物是在人胰岛素单共轭物的 GlyA1、PheB1还是LysB29上)进行测定和/或验证，所说的各种技术非限 制性地包括，序列分析、作肽图、选择性酶裂解、和/或内肽酶裂解。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以阻断该胰岛素药物上的 一个或多个反应位点，例如，可通过将该胰岛素药物与适宜的阻断剂 如N-叔-丁氧基羰基(叔-BOC)、或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)进 行反应来进行阻断。例如，当该胰岛素药物是一种多肽并且需要形成一 种在该多肽的一个或多个N-末端上具有低聚物的不饱和共轭物(即，其 中不是所有的亲核残基都被共轭的共轭物)时，可优选这种方法。在进 行该类阻断后，可将该被阻断胰岛素药物的混合物与其中混合物中的 各共轭物具有相同分子量并具有式A的低聚物结构的活性低聚物混合 物进行反应，从而得到一种具有与一个或多个亲核残基相结合的低聚 物(低聚物们)和与其它亲核残基相结合的阻断部分的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物。在该共轭反应后，正如本领域技术人员所理解的 那样，可以将该胰岛素药物-低聚物共轭物去阻断。如果需要的话，然 后可如上所述的那样对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分 离，从而得到一种其中混合物中的各共轭物具有相同数目分子量并具 有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物。或者，可以在去 阻断之前对该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物进行分离。
与多分散混合物的这些性质相比，本发明实施方案其中混合物中 的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物 共轭物的混合物优选地具有改善的性质。例如，其中混合物中的各共轭 物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物优选地具有比与其中混合物中的各共轭物具有相同分子量并具 有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物具有相同数均分子量的多分 散的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体内活性高的体内活性。正 如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来对其中混合物中 的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物 共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测 量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法如，例如在 H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第2版，1991)中所述的凝胶渗透色谱法。
作为另一个实例，其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并 具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有比与 其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛 素药物-低聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的胰岛 素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性高的体外活性。正如本领域 技术人员所理解的那样，可以用各种方法对其中混合物中的各共轭物 具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混 合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行侧测量，所说的 各种方法非限制性地包括大小排阻色谱法。
正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法来测量特定 混合物的体外活性。优选地，用从Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，加利福尼亚，商业获得的CytosensorMicrophysiometer来对体外活性进行测量。作为对添加到培养于 transwell中的细胞中的药物的响应，该Microphysiometer监测器以 细胞外酸化的速率发生微小的变化。这种响应与所研究分子的活性成 比例。优选地，其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A 的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物的体外活性比多分散混 合物的体外活性高至少约5％。更优选地，其中混合物中的各共轭物具 有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合 物的体外活性比多分散混合物的体外活性高至少约10％。
还是作为另一个实例，当和与其中混合物中的各共轭物具有相同 的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有 相同数均分子量的多分散的胰岛素药物-低聚物共轭物对糜蛋白酶降 解的抵抗力相比时，其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具 有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有增加的 糜蛋白酶降解抵抗力。对糜蛋白酶的抵抗力相当于用与下面实施例52 所概述的方法相似的方法用糜蛋白酶对试验分子进行消解时剩余的百 分比。正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对其中混合 物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行 测量，所说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。优选地，其 中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素 药物-低聚物共轭物的A混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合 物对糜蛋白酶降解的抵抗力高至少约10％。更优选地，其中混合物中的 各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共 轭物的A混合物对糜蛋白酶降解的抵抗力比多分散混合物对糜蛋白酶 降解的抵抗力高至少约20％。
还是作为另一个实例，其中混合物中的各共轭物具有相同的分子 量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有 比与其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有相同数均分子量的多分散的 胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异低的个体间差异。正如 本领域技术人员所理解的那样，可以用各种方法对其中混合物中的各 共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭 物的混合物的数均分子量和多分散混合物的数均分子量进行测量，所 说的各种方法非限制性地包括，大小排阻色谱法。正如本领域技术人员 所理解的那样，可以用各种方法对个体间差异进行测量。个体间差异优 选地计算如下。测定各个体的剂量响应曲线下面积(AUC)(即，剂量-响 应曲线和基准值之间的面积)。通过将各个体的AUC相加求和并用该和 除以个体的数目来测定对所有个体而言的平均AUC。然后测定对于各个 体而言个体AUC和平均AUC之间差异的绝对值。然后对所得差异的绝 对值求和从而得到表示个体间差异的值。较低的值表示较低的个体间 差异，较高的值表示较高的个体间差异。优选地，其中混合物中的各 共轭物具有相同的分子量并具有式A的结构的胰岛素药物-低聚物共轭 物混合物的个体间差异比多分散混合物的个体间差异低至少约10％。 更优选地，其中混合物中的各共轭物具有相同的分子量并具有式A的结 构的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的个体间差异比多分散混合物 的个体间差异低至少约25％。
本发明实施方案其中混合物中的各共轭物具有相同分子量并具有 式A结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物优选地具有两种或多种 上述性质。更优选地，本发明实施方案其中混合物中的各共轭物具有相 同分子量并具有式A结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物具有三 种或多种上述性质。最优选地，本发明实施方案其中混合物中的各共轭 物具有相同分子量并具有式A结构的胰岛素药物-低聚物共轭物的混合 物具有所有上述四种性质。
还提供了包含本发明实施方案的共轭物混合物的药物组合物。可 根据公知的技术将上述胰岛素药物-低聚物共轭物的混合用药用载体 制备成适于给药的形式。见，例如，Remington，The Science And Practice of Pharmacy(第9版，1995)。在本发明实施方案的药物组 合物的制备中，一般将该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物与惰性 的，特别是可药用的载体进行混和。当然，该载体在与该药物组合物 中任何其它成分可相容的意义上必需是可接受的并且对于个体而言无 害。该载体可以是固体或液体，或者可以是固体和液体，并且优选地 与该胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物一起制备成单位剂量制剂，例 如片剂，其可包含约0.01或0.5％至约95％或99％重量的胰岛素药物 -低聚物共轭物的混合物。可以用任何众所周知的药学技术来制备该药 物组合物，所说的技术非限制性地包括将包含或不包含一种或多种补 充成分的组分进行混和。
本发明实施方案的药物组合物包括适于口服、直肠、局部、吸入(例 如，通过气雾剂被吸入)、口腔(例如，舌下)、阴道、胃肠外(例如，皮下、 肌内、真皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、 局部(即，皮肤和粘膜表面，包括呼吸道表面)和经皮给药的这些物质， 但是在任何给定情况中最适宜的途径将取决于被治疗病症的性质和严 重程度以及所用特定胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的性质。
用于口服给药的药物组合物可以以离散单元如胶囊、扁囊剂、锭 剂或片剂的形式存在，其各自包含预定数量的胰岛素药物-低聚物共轭 物混合物；可以为粉剂或颗粒剂；可以为在水性或非水性液体中的溶液 或混悬液；或可以为水包油或油包水乳剂。该类制剂可以用任何包括将 胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物与适宜载体(其可如上面所表明的 那样包含一种或多种补充成分)相联合步骤的适宜药学方法来进行制 备。一般而言，本发明实施方案的药物组合物是通过将胰岛素药物-低 聚物共轭物的混合物与液态或分割的很细的固态载体或液态载体和分 割的很细的固态载体均匀地仔细进行混和，然后，如果需要的话，将 所得的混合物进行成型来进行制备的。例如，片剂可以通过将包含该胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物并包含或不包含一种或多种补充成 分的粉末或颗粒进行压缩或模塑来进行制备。压缩片可以通过在适宜 的机器中将自由流动形式，如混有或不混有粘合剂、润滑剂、惰性稀 释剂、和/或表面活性/分散剂的粉末或颗粒进行压缩来进行制备。模 塑片可以通过在适宜的机器中将用惰性液态粘合剂润湿的粉状化合物 进行模塑来进行制备。
适于颊(舌下)给药的药物组合物包括在有味道基质，通常是蔗糖 和阿拉伯胶中包含胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的锭剂；和在惰性 基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含该胰岛素药物-低聚物共 轭物混合物的软锭剂。
根据本发明的实施方案，适于胃肠外给药的药物组合物包括该胰 岛素药物-低聚物共轭物混合物无菌的水性和非水性注射溶液，该制剂 优选地与将接收其的接受者的血液等渗。这些制剂可包含抗氧剂、缓 冲剂、制菌剂和使该组合物与接受其的接受者的血液等渗的溶质。水 性和非水性的无菌混悬液可包含混悬剂和增稠剂。该组合物可以存在 于单位\剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并可以在冷冻- 干燥(冷冻干燥)条件下进行储存，其仅需要在使用之前立即添加无菌 的液体载体，例如生理盐水或注射用水。临时的注射溶液和混悬液可 以由无菌粉末、颗粒和上述类型的片剂来进行制备。例如，可提供一种 位于密封容器中的单位剂型的包含胰岛素药物-低聚物共轭物混合物 的可注射的稳定的无菌组合物。该胰岛素药物-低聚物共轭物混合物可 以以能用适宜的可药用载体重组成适于将其注射给个体的液体组合物 的冷冻干燥物的形式被提供。单位剂型一般包含约10mg至约10克胰 岛素药物-低聚物共轭物的混合物。当该胰岛素药物-低聚物共轭物的 混合物基本是水不溶性时，可以以足以将该胰岛素药物-低聚物共轭物 的混合物乳化到水性载体中的足够数量使用足够量的生理上可接受的 乳化剂。一种该类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于直肠给药的药物组合物优选地是以单位剂量栓剂的形式存在 的。其可通过将胰岛素药物-低聚物共轭物的混合物与一种或多种常规 固体载体如可可脂进行混和，然后将所得的混合物成型来进行制备。
适于局部给药于皮肤的药物组合物优选地以软膏、霜、洗剂、糊 剂、凝胶、喷雾剂、或油的形式存在。可用的载体包括凡士林、羊毛 脂、聚乙二醇类、醇类、经皮增强剂、以及其两种或多种的组合。
适于经皮给药的药物组合物可以以适于与接受者的表皮在长时间 内保持亲密接触的离散贴剂的形式存在。适于经皮给药的组合物还可 以通过离子电渗疗法来进行传递(见，例如，Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))并且一般采用该胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的 缓冲或未进行缓冲的水性溶液的形式。适宜的制剂包含载体或 bis\tris缓冲剂(pH 6)或乙醇/水并包含0.1至0.2M的活性成分。
还提供了通过使用有效量的该类药物组合物来治疗需要进行该类 治疗的个体的胰岛素缺乏的方法。任何胰岛素药物-低聚物共轭物混合 物的有效量、其在本发明范围的应用对于不同混合物而言都不同，其 将取决于各种因素，如个体的年龄和病症以及传递途径。该类剂量可 以用本领域技术人员公知的常规药理学方法来确定。作为一种一般性 比例，约0.1至约50mg/kg的剂量将具有疗效，所有的重量都是以该 胰岛素药物-低聚物共轭物混合物的重量为基础的。与较高剂量有关的 毒性将静脉内剂量限制在较低的水平如高至约10mg/kg的水平上，所 有的重量都是以活性成分的重量为基础的。对于口服给药而言可以使 用约10mg/kg至约50mg/kg的剂量形式。对于肌内注射而言，一般 可使用约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量形式。给药频率通常为每天一、 二、或三次或可以根据控制病症的需要来进行给药。或者，该药物-低 聚物共轭物可以通过连续滴注来进行给药。治疗的持续时间取决于被 治疗胰岛素缺陷的类型并且可以长至伴随个体的一生。
还提供了合成本发明共轭物混合物的方法。虽然下面的合成途径 实施方案涉及基本单分散的混合物的合成，但可以用类似的合成途径 来合成本发明实施方案其它的胰岛素药物-低聚物共轭物混合物。
如反应1所说明的那样提供了一种包含聚乙二醇部分的基本单分 散的聚合物的混合物：
R1(OC2H4)nO-X++R2(OC2H4)mOMs→R2(OC2H4)m+nOR1 1
(I) (II) (III)
R1是H或一种亲脂性部分。R1优选地是H、烷基、芳基烷基、芳族 部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、胆甾烯基、或金刚烷基。R1更 优选地是H、低级烷基、或芳族部分。R1最优选地是H、甲基、或苄基。
在式I中，n为1至25。n优选地为1至6。
X+是一种阳离子。X+优选地是化合物如强碱中的任何阳离子，其能 将PEG上的羟基部分离子化。阳离子的实例非限制性地包括钠离子、 钾离子、锂离子、铯离子、和铊离子。
R2是H或一种亲脂性部分。R2优选地是直链或支链烷基、芳基烷 基、芳族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯。R2更优选地是低级烷 基、苄基、具有1至24个碳原子的脂肪酸部分、或具有1至24个碳 原子的脂肪酸部分的酯。R2最优选地是甲基、具有1至18个碳原子的 脂肪酸部分或具有1至18个碳原子的脂肪酸部分的酯。
在式II中，m为1至25。m优选地为1至6。
Ms是甲磺酸酯部分(即，CH3S(O2)-)。
正如反应1所说明的那样，将具有式I结构的化合物的混合物与 具有式II结构的化合物的混合物进行反应，从而得到包含聚乙二醇部 分并具有式III结构的聚合物的混合物。具有式I结构的化合物的混 合物是一种基本单分散的混合物。优选地，在式I化合物的混合物中 至少约96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更优 选地，式I化合物的混合物是一种单分散的混合物。式II化合物的混 合物是一种基本单分散的的混合物。优选地，在式II化合物的混合物 中至少约96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更 优选地，式II化合物的混合物是一种单分散的混合物。式III化合物 的混合物是一种基本单分散的的混合物。优选地，式III化合物的混 合物中至少约96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更优 选地，式III化合物的混合物是一种单分散的混合物。
反应1优选地是在约0℃至约40℃下进行的，更优选地是在约15 ℃至约35℃下进行的，并且最优选地是在室温(约25℃)下进行的。
正如本领域技术人员所理解的那样，反应1可以进行各种时间长 度。反应1优选地进行约0.25、0.5或0.75小时至约2、4或8小时。
反应1优选地是是在一种质子惰性溶剂中进行的，其中所说的质 子惰性溶剂非限制性地如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰 胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氢呋喃(THF)、 二噁烷、乙醚、甲基叔-丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基 吡咯烷酮、四氢萘、十氢萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、 或其混合物。更优选地，该溶剂是DMF、DMA或甲苯。
式I的化合物与式II的化合物的摩尔比优选地高于约1∶1。该摩 尔比更优选地为至少约2∶1。通过提供过量的式I的化合物可确保基本 上所有的式II的化合物都进行了反应，其有助于如下所讨论的式III 的化合物的回收率。
式I的化合物优选地是如下面反应2所说明的那样来进行制备的：
R1和X+如上所述并且式IV化合物的混合物基本是单分散的；优选 地，式IV化合物的混合物中至少约96、97、98或99％的化合物具有 相同的分子量；并且，更优选地，式IV化合物的混合物是一种单分散的 混合物。
能将式IV化合物上PEG部分的羟基部分离子化的各种化合物对本 领域技术人人员而言将是显而易见的。能将羟基部分离子化的化合物 优选地是强碱。更优选地，能将羟基部分离子化的化合物选自氢化钠、 氢化钾、叔-丁醇钠、叔-丁醇钾、丁基锂(BuLi)、和二异丙胺锂。能 将羟基部分离子化的化合物更优选地是氢化钠。
能将式IV化合物PEG部分上的羟基离子化的化合物与式IV化合 物的摩尔比优选地为至少约1∶1，并且更优选地为至少约2∶1。提供过 量的能将羟基部分离子化的化合物可确保式IV的化合物基本上全部反 应以得到式I的化合物。因此，可以避免如果式IV的化合物和式I的 化合物都存在于反应产物中时发生的分离困难的情况。
反应2优选地是在约0℃至约40℃下进行的，更优选地是在约0℃ 至约35℃下进行的，并且最优选地是在约0℃至约室温(约25℃)下进 行的。
正如本领域技术人员所理解的那样，反应2可以进行各种时间长 度。反应2优选地进行约0.25、0.5或0.75小时至约2、4或8小时。
反应2优选地是在一种质子惰性溶剂中进行的，其中所说的质子 惰性溶剂非限制性地如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氢呋喃(THF)、二 噁烷、乙醚、甲基叔-丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡 咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氢萘、十氢萘、1，2二氯苯、1，3-二甲 基-2-咪唑啉酮、或其混合物。更优选地，该溶剂是DMF、二氯甲烷或 甲苯。
式II的化合物优选地是如反应3所说明的那样来进行制备的：
R2和Ms如上所述并且式V的化合物是以式V化合物基本单分散混 合物的形式存在的；在式V化合物的混合物中优选地至少约96、97、98 或99％的化合物具有相同的分子量；并且，更优选地，式V化合物的混 合物是一种单分散的混合物。
Q是一种卤化物，优选地是氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q是甲磺酰基卤化物。该甲磺酰基卤化物优选地是甲磺酰 氯或甲磺酰氟。更优选地，该甲磺酰基卤化物是甲磺酰氯。
该甲磺酰基卤化物与式V的化合物的摩尔比优选地高于约1∶1，并 且更优选地为至少约2∶1。通过提供过量的甲磺酰基卤化物可确保式V 的化合物基本全部进行反应以提供式II的化合物。因此，可以避免如 果式V的化合物和式II的化合物都存在于反应产物中时发生的分离困 难的情况。
反应3优选地是在约-10℃至约40℃下进行的，更优选地是在约0 ℃至约35℃下进行的，并且最优选地是在约0℃至室温(约25℃)下进 行的。
正如本领域技术人员所理解的那样，反应3可以进行各种时间长 度。反应3优选地进行约0.25、0.5或0.75小时至约2、4或8小时。
反应3优选地是在存在脂族胺的情况下进行的，其中所说的脂族 胺非限制性地包括，一甲胺、二甲胺、三甲胺、一乙胺、二乙胺、三乙 胺、单一异丙胺、二异丙胺、单-正-丁胺、二-正-丁胺、三-正-丁胺、 单环己胺、二环己胺、或其混合物。更优选地，该脂族胺是一种叔胺， 如三乙胺。
正如本领域技术人员所理解的那样，各种基本单分散的式V化合物 的混合物可以通过商业途径获得。例如，当R2是H或甲基时，式V的化 合物分别是PEG或mPEG化合物，可以从Aldrich of Milwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland，和/或TCl America of Portland，Oregon商业获得。
当R2是一种亲脂性部分如，例如，高级烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、 胆甾烯基、或金刚烷基时，正如本领域技术人员所理解的那样，式V的 化合物可以用各种方法来获得。式V的化合物优选地是用如下的方法 提供的：
R2-OMs+R3(OC2H4)m-O-X2+→R3(OC2H4)m-OR2 4
(VI) (VII) (VIII)
R3(OC2H4)m-OR2→H(OC2H4)m-OR2 5
(VIII) (V)
R2是一种亲脂性部分，优选地是高级烷基、脂肪酸酯、胆甾烯基、 或金刚烷基，更优选地是脂肪酸的低级烷基酯，并且最优选地是具有1 至18个碳原子的脂肪酸的乙基酯。
正如本领域技术人员所理解的那样，R3是H、苄基、三苯甲基、四 氢吡喃、或其它醇保护基团。
X2+是如上面在描述X+时所描述的阳离子。
m的值如上所述。
对于反应4而言，将式VI化合物的混合物与式VII化合物的混合 物在与反应1所描述的这些条件相似的条件下进行反应。式VI化合物 的混合物是基本单分散的混合物。优选地，在式VI化合物的混合物中 至少约96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更优选地，式 VI化合物的混合物是一种单分散的混合物。式VII化合物的混合物是 一种基本单分散的混合物。优选地，在式VII化合物的混合物中至少 约96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更优选地，式VII 化合物的混合物是一种单分散的混合物。
对于反应5而言，正如本领域技术人员所理解的那样，可以用各种 方法将式VIII的化合物水解，从而将R3部分转化成一种醇。当R3是 苄基或三苯甲基时，该水解优选地是如本领域技术人员所公知的那 样，在存在钯-炭催化剂的情况在用H2进行的。当然，当R3是H时，反 应5是不必要的。
式VI的化合物可以通过商业途径获得或可以参考反应3如上所述 的那样获得。式VII的化合物可参考反应2如上所述的那样获得。
可进一步将基本单分散的包含PEG部分并具有上面式III的结构 的聚合物的混合物与其它基本单分散的包含PEG部分的聚合物进行反 应来延长PEG链。例如，可以使用下面的流程图：
R2(OC2H4)m+n-OMs+R4(OC2H4)p-O-X2+→R2(OC2H4)m+n+p-OR4
(IX) (X) (XI)
Ms、m和n如上面反应1所述；p与n和m相似，并且X2+与上面反 应1所述的X+相似。Q如上面反应3所述。R2如上面反应1所述并优选 地是低级烷基。R1是H。反应6优选地是用与上面反应3所述的方法相 似的方法来进行的。反应7优选地是用与上面反应1所述的方法相似 的方法来进行的。优选地，在式III化合物的混合物中至少约96、97、 98或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更优选地，式III化合物 的混合物是一种单分散的混合物。式X化合物的混合物是一种基本单 分散的混合物。优选地，在式X化合物的混合物中至少约96、97、98 或99％的化合物具有相同的分子量，并且，更优选地，式X化合物的混 合物是一种单分散的混合物。
图1所示的流程图说明了本发明实施方案的一种方法，现在将对 其进行描述。基本单分散的包含聚乙二醇的低聚物的合成是通过基本 单分散的单苄基醚(1)的制备来开始的。将过量的可通过商业途径获得 的基本单分散的聚乙二醇与苄基氯在存在水性氢氧化钠的情况下如 Coudert等人(Synthetic CommuNications，16(1)：19-26(1986))所述 的那样来进行反应。然后通过添加NaH来制备1的钠盐，并使这种钠盐 与由羟基链烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯进行反应。通过催化氢化将甲 磺酸酯置换的产物(3)脱苄基化从而得到醇(4)。可以通过加入甲磺酰 氯来制备这种醇的甲磺酸酯(5)并将其在与基本单分散的聚乙二醇衍 生物单甲醚的钠盐的反应中用作亲电体，从而将该低聚物的聚乙二醇 部分延长至所需的长度，得到了延长的酯(6)。可以在水性碱中将该酯 水解成酸(7)并通过与碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺反应而将其转化 成活性酯(8)。虽然图1中所列举的低聚物是用N-羟基丁二酰亚胺来进 行活化的，但应当清楚的是可以使用其它试剂来对本发明的低聚物进 行活化，所说的其它试剂非限制性地包括活性氯甲酸苯酯类如氯甲酸 对-硝基苯酯、氯甲酸苯酯、3，4-苯基二氯甲酸酯、和3，4-苯基二氯 甲酸酯；tresylation；和乙缩醛形成。
还是参考图1，q为1至24。优选地，q为1至18，并且q更优选 地为4至16。R4是能进行水解从而提供羧酸的部分。R4优选地是低级 烷基并且更优选地是乙基。变量n和m如上面反应1所述。
在这里所述的操作中所用的所有起始材料都可通过商业途径获得 或可用可通过商业途径获得的起始材料用本领域技术人员所公知的方 法来进行制备。
现在将参考下面的实施例来对本发明进行描述。应当意识到这些 实施例是用于对本发明的各方面进行说明，而不是要对如权利要求所 定义的本发明的范围进行限制。
实施例
实施例1至10
除非特别说明，否则实施例1至10的反应是在氮气下用磁力搅拌 进行的。“后处理(Work-up)”表示的是用有机溶剂进行萃取、将有机 相用饱和NaCl溶液进行洗涤、干燥(MgSO4)、并蒸发(旋转蒸发)。薄 层色谱法是用使用硅胶60°F-254进行了预涂布的Merck玻璃板进行 的，用碘蒸气使斑点显色。所有的质谱都是用Macromolecular Resources Colorado State UNiversity，CO进行测定的，并以 m/z，(相对强度)的顺序来进行报告。元素分析和熔点是用Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN进行的。实施例1-10涉及图2所 示的流程图。
实施例1
8-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧基-3，6-二氧杂辛烷(9)
将非多分散的三甘醇单甲醚分子(4.00mL，4.19g，25.5mmol)和 三乙胺(4.26mL，3.09g，30.6mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶 液在冰浴上进行冷却并将其放放置在氮气气氛下。通过添加漏斗向其 中滴加甲磺酰氯(2.37mL，3.51g，30.6mmol)在无水二氯甲烷(20mL) 中的溶液。在完成氯化物添加后10分钟，将该反应混合物从冰浴上取 下并使之回复至室温。将该混合物再搅拌1小时，此时的TLC(用带有 15％MeOH的CHCl3作为洗脱剂)表明没有残留的三甘醇单甲醚。
将该反应混合物用另外75mL二氯甲烷进行稀释并将其连续用饱 和NaHCO3、水和盐水进行洗涤。将有机相用Na2SO4进行干燥，过滤并在 真空下进行浓缩，得到澄清油状物形式的非多分散的化合物9的混合 物(5.31g，86％)。
实施例2
乙二醇单甲醚(10)(m＝4，5，6)
在N2下，向进行着搅拌的非多分散的化合物11(35.7mmol)在无 水DMF(25.7mL)中的溶液中分次加入60％NaH在矿物油中的分散体， 并将该混合物在室温下搅拌1小时。向这种盐12中一次全部加入非多 分散的甲磺酸酯9(23.36)在无水DMF(4ml)中的溶液，然后将该混合 物在室温下搅拌3.5小时。用TLC(12％CH3OH-CHCl3)对反应进程进行 监测。将该反应混合物用等量的1N HCl进行稀释，然后用乙酸乙酯 (2×20ml)进行萃取并将之弃去。通过水溶液的萃取和后处理得到非 多分散的聚合物10(收率82-84％)。
实施例3
3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十二烷醇(10)(m＝4)
油状物；Rf 0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z C15H32O8的计算值为 340.21(M++1)，实测值为341.2。
实施例4
3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十五烷醇(10)(m＝5)
油状物；Rf 0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C17H36O9的计算值为 384.24(M++1)，实测值为385.3。
实施例5
3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂二十八醇(10)(m＝6)
油状物；Rf 0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C19H40O10的计算值 为428.26(M++1)，实测值为429.3。
实施例6
20-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧基-3，6，9，12，15，18-
六氧杂二十烷(14)
如对于9所述的那样从醇13(m＝4)和甲磺酰氯中以定量的收率获 得非多分散的化合物14，其是一种油状物；Rf 0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝ 1∶5)；MS m/z C17H37O10的计算值为433.21(M++1)，实测值为433.469。
实施例7
乙二醇单甲醚(15)(m＝3，4，5)
通过上面化合物10所述的方法由二醇来制备非多分散的化合物 15。
实施例8
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧杂二十一醇(15)(m＝3)
油状物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C21H44O11的计算值 为472.29(M++1)，实测值为472.29。
实施例9
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂
tetratricosanol(15)(m＝4)
油状物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C23H48O12的计算值 为516.31(M++1)，实测值为516.31。
实施例10
3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧杂
heptatricosanol(15)(m＝5)
油状物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C25H52O13的计算值 为560.67(M++1)，实测值为560.67。
实施例11至18涉及图3所示的流程图。
实施例11
六乙烯二醇单苄基醚(16)
将通过将3.99g(100mmol)NaOH溶解于4ml水中所制备的氢氧 化钠溶液缓慢加入到非多分散的六乙烯二醇(28.175g，25ml，100 mmol)中。向其中加入苄基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)并将该反应 混合物在搅拌的同时加热至100℃，加热18小时。然后将该反应混合 物冷却，用盐水(250ml)进行洗涤并用二氯甲烷(200ml×2)进行萃 取。将所合并的有机层用盐水洗涤一次，用Na2SO4进行干燥，过滤并在 真空下进行浓缩，得到暗褐色的油状物。将该粗品混合物用闪柱色谱 法(硅胶，梯度洗脱∶乙酸乙酯至9/1的乙酸乙酯/甲醇)进行纯化，得到 8.099g(70％)黄色油状物形式的非多分散的16。
实施例12
6-甲基磺酰氧基己酸乙酯(17)
将非多分散的6-羟基己酸乙酯(50.76ml，50.41g，227mmol)在 无水二氯甲烷(75ml)中的溶液在冰浴上进行冷却并将其放置在氮气气 氛下。向其中加入三乙胺(34.43ml，24.99g，247mmol)。从添加漏 斗向其中添加甲磺酰氯(19.15ml，28.3g，247mmol)在无水二氯甲烷 (75ml)中的溶液。将该混合物搅拌三个半小时，当冰浴熔化时其缓慢 回复至室温。将该混合物通过硅胶进行过滤，将滤液依次用水、饱和 NaHCO3、水和盐水进行洗涤。将有机相用Na2SO4进行干燥，过滤并在真 空下进行浓缩，得到一种浅黄色的油状物。该粗品的最后纯化是用闪 柱色谱法(硅胶，1/1己烷/乙酸乙酯)进行的，得到一种澄清的无色油 状物形式的非多分散的产品。FAB MS：m/e 239(M+H)，193(M-C2H5O)。
实施例13
6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-苄氧基乙氧基)乙氧基]
乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(18)
将氢化钠(3.225g或60％油分散体，80.6mmol)混悬于80ml 无水甲苯中，将其放置在氮气气氛下并在冰浴上进行冷却。将非多分散 的醇16(27.3g，73.3mmol)在80ml无水甲苯中的溶液加入到该NaH混悬液中。将该混合物在0℃下搅拌30分钟，使之回复至室温并将其 再搅拌5小时，在此期间，该混合物变成一种澄清的褐色溶液。将在 80ml无水甲苯中的非多分散的甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)加 入到该NaH/醇混合物中，将所合并的溶液在室温下搅拌3天。将该反应 混合物用50ml甲醇停止反应并使其通过碱性氧化铝进行过滤。将滤 液在真空下进行浓缩并用闪柱色谱法(硅胶，梯度洗脱：3/1的乙酸乙酯 /己烷至乙酸乙酯)进行纯化，得到一种浅黄色油状物形式的非多分散 的产物(16.52g，44％)。FAB MS：m/e 515(M+H)。
实施例14
6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]
乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(19)
将非多分散的苄基醚18(1.03g，2.0mmol)溶解于25ml乙醇中。 向这种溶液中加入270mg 10％ Pd/C，并将该混合物放在氢气氛下并 将其搅拌4小时，此时，TLC表明起始材料完全消失。将该反应混合物 用硅藻土545过滤以除去催化剂，然后将滤液在真空下进行浓缩，得到 澄清油状物形式的非多分散的标题化合物(0.67g，79％)。FAB MS：m/e 425(M+H)，447(M+Na)。
实施例15
6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基磺酰基乙氧基)
乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(20)
将非多分散的醇19(0.835g，1.97mmol)溶解于3.5ml无水二氯 甲烷中并将其放置在氮气气氛下。向其中加入三乙胺(0.301ml，0.219 g，2.16mmol)并将该混合物在冰浴上进行冷却。在两分钟后，向其中 加入甲磺酰氯(0.16ml，0.248g，2.16mmol)。将该混合物在0℃下 搅拌15分钟，然后在室温下搅拌2小时。将该反应混合物用硅胶进行 过滤以除去氯化三乙铵，然后将将滤液依次用水、饱和NaHCO3、水和盐 水进行洗涤。将有机相用Na2SO4进行干燥，过滤并在真空下进行浓缩。 将残余物用柱色谱法(硅胶，9/1乙酸乙酯/甲醇)进行纯化，得到澄清 油状物形式的非多分散的化合物20(0.819g，83％)。FAB MS：m/e 503(M+H)。
实施例16
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-
乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸乙酯(21)
将NaH(88mg 60％在油中的分散体，2.2mmol)在N2下混悬于无 水甲苯(3ml)中并将其冷却至0℃。向其中加入已经通过与甲苯共沸 蒸馏进行了干燥的非多分散的二甘醇单甲醚(0.26ml，0.26g，2.2 mmol)。将该反应混合物加温至室温并将其搅拌4小时，在此期间，该 浑浊灰色混悬液变澄清并变黄然后变成褐色。向其中加入在2.5ml无 水甲苯中的甲磺酸酯20(0.50g，1.0mmol)。在将其在室温下搅拌一 整夜，通过加入2ml甲醇使该反应淬熄并将所得的溶液用硅胶进行过 滤。将滤液在真空下进行浓缩，FAB MS：m/e 499(M+H)，521(M+Na)。 通过用制备色谱(硅胶，19/3氯仿/甲醇)进行另外的纯化，得到澄清的 黄色油状物形式的非多分散的产物(0.302g 57％)。FAB MS：m/e 527(M+H)，549(M+Na)。
实施例17
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-
乙氧基}乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸(22)
将非多分散的酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中 搅拌18小时。在18小时后，将该混合物在真空下进行浓缩以除去醇 并将残余物溶解于另外10ml水中。将该水性溶液用2N HCl酸化至 pH为2并将产物萃取进二氯甲烷(30ml×2)中。然后将所合并的有 机层用盐水(25ml×2)进行洗涤，用Na2SO4进行干燥，过滤并在真空下 进行浓缩，得到黄色油状物形式的非多分散的标题化合物(0.147g，62 ％)。FAB MS：m/e 499(M+H)，521(M+Na)。
实施例18
6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基) -乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)
将非多分散的酸22(0.209g，0.42mmol)溶解于4ml无水二氯甲 烷中并在N2气氛下将其加入到已经包含NHS(N-羟基丁二酰亚 胺)(57.8mg，0.502mmol)或EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐)(98.0mg，0.502mmol)的干燥烧瓶中。将该溶液在室 温下搅拌一整夜，用硅胶过滤以除去过量的试剂和由EDC形成的脲。 将滤液在真空下进行浓缩，得到暗黄色油状物形式的非多分散的产物 (0.235g，94％)。FAB MS：m/e 596(M+H)，618(M+Na)。
实施例19至24涉及图4所示的流程图。
实施例19
三甘醇单甲醚的甲磺酸酯(24)
向在冰浴上冷却至0℃的CH2Cl2(100mL)中加入单分散的三甘醇单 甲醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙胺(29.5mL，0.22mol)并将该 溶液在0℃下搅拌15分钟，然后向其中滴加甲磺酰氯(13.8mL，0.18 mol，溶解于20mL CH2Cl2中)。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟， 使之加温至室温，然后将其搅拌2小时。将粗反应混合物用硅藻土(用 CH2Cl2～200mL进行了洗涤)进行过滤，然后用H2O(300mL)、5％ NaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、饱和NaCl(300mL)进行洗涤，用MgSO4进行干燥，然后蒸发至干燥。然后将该油状物在真空管道中放置～2小 时以确保干燥，得到黄色油状物形式的非多分散的标题化合物(29.15 g，收率80％)。
实施例20
七甘醇单甲醚(25)
向非多分散的四甘醇(51.5g，0.27mol)在THF(1L)中的溶液中加 入叔-丁醇钾(14.8g，0.13mol，在约30分钟内分成小部分加入)。然 后，将该反应混合物搅拌1小时，然后向其中滴加溶解于THF(90mL) 中的24(29.15g，0.12mol)并将该反应混合物搅拌一整夜。将粗反应 混合物用硅藻土(用CH2Cl2，～200mL进行了洗涤)进行过滤并将其蒸发 至干燥。然后将该油状物溶解于HCl(250mL，1N)中并用乙酸乙酯(250 mL)进行洗涤以除去过量的24。可能需要另外的乙酸乙酯(125mL)洗 涤以除去剩余的24。将水相用CH2Cl2(125mL体积)反复进行洗涤直至 已经从水相中除去了大多数25。第一次萃取液将包含24、25、和偶联 二聚物(dicoupled)副产品，并应当用HCl(125mL，1N)进行后萃取。 合并有机层并将其蒸发至干燥。然后，将所得的油状物溶解于 CH2Cl2(100mL)中并将其用H2O(50mL体积)反复进行洗涤直至25被除 去。将水性部分合并，总体积为500mL，向其中加入NaCl直至溶液变 浑浊，然后将其用CH2Cl2(2×500mL)进行洗涤。合并有机层，用MgSO4进行干燥，然后将其蒸发至干燥，得到油状物形式的非多分散的标题 化合物(16.9g，收率41％)。可将重复进行一步或多步纯化操作以确 保高纯度。
实施例21
8-溴辛酸酯(octoanate)(26)
向8-溴辛酸(5.0g，22mmol)在乙醇(100mL)中的溶液中加入 H2SO4(0.36mL，7.5mmol)并将该反应在搅拌下加热至回流加热3小 时。将该粗反应混合物冷却至室温并将其用H2O(100mL)、饱和 NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)进行洗涤，用MgSO4进行干燥，然后 将其蒸发至干燥，得到一种澄清的油状物(5.5g，收率98％)。
实施例22
MPEG7-C8酯(27)的合成
向非多分散的化合物25(3.0g，8.8mmol)在醚(90mL)中的溶液 中加入叔-丁醇钾(1.2g，9.6mmol)并将该反应混合物搅拌1小时。 然后向其中滴加溶解于乙醚(10ml)中的非多分散的化合物26(2.4 g，9.6mmol)，并将该反应混合物搅拌一整夜。将该粗反应混合物用硅 藻土(用CH2Cl2，～200mL进行了洗涤)进行过滤并将其蒸发至干燥。将 所得的油状物溶解于乙酸乙酯中并用H2O(2×200mL)进行洗涤，用 MgSO4进行干燥，并蒸发至干燥。用柱色谱法(硅胶，乙酸乙酯至乙酸乙 酯/甲醇，10∶1)进行处理，得到澄清的油状物形式的标题化合物(0.843 g，收率19％)。
实施例23
MPEG7-C8酸(28)
向非多分散化合物27的油(0.70g，1.4mmol)中加入1N NaOH(2.0 mL)并将该反应混合物搅拌4小时。将该粗反应混合物进行浓缩，酸化 (pH～2)，用NaCl进行饱和，并将其用CH2Cl2(2×50mL)进行洗涤。 合并有机层，将其用饱和NaCl进行洗涤，用MgSO4进行干燥，并蒸发至 干燥，得到澄清油状物形式的非多分散的标题化合物(0.35g，收率53 ％)。
实施例24
MPEG7-C8酸(29)的活化
将非多分散的mPEG7-C8-酸28(0.31g，0.64mmol)溶解于3ml无 水二氯甲烷中，然后加入N-羟基丁二酰亚胺(0.079g，0.69mmol)或 EDCI-HCl(135.6mg，0.71mmol)在无水二氯甲烷中溶液。将该反应搅 拌几小时，然后将其用1N HCl、水进行洗涤，用MgSO4进行干燥，过滤 并进行浓缩。将粗材料用闪柱色谱法进行纯化，浓缩，得到澄清油状 物形式的非多分散的标题化合物并将其通过真空进行干燥。
实施例25至29涉及图5所示的流程图。
实施例25
10-羟基癸酸酯(30)
向非多分散的10-羟基癸酸(5.0g，26.5mmol)在乙醇(100mL) 中的溶液中加入H2SO4(0.43mL，8.8mmol)并在搅拌下将该反应加热至 回流加热3小时。将该粗反应混合物冷却至室温并用H2O(100mL)、饱 和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)进行洗涤，用MgSO4进行干燥， 然后蒸发至干燥，得到澄清油状物形式的非多分散的标题化合物(6.9g， 收率98％)。
实施例26
10-羟基癸酸酯的甲磺酸酯(31)
向CH2Cl2(27mL)的溶液中加入非多分散的10-羟基癸酸酯30(5.6 g，26mmol)并将其在冰浴上冷却至0℃。然后向其中加入三乙胺(5 mL，37mmol)并将其在0℃下搅拌15分钟。然后，向其中加入溶解于 CH2Cl2(3mL)中的甲磺酰氯(2.7mL，24mmol)并将该反应混合物在0 ℃下搅拌30分钟，将冰浴除去，然后将该反应在室温下再搅拌2小时。 将该粗反应混合物用硅藻土(用CH2Cl2，80mL进行了洗涤)进行过滤， 然后将滤液用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、 饱和NaCl(100mL)进行洗涤，用MgSO4进行干燥，并蒸发至干燥，得到 淡黄色油状物形式的非多分散的标题化合物(7.42g，收率97％)。
实施例27
MPEG7-C10酯(32)
向非多分散的七甘醇单甲醚25(2.5g，7.3mmol)在四氢呋喃(100 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.194g，8.1mmol)并将该反应混合物搅 拌1小时。然后向其中滴加溶解于四氢呋喃(10mL)中的非多分散的 10-羟基癸酸酯的甲磺酸酯31(2.4g，8.1mmol)，并将该反应混合物搅 拌一整夜。将该粗反应混合物用硅藻土(用CH2Cl2，～200mL进行了洗 涤)进行过滤，然后将其蒸发至干燥。将所得的油状物溶解于乙酸乙酯 中并将其用H2O(2×200mL)进行洗涤，用MgSO4进行干燥，蒸发至干燥， 用色谱法进行处理(硅石，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，然后用色谱法进行处 理(硅石，乙酸乙酯)，得到澄清油状物形式的非多分散的标题化合物 (0.570g，收率15％)。
实施例28
MPEG7-C10酸(33)
向非多分散的mPEG7-C10酯32的油(0.570g，1.1mmol)中加入 1N NaOH(1.6mL)并将该反应混合物搅拌一整夜。将该粗反应混合物 进行浓缩，酸化(pH～2)，用NaCl饱和，并用CH2Cl2(2×50mL)进行洗 涤。合并有机层，用饱和NaCl(2×50mL)进行洗涤，用MgSO4进行干 燥，并蒸发至干燥，得到澄清油状物形式的非多分散的标题化合物 (0.340g，收率62％)。
实施例29
MPEG7-C10酸(34)的活化
用与上面实施例24所描述的操作相似的操作来进行非多分散的酸 33的活化。
实施例30和31涉及图6所示的流程图。
实施例30
C18(PEG6)低聚物(36)的合成
将非多分散的硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)缓慢添加到PEG6(5 g，17.7mmol)和吡啶(0.97g，12.4mmol)在苯中的混合物中。将该反 应混合物搅拌几小时(～5)。然后用使用乙酸乙酯/甲醇作为展开溶剂 的TLC跟随该反应。然后，将该反应混合物用水进行洗涤，用MgSO4进行干燥，浓缩，真空干燥。用FABMS对进行了纯化的非多分散的化合 物36进行分析：m/e 549/M+H。
实施例31
C18(PEG6)低聚物的活化
非多分散的C18(PEG6)低聚物的活化是分两步进行的：
1)将非多分散的硬脂酰-PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶解于甲 苯中并将其加入到用冰浴进行冷却的碳酰氯溶液中(10ml，20％，在甲 苯中)。将该反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后将其在室温下搅拌 3小时。然后，将碳酰氯或甲苯蒸馏掉并将剩下的非多分散的硬脂酰 PEG氯甲酸酯37用P2O5干燥一整夜。
2)向非多分散的硬脂酰PEG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol) 和TEA(128mg，1.27mmol)在无水二氯甲烷中的溶液中加入N-羟基丁 二酰亚胺(NHS)在二氯甲烷中的溶液。将该反应混合物搅拌16小时， 然后将其用水进行洗涤，用MgSO4进行干燥，过滤，浓缩，真空干燥，得 到非多分散的被活化的C18(PEG6)低聚物38。
实施例32至37涉及图7所示的流程图。
实施例32
四甘醇单苄基醚(39)
向非多分散的四甘醇的油(19.4g，0.10mol)中加入NaOH溶液 (4.0g在4.0mL中)并将该反应搅拌15分钟。然后，向其中加入苄 基氯(3.54mL，30.8mmol)并将该反应混合物加热至100℃并将其搅拌 一整夜。将该反应混合物冷却至室温，用饱和NaCl(250mL)进行稀释， 然后用CH2Cl2(2×200mL)进行洗涤。合并有机层，用饱和NaCl进行 洗涤，用MgSO4进行干燥，然后用色谱法进行处理(硅石，乙酸乙酯)，得 到黄色油状物形式的非多分散的标题化合物(6.21g，收率71％)。
实施例33
四甘醇单苄基醚的甲磺酸酯(40)
向CH2Cl2(20mL)的溶液中加入非多分散的四甘醇单苄基醚 39(6.21g，22mmol)并将其在冰浴上冷却至0℃。然后向其中加入三 乙胺(3.2mL，24mmol)并将该反应混合物在0℃搅拌15分钟。然后， 向其中加入溶解于CH2Cl2(2mL)中的甲磺酰氯(1.7mL，24mmol)并将 该反应混合物在0℃下搅拌30分钟，除去冰浴并将该反应在室温下再 搅拌2小时。将该粗反应混合物用硅藻土(用CH2Cl2，80mL进行了洗涤) 进行过滤，将滤液用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100 mL)、饱和NaCl(100mL)进行洗涤，然后用MgSO4进行干燥。将所得的 黄色油状物用使用包含活性炭(10g)的硅石垫的色谱法进行处理，得 到澄清油状物形式的非多分散的标题化合物(7.10g，收率89％)。
实施例34
八甘醇单苄基醚(41)
向包含氢化钠(0.43g，18mmol)的四氢呋喃(140mL)溶液中滴加 在四氢呋喃(10mL)中的非多分散的四甘醇(3.5g，18mmol)溶液并将 该反应混合物搅拌1小时。然后，向其中滴加溶解于四氢呋喃(10mL) 中的非多分散的四甘醇单苄基醚40(6.0g，16.5mmol)的甲磺酸酯并 将该反应混合物搅拌一整夜。将该粗反应混合物用硅藻土(用 CH2Cl2，250mL进行了洗涤)进行过滤并将滤液用H2O进行洗涤，用MgSO4进行干燥，并蒸发至干燥。将所得的油状物用色谱法(硅石，乙酸乙酯/ 甲醇，10∶1)和色谱法(硅石，氯仿/甲醇，25∶1)进行处理，得到澄清油状 物形式的非多分散的标题化合物(2.62g，收率34％)。
实施例35
硬脂酸酯PEG8-苄基(43)的合成
向进行着搅拌的进行了冷却的非多分散的八甘醇单苄基醚 41(0.998g，2.07mmol)和吡啶(163.9mg，2.07mmol)中加入在苯中 的非多分散的硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)。将该反应混合物搅 拌一整夜(18小时)。下一天将该反应混合物用水进行洗涤，用MgSO4进行干燥，浓缩，真空干燥。然后将该粗品用使用10％甲醇/90％氯仿 的硅胶闪柱色谱法进行处理。将包含产物的级分合并，浓缩，真空干 燥，得到非多分散的标题化合物。
实施例36
硬脂酸酯-PEG8-苄基的氢解
向非多分散的硬脂酸酯-PEG8-Bz143(0.854g 1.138mmol)的甲醇 溶液中加入Pd/C(10％)(钯，10％wt.在活性碳上)。将该反应混合物 在氢气下搅拌一整夜(18小时)。然后，将该溶液过滤，浓缩，用使用 10％甲醇/90％氯仿的闪柱色谱法进行纯化，收集Rt＝0.6的级分，浓 缩，干燥，得到非多分散的酸44。
实施例37
C18(PEG8)低聚物的活化
如上面实施例31中硬脂酸酯-PEG6所述的那样来进行非多分散的 硬脂酸酯-PEG8低聚物的两步活化，得到非多分散的进行了活化的 C18(PEG8)低聚物45。
实施例38
活性三甘醇单甲基低聚物的合成
下面的说明涉及图8所示的流程图。将包含20％碳酰氯的甲苯 (100ml，约18.7g，189mmol碳酰氯)在N2气氛下冷却至0℃。将非 多分散的mTEG(三甘醇，单甲醚，7.8g，47.5mmol)溶解于25mL无水 乙酸乙酯中并将其加入到进行了冷却的碳酰氯溶液中。将该混合物在0 ℃下搅拌1小时，然后使之加温至室温并将其再搅拌两个半小时。通 过真空蒸馏除去剩余的碳酰氯、乙酸乙酯和甲苯，剩下一种澄清油状 残余物形式的非多分散的mTEG氯甲酸酯46。
将该非多分散的残余物46溶解于50mL无水二氯甲烷中，向其中 加入TEA(三乙胺，6.62mL，47.5mmol)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺，5.8 g，50.4mmol)。将该混合物在干燥空气下，在室温下搅拌二十小时， 在此期间，出现大量白色沉淀。将该混合物过滤以除去这种沉淀并将 其在真空下进行浓缩。将所得的油状物47用二氯甲烷进行吸收并将其 用冷去离子水洗涤两次，用1N HCl洗涤两次并用盐水洗涤一次。将有 机层用MgSO4进行干燥，过滤，得到澄清的淡黄色油状物形式的非多分 散的标题化合物。如果需要的话，可将该NHS酯用使用EtOAc作为洗脱 剂的硅胶上的闪柱色谱法进行进一步纯化。
实施例39
活性棕榈酸酯-TEG低聚物的合成
下面的说明涉及图9所示的流程图。将非多分散的棕榈酸酐(5 g；10mmol)溶解于无水THF(20mL)中并在室温下进行搅拌。向这种进 行着搅拌的溶液中加入3mol过量的吡啶，然后加入非多分散的三甘 醇(1.4mL)。将该反应混合物搅拌1小时(反应过程用TLC；乙酸乙酯- 氯仿；3∶7来进行监测)。在反应结束时，除去THF并将产物与10％H2SO4进行混和，然后用乙酸乙酯(3×30mL)进行萃取。将所合并的提取物 依次用水、盐水进行洗涤，用MgSO4进行干燥，蒸发，得到非多分散的 产物48。在搅拌的同时将N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3mmol)在 DMF(约10mL)中的溶液加入到非多分散的产物48(1mmol)在10mL 无水DMF的溶液中。向该反应混合物中缓慢加入氢化钠(3mmol)。将 该反应混合物搅拌几小时(例如，5小时)。向其中加入乙醚以使得活性 低聚物沉淀。将这种过程重复三次，最后将产物干燥。
实施例40
活性六甘醇单甲基低聚物的合成
下面的说明涉及图10所示的流程图。用与上面实施例39中非多 分散的三甘醇的制备方法相类似的方法来制备非多分散的活性六甘醇 单甲醚。将在甲苯溶液中的20％碳酰氯溶液(35mL，6.66g，67.4mmol 碳酰氯)在N2气氛下在冰/盐水浴上进行冷却。将非多分散的六甘醇 50(1.85mL，2.0g，6.74mmol)溶解于5mL无水EtOAc中并通过注射 器向其中加入碳酰氯溶液。将该反应混合物在冰浴上持续搅拌一小 时，除去冰浴，将其在室温下再搅拌2.5小时。通过真空蒸馏除去碳 酰氯、EtOAc、和甲苯，剩下一种澄清的油状残余物形式的非多分散的 化合物51。
将该非多分散的残余物51溶解于20mL无水二氯甲烷中并将其放 在一种干燥的惰性气氛下。向其中加入三乙胺(0.94mL，0.68g，6.7 mmol)，然后向其中加入NHS(N-羟基 丁二酰亚胺，0.82g，7.1mmol)， 将该反应混合物在室温下搅拌18小时。将该混合物用硅胶进行过滤以 除去白色沉淀并将其在真空下进行浓缩。将残余物用二氯甲烷进行吸 收，用冷水洗涤两次，用1N HCl洗涤一次并用盐水洗涤一次。将有 机相用Na2SO4进行干燥，过滤，浓缩。用闪柱色谱法(硅胶，EtOAc)进 行最后的纯化，得到UV活性的非多分散的NHS酯52。
实施例41
胰岛素-低聚物共轭物的合成
在224℃下向在25mL二甲基亚砜中的人胰岛素(锌或无 锌，2g，0.344mmol，以干重为基础)(纯度＞99％)中加入8mL三乙 胺(纯度＞99％)。将所得的混合物在224℃下搅拌5至10分钟。在 搅拌下，在224℃下向其中迅速加入在7.5mL乙腈中的上面实施例 18的活性低聚物(0.188g，0.36mmol，以100％活化为基础)。将该 溶液搅拌45分钟并用温度低于27℃的醋酸使之淬熄。用分析HPLC对 该反应进行监测。这种反应条件以40-60％的收率得到单共轭的PEG7- 己基-胰岛素(PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭物)。将该粗反应混合物 (PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭，40-60％，未反应的胰岛素为8-25％， 相关物质为15-35％)进行透析或二次过滤(difiltered)(除去3000- 3500分子量，MWCO)以除去有机溶剂和小分子量的杂质，用醋酸铵缓冲 剂进行交换并将其冷冻干燥。
用分析HPLC对该在B29位上单共轭的PEG7-己基-胰岛素的共轭 反应进行监测。这种分析HPLC法使用Waters Delta-Pak C18柱，150 ×3.9mm I.D.，5μm，300。溶剂系统的组成为溶剂B：0.1％在50/50 甲醇/水中的TFA，和溶剂D：0.1％在甲醇中的TFA。该梯度系统如下： 时间(分钟) 溶剂B％ 溶剂D％ 流速(mL/分钟) 开始(0) 100 0 1.00 20 40 60 1.00 25 100 0 1.00
实施例42
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例24的活性低聚物进行 共轭。
实施例43
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例31的活性低聚物进行 共轭。
实施例44
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例37的活性低聚物进行 共轭。
实施例46
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例38的活性低聚物进行 共轭。
实施例47
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例39的活性低聚物进行 共轭。
实施例48
用实施例41的操作来使人胰岛素与实施例40的活性低聚物进行 共轭。
实施例49
人胰岛素-低聚物共轭物的混合物的分散系数的测定
人胰岛素-低聚物共轭物混合物的分散系数的测定如下。提供一种 人胰岛素-低聚物共轭物的混合物，例如如上面实施例41所述的那样 来提供。将该混合物的第一份样品用HPLC进行纯化以将样品中的各种 人胰岛素-低聚物共轭物分离开。假定各分离的级分包含一种纯单分散 共轭物混合物，则“n”等于所收集的级分数。该混合物可包括一种或 多种下面的共轭物，其是通过表明共轭位置，然后表明共轭度来进行 描述的：GlyA1单共轭物；PheB1单共轭物；LysB29单共轭物；GlyA1，PheB1二 共轭物；GlyA1，LysB29二共轭物；PheB1，LysB29二共轭物；和/或 GlyA1，PheB1，LysB29三共轭物。用质谱对各分离出来的混合物级分进行 分析以测定该级分的质量，其使得各被分离的级分被分类成单-、二-、 或三-共轭物并提供了对于样品中各共轭物而言的变量“Mi”的值。
用HPLC对该混合物的第二份样品进行分析以提供一种HPLC痕 量。假定摩尔吸收率不因为共轭而改变，则由与特定混合物相应的HPLC 痕量峰的曲线下面积占所有HPLC痕量峰的总曲线下面积的百分比可以 获得特定共轭物在该混合物中的重量百分比。收集样品并将其冷冻干 燥以测定干样品无水的克重量。将样品的克重量乘以各组分在样品中 的重量百分比以测定样品中各共轭物的克重量。通过将样品中特定共 轭物的克重量除以特定共轭物的质量并乘以系数——Avagadro’s数 (6.02205×1023摩尔-1)，上面所测定的Mi来测定对于特定共轭物(ith共轭物)而言的变量“Ni”，从而得到样品中特定共轭物的分子数Ni。 然后用n、测得的各共轭物的Mi、和各共轭物的Ni来计算分散系数。
实施例50
得自粗混合物的B29修饰的PEG7-己基-胰岛素，单共轭物的纯化
用制备HPLC系统由实施例41的粗混合物来进行B29单共轭的 PEG7-己基-胰岛素的纯化。将冷冻干燥的粗混合物(0.5g，组成：B29 单共轭的PEG7-己基-胰岛素40-60％，未反应的胰岛素8-25％，相关物 质15-35％)溶解于5-10mL 0.01M醋酸铵缓冲剂(pH 7.4)中并将其 加载到用0.5％三乙胺/0.5％磷酸缓冲剂TEAP A)进行了平衡的C-18 反相HPLC柱(150×3.9mm)上。用使用TEAP A和TEAP B(80％乙腈 和20％TEAP A)的溶剂系统对该柱进行梯度洗脱。对于得自该粗混合 物的PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭物的制备HPLC纯化而言，该梯度 系统如下： 时间(分钟) TEAP A％ TEAP B％ 流速(mL/分钟) 开始(0) 70 30 30 45 64 36 30 105 60 40 30 115 40 60 30 125 15 85 30 135 15 85 30
用HPCL对级分进行分析并将PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭物纯 度＞97％的产物级分收集。通过用醋酸铵缓冲剂(0.01M，pH 7.4)透析 或渗漉(MWCO 3000-3500)来除去洗脱缓冲剂和溶剂并将其交换成醋酸 铵缓冲剂，然后冷冻干燥，得到PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭物的白 色粉末(纯度＞97％)。
用相同的柱和溶剂系统，按照实施例41中对反应进行监测时所用 的方法来用一种分析HPLC对PEG7-己基-胰岛素，B29单共轭物进行分 析。但是，其梯度条件如下： 时间(分钟) 溶剂B％ 溶剂D％ 流速(mL/分钟) 开始(0) 100 0 1.00 30 10 90 1.00 35 100 0 1.00
实施例51
细胞敏感度(Cytosensor)研究
将已经血清剥离了约18小时的Colo 205(得自ATCC，目录 #CCL-222的结肠直肠腺癌细胞)细胞混悬于3∶1的Cytosensor低-缓 冲RPMI-1640基质：Cytosensor琼脂糖截留介质中并以100,000个细 胞/10μL小滴的量将其接种到Cytosensor囊杯中。使细胞在 Cytosensor上与该低-缓冲RPMi-1640基质以每分钟100μL的流速 平衡约3小时直至基准酸化速率稳定。将胰岛素药物(胰岛素或胰岛素 共轭物)用低缓冲RPMI-1640基质稀释至50nM并以100μL/分钟的 速度将其应用于细胞20分钟。在进行该类接触后，将药物溶液撤掉并 在只使用连续流动的低-缓冲介质的情况下对细胞再次进行灌注。连续 收集数据直至酸化速率回复至基准水平(从使用药物溶液开始约1小 时)。结果如图14所示。正如图14中所用的那样，胰岛素是人胰岛 素；PEG4是非多分散的mPEG4-己基-胰岛素，单共轭物的混合物；PEG10 是非多分散的mPEG10-己基-胰岛素，单共轭物的混合物；PEG7是非多 分散的mPEG7己基-胰岛素，单共轭物的混合物；PEG7AVG是多分散的 mPEG7AVG-己基-胰岛素，单共轭物的混合物。
实施例52
酶稳定性
糜蛋白酶消化是在37℃下，在一种磷酸盐缓冲剂(pH7.4)中，在 振摇的水浴上进行的。该胰岛素/胰岛素共轭物浓度为0.3mg/mL。糜 蛋白酶浓度为2个单位/mL。在所指出的时间点取出100μL凝胶样 品并将其用25μL 1∶1的0.1％三氟醋酸∶异丙醇混合物停止反应。 用反相HPLC对样品进行分析并通过计算曲线下面积来测定胰岛素/胰 岛素共轭物的相对浓度。
正如图15所用的那样，胰岛素是人胰岛素；PEG4是非多分散的 mPEG4-己基-胰岛素，单共轭物的混合物；PEG10是非多分散的mPEG10- 己基-胰岛素，单共轭物的混合物；PEG7是非多分散的mPEG7-己基-胰 岛素，单共轭物的混合物；PEG7AVG是多分散的mPEG7AVG-己基-胰岛素，单 共轭物的混合物。
实施例53
剂量依赖活性
一种用于对制剂进行评估的有效动物模型使用标准的禁食比格尔 犬。给这些狗使用0.25mg/kg至1.0mg/kg的胰岛素共轭物以对各 种制剂的功效进行评估。用这种模型来证明本发明的胰岛素共轭物以 剂量依赖的方式提供比多分散的胰岛素共轭物更低的葡萄糖水平，其 中所说的多分散物只是为了进行比较，其不是本发明的组成部分。
狗实验的方案需要就在给药前的时间零点对血液中的葡萄糖进行 测量。然后，将固体口服剂型形式的制剂插入到狗嘴中。在第15、30、 60和120分钟取血并对葡萄糖水平进行测量和作图。葡萄糖水平越 低，该胰岛素共轭物的活性越高。在图16中，葡萄糖下降，因此，表明 本发明共轭物的活性是剂量依赖性的。为了进行比较，图17表明胶囊 制剂形式的多分散的胰岛素共轭物的葡萄糖下降的剂量依赖性比本发 明的共轭物低，其中所说的多分散的胰岛素共轭物不是本发明的一部 分。
实施例54
活性和个体间差异
一种用于对制剂进行评估的有效动物模型使用标准的禁食比格尔 犬。给这些狗使用0.25mg/kg胰岛素共轭物以对各种制剂的功效进行 评估。用这种模型来证明本发明的胰岛素共轭物可提供比多分散的胰 岛素共轭物的个体间差异低的个体间差异和比其高的活性，其中所说 的多分散物只是为了进行比较，其不是本发明的组成部分。
狗实验的方案需要就在给药前的时间零点对血液中的葡萄糖进行 测量。然后，将液体口服剂型形式的制剂喷射到狗嘴中。在各种情况 中，给狗使用0.25mg/kg的这种溶液。在第15、30、60和120分钟 取血并对葡萄糖水平进行测量和作图。葡萄糖水平越低，该胰岛素共 轭物的活性就越高。在图18、19和20中，用PEG4-己基-胰岛素，单共 轭物；PEG7-己基胰岛素，单共轭物；或PEG10-己基-胰岛素，单共轭物 所得的结果分别表明本发明的这些PEG共轭物产生的个体间差异低于 图21所示多分散的PEG7AVG-己基-胰岛素，单共轭物的个体间差异并 且其产生的活性高于如图21所示多分散的PEG7AVG-己基-胰岛素，单共 轭物的活性，其中所说的多分散物只是为了进行比较，其不是本发明 的组成部分。
在本说明书中，已经公开了本发明典型的优选实施方案，虽然使 用了特定的术语，但是其是一般性并仅仅是描述性的使用，并不是要 进行限制，下面的权利要求对本发明的范围进行了说明。