技术领域
本发明属于玉米基因定位技术领域，具体涉及一种定位玉米S型胞质雄性不育育性恢复 基因Rf3的新方法。
背景技术
玉米不仅是世界三大粮食作物之一，还是重要的饲料及工业原料作物。从未来发展看， 玉米将是世界上需求增长最快的作物，挖掘玉米的生产潜力是满足这一需求的关键。玉米产 量的提高主要是通过种植杂交种实现的，因此，配制具有高产潜力、高纯度的杂交种是保证 玉米高产的关键环节。生产杂交种的过程中需要进行母本去雄，在集约化生产杂交种子的过 程中，母本去雄工作量大，种子成本高，而且往往由于去雄不彻底，产生自交种子造成杂交 种纯度降低。玉米雄性不育种质资源的发掘和研究开拓了杂交种不育化制种的新途径。利用 细胞核雄性不育(Genic Male Sterility，GMS)的SPT制种法以及利用胞质雄性不育 (Cytoplasmic Male Sterility，CMS)的三系制种法是不育化制种的两种主要方法。目前，SPT 制种法已经受到了美国先锋公司的专利保护。在T、C与S三组CMS不育系中，T和CI亚 组的不育系和杂交种易遭受玉米小斑病菌T和C小种的侵染，而S组不育系对T、C小种表 现免疫。因此，S型CMS不育系对我国玉米生产具有极为重要的实践意义。
CMS的表达由细胞质基因与细胞核基因共同控制，在细胞质基因为不育类型且细胞核中 无恢复基因时，其表现为雄性不育；在正常细胞质基因或细胞核恢复基因存在的条件下，其 育性恢复正常。S型CMS的不育胞质类型为S，其雄性不育的恢复基因为一显性基因Rf3， 定位于玉米2号染色体长臂上，属于配子体雄性不育，育性反应由配子体的基因型控制。在 F1代，50％的花粉带有Rf3，表现为散粉可育；50％的花粉带有rf3基因，表现为不散粉。
生产上使用的玉米自交系大多胞质为可育类型，且不带有恢复基因。因此，在利用CMS 的三系制种法中，需要将杂交种的母本胞质转育为不育类型且将恢复基因转育到父本中去。 其中，由于胞质主要是由雌配子进行传递且对植株的表型影响不大，因此胞质的转育比较简 单。而恢复基因的转育则需要通过回交的方式进行。
在作物育种中，基因的回交转育有两种方式：基于表型选择的常规育种方法和分子标记 辅助选择的育种方法。前者效率低、周期长、盲目性大，已经不能满足现代育种的需求；后 者可以提高育种效率、缩短育种周期、降低育种的盲目性，已经逐渐成为现代育种的趋势。 要想对基因进行分子标记辅助的回交转育，其前提是必须知道基因的确切位置，也就是定位 基因。
玉米细胞质雄性不育属于质量性状。质量性状是指表现为非连续变化的性状。这种性状 多为单基因控制，受环境和遗传背景影响较小，因此定位起来相对容易。基因定位的基本原 理是两点测验和三点测验，其首要工作是组配定位群体。根据组配的群体的不同，质量性状 基因定位主要可以分为以下两种方法：
方法一，利用回交群体(BC群体)的质量性状基因定位
BC群体通过杂交一代F1和隐性亲本回交得到。通过表型鉴定判断个体的基因型，检测 其分子标记基因型，利用两点测验和三点测验计算出基因和各分子标记之间的遗传距离，将 基因定位在两个分子标记之间。
方法二，利用自交群体(F2群体)的质量性状基因定位
F2群体通过杂交一代F1自交得到。从群体中筛选出表型为隐性的个体，检测其分子标记 基因型，利用两点测验和三点测验计算出基因与各分子标记之间的遗传距离，将基因定位在 两个分子标记之间。
以上两种方法其核心思想是一样的，即通过表型推断分离群体的基因型并对其进行分子 标记检测，利用两点测验和三点测验计算基因和分子标记间的遗传距离来定位基因。所不同 的是BC群体中利用的个体有两种类型：杂合体和隐性个体，而F2群体中，由于无法区分显 性纯合体和杂合体，所以一般只利用隐性个体进行基因的定位。
Rf3基因定位主要利用的是BC1F1群体，该群体是通过普通材料(N(rf3／rf3))给F1(S (Rf3/rf3))授粉得到的。在开花期对每个单株进行表型鉴定，根据其散粉情况判断其为可育 株还是不育株。从群体里随机挑选部分单株(n≥200)用玉米2号染色体长臂上的分子标记进 行检测，通过两点测验寻找与Rf3基因紧密连锁的分子标记，通过三点测验将Rf3基因初定 位在两个分子标记之间，然后在初定位区间内寻找和开发分子标记，并用其检测整个定位群 体，寻找在初定位区间内发生重组的单株，根据重组发生的位置精细定位Rf3基因。
该定位方法主要涉及两个方面：分子标记的检测和表型的鉴定。目前，分子标记技术已 经日趋成熟，不会成为基因定位的制约因素，所以表型鉴定的结果就显得尤为重要，一旦出 现误差就会直接影响定位的结果。玉米的散粉受天气的影响很大，而且由于群体内个体之间 的发育存在差异，散粉时间也不一致，不能一次就将整个群体的表型调查完，需要进行多次 的调查。所以通过肉眼观察单株的散粉情况来判断其表型往往结果存在误差而且工作量大。 这种表型鉴定的方法一方面影响了定位结果的可靠性，另一方面也限制了Rf3基因定位群体 的大小，在一个世代往往找不到足够的重组单株对其进行精细定位。
发明内容
本发明针对现有玉米Rf3基因定位表型鉴定易受人为、环境因素影响及工作量大限制定 位群体大小的缺点，提出一种不需要进行表型鉴定的Rf3基因定位方法。本发明的特征是利 用的定位群体基因型已知，表型无需鉴定，可以构建大群体，在一个世代就可以找到充足的 重组个体对Rf3基因进行精细定位。本发明为定位Rf3基因提出了一种有效的方法，促进生 产上利用Rf3基因进行三系不育化制种。
本发明在进行Rf3基因定位构建群体时以F1(S(Rf3/fr3))为父本，郑58(N(rf3／rf3)) 为母本进行授粉。由于S型CMS属于配子体雄性不育，所以只有带有Rf3的花粉能够散粉并 参与受精，由此得到的群体基因型全部都是Rf3/rf3。由于该群体基因型已知，所以不需要将 定位群体种子种到地里，在开花期通过观察散粉情况来推断基因型，可以直接对种子提DNA 进行分子标记的鉴定。
首先从群体中随机挑选部分个体(n≥200)进行玉米2号染色体长臂上的分子标记与Rf3 基因的两点测验。假定待检测的分子标记在恢复系中的基因型为A／A，在普通玉米中的基因 型为a/a。第一种情况，当其与Rf3基因相距很远时(遗传距离大于50cM)，F1会产生4种类 型的配子：Rf3A、rf3a、Rf3a和rf3A，比例为1∶1∶1∶1，F1给郑58授粉时，rf3a和rf3A 型花粉不散粉，所以只能产生两种基因型的后代：Rf3A／rf3a和Rf3a／rf3a，比例为1∶1(图 1A)。第二种情况，当其与Rf3基因完全连锁时，F1只会产生2种类型的配子：Rf3A和rf3a， 比例为1∶1，F1给郑58授粉时，rf3a型花粉不散粉，所以只能产生1种基因型的后代：Rf3A／rf3a (图1B)。第三种情况，当其与Rf3基因不完全连锁时，若它们之间的遗传距离为xcM(0<x< 50)，F1会产生4种类型的配子：Rf3A、rf3a、Rf3a和rf3A，，比例为1-x％∶1-x％∶x％∶x％， F1给郑58授粉时，rf3a和rf3A型花粉不散粉，所以只能产生两种基因型的后代：Rf3A／rf3a 和Rf3a／rf3a，比例为1-x％∶x％(>1∶1)(图1C)。通过两点测验找到与Rf3基因紧密连锁 的分子标记后，再通过三点测验将Rf3基因初定位在两个分子标记之间，然后在初定位区间 内寻找和开发分子标记，并用其检测整个定位群体，寻找在初定位区间内发生重组的单株， 根据重组发生的位置精细定位Rf3基因。假定将Rf3基因初定位在分子标记A1与A2之间， 在A1与A2之间又找到了两个分子标记B1与B2，恢复系的基因型为A1B1B2A2/A1B1B2A2， 普通材料的基因型为a1b1b2a2／a1b1b2a2，F1产生配子时若在B1与B2间发生重组，重组配 子的基因型为A1B1b2a2和a1b1B2A2，F1给郑58授粉后，如果检测到了基因型为 A1B1b2a2／a1b1b2a2的个体，说明Rf3基因在A1与B2之间，如果检测到了基因型为 a1b1B2A2／a1b1b2a2的个体，则说明Rf3基因在B1与A2之间(图2)。
相比常规定位方法，利用本发明进行玉米Rf3基因定位的优点在于，由于定位群体基因 型已知，所以不需要将定位群体种子种到地里进行表型鉴定，可以直接对种子提DNA进行分 子标记的检测，首先避免了表型鉴定结果不准所导致的定位偏差，其次不受群体大小限制， 节省人力和物力，提高定位效率，再次定位不受玉米种植季节的限制，节约时间。
附图说明
图1：利用本发明的定位方法，对分子标记和Rf3基因进行两点测验的示意图，A图表示 当分子标记与Rf3基因相距很远时(遗传距离大于50cM)定位群体中个体的基因型及其比 例，B图表示当分子标记与Rf3基因完全连锁时定位群体中个体的基因型及其比例，C图表 示当分子标记与Rf3基因之间的遗传距离为xcM(0<x<50)时定位群体中个体的基因型及 其比例。
图2：将Rf3基因初定位在分子标记A1与A2之间后，利用在初定位区间内部发生重组 的个体对Rf3基因进行精细定位的示意图。
图3：以Rf3基因的定位过程为实例所阐述的本发明的技术路线图。
图4：Rf3基因的定位结果，A图表示初定位结果，B图表示精细定位结果。
具体实施方式
通过Rf3基因的定位过程，对本发明进行详细说明：
(1)2012年夏天，北京昌平农场，以带有恢复基因的玉米自交系SD13(S(Rf3/Rf3)) 为母本，郑58(N(rf3／rf3))为父本，组配F1(S(Rf3／rf3))。
(2)2012年冬天，海南陵水南繁基地，用F1给郑58授粉，收获20000粒种子(N(Rf3／rf3))。
(3)20000粒种子单粒提取DNA。
(4)筛选和开发在SD13与郑58之间有多态的且条带特异的玉米2号染色体长臂上的 分子标记。
(5)在上述20000份DNA中随机挑选2000份用分子标记进行检测，利用两点测验的 方法找到了若干与Rf3基因紧密连锁的分子标记：bnlg1520、A7、A105、UMC1525、A81、 A121、A165、CG2、A134、A70、p22和UMC1736及与Rf3基因完全连锁的分子标记：1-17、 1-62、2-43、SEQ58、CAP33。利用三点测验的方法绘制了这些标记与Rf3基因的遗传图谱， 将Rf3基因初定位在A165与CG2之间，在B73参考序列上的物理距离约为1Mb(图4A)。
(6)用分子标记A165与CG2检测上述20000份DNA，寻找在A165与CG2之间发生 重组的单株。
(7)用A165与CG2之间的所有分子标记对重组单株进行检测，根据重组发生的位置将 Rf3基因精细定位在分子标记2-43与4-1之间，在B73参考序列上的物理距离约为600kb(图 4B)。