悬崖菊组织培养方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711239270.8 (22)申请日 2017.11.30 (71)申请人 金华市铁骑士生物科技有限公司 地址 322300 浙江省金华市婺城区白龙桥 镇高桥社区666号 (72)发明人 全盈园 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 李静 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 悬崖菊组织培养方法 (57)摘要 本发明公开了悬崖菊组织培养方法， 包括： 灭菌、 诱导、 增殖、 移栽， 取。

2、悬崖菊茎尖部位消毒 后切成小块， 将悬崖菊茎尖小块置于含有粉状活 性炭的MS培养基中诱导， 然后将健壮茎尖组织接 入含有生长素的MS培养基中进行增殖培养， 将培 养出的幼苗经炼苗后进行移栽。 有益效果为： 活 性炭有助于诱导与分化愈伤组织， 提高逾伤组织 活力； 炼苗可以使幼苗迅速适应栽培基质的土质 环境， 可以缩短缓苗时间， 增强对低温、 大风等的 抵抗能力， 使悬崖菊迅速成活成长， 植株健壮， 长 势旺盛， 完成组培阶段。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107896992 A 2018.04.13 CN 107896992 A 1.悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述悬崖菊组织培养。

3、方法包括： 灭菌： 取悬崖菊茎尖部位， 用中性洗涤剂漂洗5-8分钟， 再用流水冲洗30-45分钟， 然后 用酒精灭菌， 无菌水冲洗2-3遍， 再用氯化汞溶液灭菌， 无菌水冲洗2-3次， 将悬崖菊茎尖切 成小块； 诱导： 将海绵用蒸馏水洗净并在体积分数为70-75的酒精中浸泡20-30分钟， 再用蒸 馏水洗净备用； 将一块海绵卷成中空的筒状体， 底部固定一块圆形海绵， 筒状体下部的海绵 条插入装有MS培养基的罐头瓶中， 培养基上放置粉状活性炭， 以玻璃棒插8-10个小孔至基 质底部， 在每个小孔中垂直插入1-2片茎尖小块， 培养8-12天； 增殖： 取新鲜的MS培养基， 遮光条件下依次加入蔗糖、。

4、 蜂蜜、 维生素B1、（R） - （-） -2,2-二 苯基环戊醇、 6-苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 吲哚乙酸、 赤霉素混合成培养液， 将经诱导培养产生 的健壮茎尖组织接入培养基中培养15-18天； 移栽： 将生根良好的增培苗移出培养室并置于室温下炼苗2-3天， 然后向瓶内加少许水 刚没过培养基， 继续炼苗1-2天， 小心取出小苗， 冼净基部培养基， 用多菌灵可湿性粉剂稀释 液与高锰酸钾溶液浸泡消毒7-9分钟， 取出在阴凉处晾10-15分钟后移栽到栽培基质中即 可。 2.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述灭菌步骤中酒精的质 量分数为75-95%， 灭菌时间为15-30秒。

5、； 氯化汞的质量分数为0.08-0.12%， 灭菌时间为8-12 分钟。 3.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述诱导步骤中， 海绵的 长度为13-15cm， 宽度为13-15c， 厚度为0.4-0.7cm。 4.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述诱导步骤中， 粉状活 性炭的厚度为0.3-0.5cm。 5.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述诱导步骤中， 培养温 度为22-24， 光照时间为12-16小时， 光照强度为2500-3000lx。 6.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述增殖步骤中， 。

6、蔗糖的 添加量为25-28g/L， 蜂蜜为20-22g/L， 维生素B1为0.1-0.15g/L，（R） - （-） -2,2-二苯基环戊 醇为0.012-0.022 g/L， 6-苄氨基腺嘌呤为1.0-1.2mg/L， 萘乙酸为0.6-0.8mg/L， 吲哚乙酸 为0.6-0.8mg/L， 赤霉素为0.03-0.05mg/L。 7.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所述增殖步骤中的培养添 加为： 光照12-14小时、 光照强度2500-3500lx、 温度24-26， 黑暗10-12小时、 温度15-17。 8.根据权利要求1所述的悬崖菊组织培养方法， 其特征在于： 所。

7、述移栽过程中所用多菌 灵可湿性粉剂的稀释倍数为1500-2000倍液， 高锰酸钾溶液的质量分数为0.022-0.025%。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107896992 A 2 悬崖菊组织培养方法 技术领域 0001 本发明涉及植物培养领域， 尤其是涉及悬崖菊组织培养方法。 技术背景 0002 悬崖菊是小菊的一种整枝形式。 通常选用单瓣型、 分枝多、 枝条细软、 开花繁密的 小花品种， 仿效山间野生小菊悬垂的自然姿态， 整枝成下垂的悬崖状。 栽培的关键是用竹架 诱引主干向前及适时摘心。 鉴赏的标准是花枝倒垂， 主干在中线上， 侧枝分布均匀， 前窄后 宽， 花朵丰满， 花期一致，。

8、 并以长取胜。 经人工艺术加工培养而成。 一棵理想的悬崖菊应该是 后宽前窄、 呈等腰三角形且繁花密集向一面悬垂， 长度要达3-4米。 悬崖菊培植一般用扦插 繁殖， 栽培需一年时间方能体现悬崖菊的艺术魅力。 花开时， 鲜花缀满枝头， 绿叶相间， 远看 形如蛟龙探海， 近观似菊花瀑布。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供悬崖菊组织培养方法， 本组织培养方法简单易行， 悬崖菊 组织诱导分化速度快， 幼苗成活率较高， 适合批量规模化培养。 0004 本发明针对背景技术中提到的问题， 采取的技术方案为： 悬崖菊组织培养方法， 包 括： 灭菌、 诱导、 增殖、 移栽， 具体包括以下步骤： 灭菌： 取。

9、悬崖菊茎尖部位， 用中性洗涤剂漂洗5-8分钟， 再用流水冲洗30-45分钟， 然后 用75-95%酒精灭菌15-30秒， 无菌水冲洗2-3遍， 再用0.08-0.12%氯化汞溶液灭菌8-12分钟， 无菌水冲洗2-3次， 将悬崖菊茎尖切成小块； 外植体灭菌可以灭杀悬崖菊茎尖部位携带的有 害微生物， 避免将有害微生物引入培养基质中造成污染， 同时也可以避免微生物对培养基 质的吸收利用， 为茎尖细胞提供充足的营养成分供其分化； 诱导： 选长13-15cm、 宽13-15c、 厚0.4-0.7cm的海绵， 将海绵用蒸馏水洗净并在体积 分数为70-75的酒精中浸泡20-30分钟， 再用蒸馏水洗净备用； 。

10、将一块海绵卷成中空的筒 状体， 底部固定一块圆形海绵， 筒状体下部的海绵条插入装有MS培养基的罐头瓶中， 培养基 上放置0.3-0.5cm厚的粉状活性炭， 以玻璃棒插8-10个小孔至基质底部， 在每个小孔中垂直 插入1-2片茎尖小块， 在温度为22-24、 光照时间为12-16小时、 光照强度为2500-3000lx的 培养条件下培养8-12天； 活性炭有助于调节基质的容重、 总孔隙度、 通气孔隙、 持水孔隙和 气水比， 同时活性炭还有助于降低茎尖的褐化率， 在仅添加活性炭的MS培养基上较容易诱 导愈伤组织， 愈伤诱导率达99%以上， 愈伤分化也较容易， 愈伤分化率达98%以上， 愈伤的生 长。

11、情况好， 质地疏松， 活力旺盛； 增殖： 取新鲜的MS培养基， 遮光条件下依次加入蔗糖25-28g/L、 蜂蜜20-22g/L、 维生素 B1 0.1-0.15g/L、（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇0.012-0.022 g/L、 6-苄氨基腺嘌呤1.0- 1.2mg/L、 萘乙酸0.6-0.8mg/L、 吲哚乙酸0.6-0.8mg/L、 赤霉素0.03-0.05mg/L混合成培养 液， 将经诱导培养产生的健壮茎尖组织接入培养基中， 在光照12-14小时、 光照强度2500- 3500lx、 温度24-26， 黑暗10-12小时、 温度15-17的条件下培养15-18天； 6-苄氨。

12、基腺嘌 说 明 书 1/4 页 3 CN 107896992 A 3 呤、 萘乙酸、 吲哚乙酸能够作用于细胞， 可刺激形成层细胞分裂， 刺激根细胞生长， 促进木质 部、 韧皮部细胞分化， 促进逾伤组织发根、 调节愈伤组织的形态建成， 赤霉素有助于灭菌， 可 以防止愈伤组织腐烂，（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇能够与萘乙酸、 吲哚乙酸发生络合反应， 从而可以防止它们被光氧化分解为醛与吲哚而失去调节作用， 在适当条件下， 生长素可以 经由解络合反应而转变为游离型， 经运输转移到作用部位起作用； 移栽： 将生根良好的增培苗移出培养室并置于室温下炼苗2-3天， 然后向瓶内加少许水 刚没过培养。

13、基， 继续炼苗1-2天， 小心取出小苗， 冼净基部培养基， 用多菌灵可湿性粉剂 1500-2000倍液与0.022-0.025%高锰酸钾溶液浸泡消毒7-9分钟， 取出在阴凉处晾10-15分 钟后移栽到栽培基质中即可； 通过炼苗并消毒后， 幼苗可以迅速适应栽培基质的土质环境， 可以缩短缓苗时间， 增强对低温、 大风等的抵抗能力， 使悬崖菊迅速成活成长， 植株健壮， 长 势旺盛， 完成组培阶段。 0005 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 1） 活性炭有助于调节基质的容重、 总孔隙度、 通气孔隙、 持水孔隙和气水比， 同时活性 炭还有助于降低茎尖的褐化率， 在仅添加活性炭的MS培养基上较容易诱。

14、导愈伤组织， 愈伤 诱导率达99%以上， 愈伤分化也较容易， 愈伤分化率达98%以上， 愈伤的生长情况好， 质地疏 松， 活力旺盛； 2） （R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇能够与萘乙酸、 吲哚乙酸发生络合反应， 从而可以防止 它们被光氧化分解为醛与吲哚而失去调节作用， 在适当条件下， 生长素可以经由解络合反 应而转变为游离型， 经运输转移到作用部位起作用； 3） 通过炼苗并消毒后， 幼苗可以迅速适应栽培基质的土质环境， 可以缩短缓苗时间， 增 强对低温、 大风等的抵抗能力， 使悬崖菊迅速成活成长， 植株健壮， 长势旺盛， 完成组培阶 段。 具体实施方式 0006 下面通过实施例对本发。

15、明方案作进一步说明： 实施例1： 悬崖菊组织培养方法， 包括以下步骤： 1） 取悬崖菊茎尖部位， 用中性洗涤剂漂洗5分钟， 再用流水冲洗30分钟， 然后用75%酒精 灭菌15秒， 无菌水冲洗2遍， 再用0.08%氯化汞灭菌8分钟， 无菌水冲洗2次， 将悬崖菊茎尖切 成小块； 2） 选长13cm、 宽13c、 厚0.4cm的海绵， 将海绵用蒸馏水洗净并在体积分数为70 的酒精中浸泡20分钟， 再用蒸馏水洗净备用； 将一块海绵卷成中空的筒状体， 底部固定一块 圆形海绵， 筒状体下部的海绵条插入装有MS培养基的罐头瓶中， 培养基上放置0.3cm厚的粉 状活性炭， 以玻璃棒插8个小孔至基质底部， 在每。

16、个小孔中垂直插入1片茎尖小块， 在温度为 22、 光照时间为12小时、 光照强度为2500lx的培养条件下培养8天； 3） 取新鲜的MS培养基， 遮光条件下依次加入蔗糖25g/L、 蜂蜜20g/L、 维生素B1 0.1g/L、（R） - （-） -2,2-二苯基环戊 醇0.012g/L、 6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、 萘乙酸0.6mg/L、 吲哚乙酸0.6mg/L、 赤霉素0.03mg/L 混合成培养液， 将经诱导培养产生的健壮茎尖组织接入培养基中， 在光照12小时、 光照强度 2500lx、 温度24， 黑暗10小时、 温度15的条件下培养15天； 4） 将生根良好的增培苗移出 培养室并。

17、置于室温下炼苗2天， 然后向瓶内加少许水刚没过培养基， 继续炼苗1天， 小心取出 说 明 书 2/4 页 4 CN 107896992 A 4 小苗， 冼净基部培养基， 用多菌灵可湿性粉剂1500倍液与0.022%高锰酸钾溶液浸泡消毒7分 钟， 取出在阴凉处晾10分钟后移栽到栽培基质中即可。 0007 实施例2： 悬崖菊组织培养方法， 包括： 灭菌、 诱导、 增殖、 移栽， 具体包括以下步骤： 1） 灭菌： 取悬崖菊茎尖部位， 用中性洗涤剂漂洗8分钟， 再用流水冲洗45分钟， 然后用 95%酒精灭菌30秒， 无菌水冲洗3遍， 再用0.12%氯化汞灭菌12分钟， 无菌水冲洗3次， 将悬崖 菊茎尖。

18、切成小块； 外植体灭菌可以灭杀悬崖菊茎尖部位携带的有害微生物， 避免将有害微 生物引入培养基质中造成污染， 同时也可以避免微生物对培养基质的吸收利用， 为茎尖细 胞提供充足的营养成分供其分化； 2） 诱导： 选长15cm、 宽15c、 厚0.7cm的海绵， 将海绵用蒸馏水洗净并在体积分数为 75的酒精中浸泡30分钟， 再用蒸馏水洗净备用； 将一块海绵卷成中空的筒状体， 底部固定 一块圆形海绵， 筒状体下部的海绵条插入装有MS培养基的罐头瓶中， 培养基上放置0.5cm厚 的粉状活性炭， 以玻璃棒插10个小孔至基质底部， 在每个小孔中垂直插入2片茎尖小块， 在 温度为24、 光照时间为16小时、 。

19、光照强度为3000lx的培养条件下培养12天； 活性炭有助于 调节基质的容重、 总孔隙度、 通气孔隙、 持水孔隙和气水比， 同时活性炭还有助于降低茎尖 的褐化率， 在仅添加活性炭的MS培养基上较容易诱导愈伤组织， 愈伤诱导率达99%以上， 愈 伤分化也较容易， 愈伤分化率达98%以上， 愈伤的生长情况好， 质地疏松， 活力旺盛； 3） 增殖： 取新鲜的MS培养基， 遮光条件下依次加入蔗糖28g/L、 蜂蜜22g/L、 维生素B1 0.15g/L、（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇0.022 g/L、 6-苄氨基腺嘌呤1.2mg/L、 萘乙酸0.8mg/ L、 吲哚乙酸0.8mg/L、 。

20、赤霉素0.05mg/L混合成培养液， 将经诱导培养产生的健壮茎尖组织接 入培养基中， 在光照14小时、 光照强度3500lx、 温度26， 黑暗12小时、 温度17的条件下培 养18天； 6-苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 吲哚乙酸能够作用于细胞， 可刺激形成层细胞分裂， 刺激 根细胞生长， 促进木质部、 韧皮部细胞分化， 促进逾伤组织发根、 调节愈伤组织的形态建成， 赤霉素有助于灭菌， 可以防止愈伤组织腐烂，（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇能够与萘乙酸、 吲 哚乙酸发生络合反应， 从而可以防止它们被光氧化分解为醛与吲哚而失去调节作用， 在适 当条件下， 生长素可以经由解络合反应而转变为游。

21、离型， 经运输转移到作用部位起作用； 4） 移栽： 将生根良好的增培苗移出培养室并置于室温下炼苗3天， 然后向瓶内加少许水 刚没过培养基， 继续炼苗2天， 小心取出小苗， 冼净基部培养基， 用多菌灵可湿性粉剂2000倍 液与0.025%高锰酸钾溶液浸泡消毒9分钟， 取出在阴凉处晾15分钟后移栽到栽培基质中即 可； 通过炼苗并消毒后， 幼苗可以迅速适应栽培基质的土质环境， 可以缩短缓苗时间， 增强 对低温、 大风等的抵抗能力， 使悬崖菊迅速成活成长， 植株健壮， 长势旺盛， 完成组培阶段。 0008 实施例3： 悬崖菊组织培养方法， 包括： 灭菌、 诱导、 增殖、 移栽， 具体包括以下步骤： 灭。

22、菌： 取悬崖菊茎尖部位， 用中性洗涤剂漂洗6分钟， 再用流水冲洗35分钟， 然后用85% 酒精灭菌25秒， 无菌水冲洗3遍， 再用0.1%氯化汞灭菌10分钟， 无菌水冲洗3次， 将悬崖菊茎 尖切成小块； 外植体灭菌可以灭杀悬崖菊茎尖部位携带的有害微生物， 避免将有害微生物 引入培养基质中造成污染， 同时也可以避免微生物对培养基质的吸收利用， 为茎尖细胞提 供充足的营养成分供其分化； 诱导： 选长14cm、 宽14c、 厚0.5cm的海绵， 将海绵用蒸馏水洗净并在体积分数为74 说 明 书 3/4 页 5 CN 107896992 A 5 的酒精中浸泡25分钟， 再用蒸馏水洗净备用； 将一块海绵。

23、卷成中空的筒状体， 底部固定一块 圆形海绵， 筒状体下部的海绵条插入装有MS培养基的罐头瓶中， 培养基上放置0.4cm厚的粉 状活性炭， 以玻璃棒插9个小孔至基质底部， 在每个小孔中垂直插入2片茎尖小块， 在温度为 23、 光照时间为14小时、 光照强度为2800lx的培养条件下培养10天； 活性炭有助于调节基 质的容重、 总孔隙度、 通气孔隙、 持水孔隙和气水比， 同时活性炭还有助于降低茎尖的褐化 率， 在仅添加活性炭的MS培养基上较容易诱导愈伤组织， 愈伤诱导率达99%以上， 愈伤分化 也较容易， 愈伤分化率达98%以上， 愈伤的生长情况好， 质地疏松， 活力旺盛； 增殖： 取新鲜的MS培。

24、养基， 遮光条件下依次加入蔗糖26g/L、 蜂蜜20g/L、 维生素B1 0.12g/L、（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇0.02g/L、 6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、 萘乙酸0.7mg/L、 吲哚乙酸0.7mg/L、 赤霉素0.04mg/L混合成培养液， 将经诱导培养产生的健壮茎尖组织接入 培养基中， 在光照14小时、 光照强度3000lx、 温度25， 黑暗10小时、 温度16的条件下培养 16天； 6-苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 吲哚乙酸能够作用于细胞， 可刺激形成层细胞分裂， 刺激根 细胞生长， 促进木质部、 韧皮部细胞分化， 促进逾伤组织发根、 调节愈伤组织的形态建成， 。

25、赤 霉素有助于灭菌， 可以防止愈伤组织腐烂，（R） - （-） -2,2-二苯基环戊醇能够与萘乙酸、 吲哚 乙酸发生络合反应， 从而可以防止它们被光氧化分解为醛与吲哚而失去调节作用， 在适当 条件下， 生长素可以经由解络合反应而转变为游离型， 经运输转移到作用部位起作用； 移栽： 将生根良好的增培苗移出培养室并置于室温下炼苗3天， 然后向瓶内加少许水刚 没过培养基， 继续炼苗2天， 小心取出小苗， 冼净基部培养基， 用多菌灵可湿性粉剂2000倍液 与0.023%高锰酸钾溶液浸泡消毒8分钟， 取出在阴凉处晾12分钟后移栽到栽培基质中即可； 通过炼苗并消毒后， 幼苗可以迅速适应栽培基质的土质环境， 可以缩短缓苗时间， 增强对低 温、 大风等的抵抗能力， 使悬崖菊迅速成活成长， 植株健壮， 长势旺盛， 完成组培阶段。 0009 本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知， 在此不进行赘述。 0010 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明， 应理解的是以上所述仅 为本发明的具体实施例， 并不用于限制本发明， 凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、 补充或类似方式替代等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107896992 A 6 。