技术领域
本发明涉及植物生物防治并且特别地在幼苗中针对种子相关病原体 的传播的生物防治。
背景技术
以下列出被认为与本公开的主题相关的作为背景的参考文献：
Ronald Gitaitis和Ronald Walcott The epidemiology and management of seedborne bacterial diseases,Annual Review of Phytopathology,第45卷: 371-397,2007；
Valeria Mancini和Gianfranco Romanazzi Seed treatments to control seedborne fungal pathogens of vegetable crops Pest Management Science第70 卷，第6期，第860–868页，June 2014；
本文对以上参考文献的确认不应被推断为意指这些参考文献以任何 方式与本公开的主题的专利性相关。
背景
蔬菜作物频繁地被病原体感染，所述病原体可以包括种源性 (seed-borne)病原体或者种传(seed transmitted)病原体，其中病原体已经存在 于种子表面内部或种子表面上，并且因此可以导致种子腐烂、幼苗猝倒病， 或者是幼苗病害和针对作物的接种物的主要来源。
尽管尝试通过将种子生产转移到半干旱区域来减少种源性或种传(种 子相关)病原体感染，但是种子相关病害继续导致全世界显著的经济损失。 如在Ronald Gitaitis和Ronald Walcott[The epidemiology and management of seedborne bacterial diseases,Annual Review of Phytopathology,第45卷: 371-397，2007]的综述中描述的，被侵袭的种子是过去病害再现、病原体 跨越国际边境移动或者病害引入到新地区的原因。
已经证明蔬菜种子处理对于一些尝试预防由种源性病原体导致的植 物病害流行。有时，在种子阶段的处理还可以用于减少控制病害所需的杀 虫剂的量。
已经证实，过去已经使用的物理处理和用生物杀虫剂诸如植物提取 物、天然化合物和生物防治剂的处理有效防治种源性病原体。这些已经被 单独地或组合应用，并且由于其在病害防治和产品产量方面的广谱性，它 们被广泛使用。在Valeria Mancini和Gianfranco Romanazzi的综述[Seed treatments to control seedborne fungal pathogens of vegetable crops Pest Management Science第70卷，第6期，第860–868页，June 2014]中，讨 论了针对一些重要蔬菜作物的主要种源性病原体的不同种子处理的有效 性。
一般描述
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防幼苗群 体中种子相关病害的传播的方法，所述方法包括为所述幼苗提供从至少以 下获得的一定量的制剂：
(a)第一组分，所述第一组分包含容纳一种或更多种天然油的颗粒物 质；和
(b)第二组分，所述第二组分包含至少两种拮抗性细菌的细菌混合物。
本公开内容还提供了一种包装，所述包装在两个单独的隔室内分别包 含如本文定义的第一组分和第二组分，其中所述包装用于在治疗或预防幼 苗群体中种子相关病害的传播中使用。
治疗和预防效果在以下提供的非限制性实例中具体显示。
附图简述
为了更好地理解本文公开的主题并示例其可如何付诸于实践，现将参 考附图仅通过非限制性实例的方式描述多个实施方案，其中：
图1A-1B是与未处理的幼苗(图1B，“未处理的”)相比，用本公开内容 的生物防治制剂处理之后(图1A，“处理的”)的辣椒(pepper)幼苗的图像。
图2A-2B是与未处理的对照幼苗(图2B，“未处理的”)相比，用本公开 内容的生物防治制剂处理之后(图2A，“处理的”)的番茄幼苗的图像。
图3A-3B是与未处理的对照幼苗(图3B，“未处理的”)相比，用本公开 内容的生物防治制剂处理之后(图3A，“处理的”)的茄子幼苗的图像。
图4是与未处理的幼苗(“未处理的”)相比，用本公开内容的生物防治 制剂处理之后(“处理的”)的卷心菜(Cabbage)幼苗的图像。
图5是与未处理的幼苗(“未处理的”)相比，用本公开内容的生物防治 制剂处理之后(“处理的”)的球茎甘蓝(Kohlrabi)幼苗的图像。
图6A-6B是与未处理的对照幼苗(图6B，“未处理的”)相比，用本公开 内容的生物防治制剂处理之后(图6A，“处理的”)的西兰花(Broccoli)幼苗的 图像。
图7A-7B是与未处理的对照幼苗(图7B，“未处理的”)相比，用本公开 内容的生物防治制剂处理之后(图7A，“处理的”)的花椰菜(Cauliflower)幼 苗的图像。
图8A和8B是与未处理的幼苗(图8B，“对照”)相比，用本公开内容的 生物防治制剂处理之后(图8A，“处理的”)的甜瓜幼苗的图像。
图9是与未处理的幼苗(“未处理的”)相比，用本公开内容的生物防治 制剂处理之后(“处理的”)的南瓜幼苗的图像。
图10是与未处理的幼苗(“未处理的”)相比，用本公开内容的生物防治 制剂处理之后(“处理的”)的莴苣幼苗的图像。
具体实施方式
无论从种子或无性(营养)繁殖生长，幼苗都需要防止不利的温度、大 雨、干旱、风以及多种虫害和病害。为此目的，已经开发了苗圃，其为萌 发和随后生长提供最佳条件，直至植物足够强壮以被种植在永久环境中。
苗圃可以简单到在开放的田间中的垄(raised bed)，或者精密到具有微 型喷洒器和自动温控系统的玻璃房。在另一方面，伴随着其为幼苗提供合 适的生长条件，苗圃(为封闭的环境设施)可以为病害甚至来源于被种植在 苗圃中的数以千计的种子中的单个种子的种源性或种传病害的流行性传 播提供场地。
另外，值得注意的是，尽管苗圃为萌发提供完善的环境条件(随用的水 (free water)、高湿度和合适的温度)，这些相同条件对细菌病害的发展也 是最佳的。
此外，当在由水喷射器(shower)灌溉的苗圃中栽培幼苗时，应该注意 不要使幼苗外皮受损，幼苗外皮受损可以是病原体进入植物的便利进入方 式。从喷射器溅出的水还可以导致病原体传播到邻近幼苗。
本发明旨在提供一种治疗和/或预防(优选地预防)栽培的幼苗优选苗圃 栽培的植物中种源性或种传病害(本文通过术语“种子相关病害”共同指代) 的流行性传播的方法。当提及病害的“传播”时，应被理解为意指病害从一 株幼苗到至少一株另外的幼苗的任何传播。关于这一点，值得注意的是， 通过进行所述方法步骤，进行已存在的病害的传播的预防。这还可以牵涉 已存在的病害的治疗(减少或消除)。
具体地，本公开内容提供了一种用于治疗和/或预防幼苗群体中种子相 关病害的传播的方法，所述方法包括为所述幼苗提供从至少以下获得的、 优选地通过在使用之前混合至少以下获得的一定量的制剂：
(a)第一组分，所述第一组分包含容纳一种或更多种天然油的颗粒物 质的；和
(b)第二组分，所述第二组分包含至少两种拮抗性细菌的细菌混合物。
每种组分的组成在本文下文中描述，并且在具有公布号 WO2014/170894的国际专利申请号PCT/IL2014/050348中进一步详细描 述，所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。
将第一组分和第二组分混合之后，获得稳定的乳状液，然后所述乳状 液可以用水稀释，并且适用于应用到待处理或保护的幼苗上。
至少两种组分的混合在应用/递送至需要其的幼苗或幼苗群体之前进 行。在本公开内容的上下文中，“在提供之前混合”表示在递送至靶幼苗群 体之前的48小时有时24小时的时间窗内，此外有时，在12小时、9小时、 6小时、5、4、3、2小时的时间窗内，或者甚至在1小时，例如在其对幼 苗实际使用之前的数分钟的时间窗内混合。如下文进一步讨论的，该时间 窗基于通过混合组分形成的乳状液的稳定性来确定。
得到的制剂(乳状液)的应用通过允许制剂基本上均匀分布在待用其处 理的幼苗群体上的任何技术进行。在一些实施方案中，得到的生物防治制 剂的应用通过喷洒幼苗或土壤灌溉的一种或组合进行。生物防治制剂优选 地以通过本领域已知的任何技术待实现的细小液滴的形式应用。
制剂可以在植物的幼苗阶段期间的任何时间被应用。当提及幼苗阶段 时，其应被理解为从种子被置于土壤中并且萌发开始之日直至幼苗成熟之 日即当幼苗开始光合作用并且不再依赖于种子用于生长的能量储备时的 任何阶段。
因此，生物防治制剂的应用可以是在直至成熟的任一天至少一次，但 是优选地制剂从幼苗暴露于光(即从地面露出)之日被应用至少一次。
尽管生物防治制剂的单次应用可以足够实现预防种子相关病害的传 播的期望效果，在一些实施方案中制剂被应用至少两次，有时三次或者甚 至更多，直至幼苗成熟并且准备种植。确定处理时间表可以依据多种特征， 包括，病原体类型、病原体感染的倾向(致病性)、幼苗的条件等，以及其 他。
本文公开的生物防治制剂不通过对种子消毒起作用。事实上，需要的 是，生物防治制剂应该在幼苗阶段即，从幼苗从地面露出并且暴露于光之 日，被应用至少一次。发明人已经发现，存在用于处理幼苗使得病害从一 株幼苗到其他幼苗的任何传播将被预防或者至少显著减少的时间窗。基于 这些发现并且根据一些实施方案，生物防治制剂在1-2片子叶的生理阶段 被提供至少一次。为了获得传播的期望的减少或预防，该第一次应用的时 间是至关重要的。
在一些另外的实施方案中，生物防治制剂在1-2片子叶以及组成幼嫩 幼苗的第一片真叶的顶端分生组织和胚芽暴露的生理阶段时被应用至少 一次。
在一些实施方案中，生物防治制剂被应用两次：(a)在至少1-2片子叶 的生理阶段；和(b)在第一次应用之后数天(两天或更多天)，在一些实施方 案中三(3)天。在一些另外的实施方案中，生物防治制剂被应用三次，如以 上指出的两次，并且第三次是在幼苗被取出苗圃例如以被送出用于在田间 种植之前的一天。
为了确保处理的有效性，优选地，但非强制性地，幼苗被种植或栽培 在受控的环境条件下，包括受控的温度、受控的湿度、受控的光暴露、受 控的水供应和农业中已知的其他参数。这可以通过例如在植物苗圃中栽培 幼苗来实现。
生物防治制剂可以被应用到多种植物。在一些实施方案中，生物防治 制剂用于治疗或预防蔬菜植物或水果植物中的病害。不限于此，生物防治 制剂用于治疗或预防选自由以下组成的植物的科的蔬菜植物或水果植物 的幼苗中的病害：石蒜科(Amaryllidaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科 (Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、禾本科 (Gramineae)、豆科(Leguminosae)、茄科(Solanaceae)和伞形科(Umbelliferae) 组成的植物科。
在一个实施方案中，生物防治制剂被应用至选自如下科的植物：
制剂的应用不一定仅对已经知晓具有病害的群体进行，并且还可以适 用于保护性处理，即对可能潜在地携带被病原体感染并且可以导致病害传 播到整个群体的至少一株幼苗的群体进行。换言之，在本公开内容的上下 文中，幼苗的群体包含至少一株被感染的幼苗、疑似被病害感染或者处于 被病害感染的风险中的至少一株幼苗。
在本公开内容的上下文中，幼苗的群体可以包括相同植物的多个幼 苗，以及包含来自相同植物学的科的两种或更多种植物或者甚至有时来自 不同植物学的科的两种或更多种植物的幼苗的群体。
生物防治制剂可以被应用于处理，优选地保护性处理幼苗的群体，用 于抑制、预防或最小化任何病原体起源的种子相关病害的传播。
种子相关病害可以是种子污染或者种子侵袭(seed infestation)的结果。 如广泛认同的，污染或侵袭指病原体与种子的被动关系。在种子重新收集 的以下任何过程期间：收获、提取(extraction)、脱粒、筛选和包装，病 原体本身或其部分能够粘附种子或者能够与种子混合。这样的病原体可以 是在收获期间或收获后通过它们的孢子粘附到种子的表面的病原体，诸如 Clamidospore、卵孢子、冬孢子、夏孢子，以及细菌细胞且在一些情况下， 为病毒体；真菌的孢子诸如十字花科植物中的芸薹链格孢(Alternaria brassicae)和芸薹生链格孢(A.brassicicola)；烟草中的长柄链格孢(A. longipes)；胡萝卜中的根生链格孢(A.radicina)；豌豆中的Ascochyta pinodella；水稻中的Drechslera sorokiniana和D.oryzae；燕麦中的燕麦内 脐蠕孢(D.avenae)；翠菊中的尖孢镰刀菌翠菊专化型(Fusarium oxysporum f. sp.callistephi)；茄子、辣椒和番茄中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌 核；小麦中的小麦网腥黑粉菌(Tilletia caries)、小麦光腥黑粉菌(T.foetida)、 小麦矮腥黑粉菌(T.contraversa)和冰草条黑粉菌(Urocystis agropyri)。以上 导致病害的病原体中的每个被认为是本公开内容的单独且独立地实施方 案。
另外，许多细菌污染种子表面，所述细菌诸如以下：菜豆中的 Corynebacterium flaccumfaciens pv.Flaccumfaciens、菜豆中的Pseudomonas syringae pv.phaseolicola、黄瓜中的P.syringae pv.lachrymans、番茄中的番 茄细菌性叶斑病菌P.syringae pv.tomato、辣椒中的C.rnichiganense pv. michiganense、卷心菜中的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)。并且已知一些病毒诸如烟草花叶病毒、番茄花 叶病毒、辣椒花叶病毒污染种子。再次，这些导致病害的病原体中的每个 被认为是本公开内容的单独并且独立的实施方案。
在一些实施方案中，导致病害的病原体可以是选自由以下组成的非限 制性组的一个：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)；假单胞菌科 (Pseudomonadaceae)；黄单胞菌属(Xanthomonas)(例如xanthomonas vesicatoria(XV))、雷尔氏菌属(Ralstonia)、食酸菌属(Acidovorax)、根瘤菌 科农杆菌属(Rhizobiaceae Agrobacterium)；棒形杆菌属(Clavibacter)(例如 Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis(CBM))；链霉菌属 (Streptomyces)(例如疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)(S.Scabies))；梭菌属 (Clostridium)和芽孢杆菌属(Bacillus)。这些导致病害的病原体中的每个被认 为是本公开内容的单独并且独立的实施方案。
生物防治制剂被以需要在应用到幼苗上之前被混合的两种组分的包 装的形式提供。包装还包括用于其中两种组分的使用的说明书，所述说明 书包括将所述第一组分和所述第二组分混合以形成乳状液并且将乳状液 应用到所述幼苗上。
包装优选地用于在植物苗圃中使用。
包装包括如以上描述的两种组分，即，第一组分，所述第一组分包含 容纳一种或更多种天然油的颗粒物质；和第二组分，所述第二组分包含至 少两种拮抗性细菌的细菌混合物。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒物质(particulate matter)”用于 表示多个颗粒(particle)形式的物质。颗粒(particle)可呈任何颗粒 (particulate)形式，包含但不限于从细圆珠到无定形结构。颗粒物质包括 任何形式的粉末。
在一些实施方案中，颗粒物质包含二氧化硅(silica dioxide)(SiO2，在本 文中被简称为二氧化硅(silica))。二氧化硅可以是诸如膨润土珠的天然存在 的二氧化硅颗粒，以及合成的二氧化硅珠。
在一些实施方案中，颗粒物质包含合成的二氧化硅颗粒。存在可被用 于本公开内容的上下文的多种合成的二氧化硅颗粒。例如，颗粒物质可以 包含沉淀的合成的无定形二氧化硅珠，诸如商业上可得的产品Tixosil、 Sipernat 50S(SiO2,20μm)和Aerosil 200。
在一些其他的实施方案中，颗粒物质包含具有吸收天然油的能力的合 成的或天然来源的珠。这类珠可包括但不限于乳胶珠；碳酸钙吸收颗粒 (calcium carbonate sorbent particle)；纤维素珠；聚苯乙烯吸收珠例如 其是疏水性交联的聚苯乙烯共聚物吸收树脂；木炭； SepharoseTM珠；乳化剂-藻酸盐珠；壳聚糖珠；藻酸钠；苯乙烯-马来酸共 聚物珠和苯乙烯-二乙烯基苯珠；纤维素纸珠。
为了允许最终的乳状液的良好分布并根据一些实施方案，颗粒物质(颗 粒)具有在10-25μm范围内的尺寸分布。
颗粒物质还可以通过，但并不限于表面积和油容量的一个或更多个来 表征，在一些实施方案中，所述表面积在400-500m2N2/g的范围内，所述 油容量在300-350DBP/100克颗粒的范围内。
第一组分包含容纳一种天然油或天然油的组合的颗粒物质。在本公开 内容的上下文中，应理解“天然油”包括从自然界获得的任何有机油。
天然油优选地是源自植物的油。在一些实施方案中，天然油被称为精 油。
精油优选地是已知表现出抗微生物(例如抗细菌的、抗真菌的、抗线虫 的)特性的那些。当提及抗微生物特性时，其应被理解为有效地抵抗如以下 进一步讨论的任何微生物病原体。不限于以下，待使用的根据本公开内容 的精油可以是源自以下植物的那些：牛至(Origanum vulgare)和牛至种 (Origanum spp.)(例如，牛至(Oregano))、薄荷种(Mentha spp.)(薄荷)、百里 香种(Thymus spp.)(百里香)、香桃木种(Myrtus spp.)、罗勒种(Ocimun spp.)(例如，罗勒(Ocimun basilicum)，也被称为罗勒(Basil))、薰衣草种 (Lavandula spp.)(例如，薰衣草)、姜味草种(Micromeria spp.)、芫荽种 (Coriandum spp.)(例如，芫荽/荷兰芹)、阿莱藤种(Aloysia spp.)、Melissa spp.、 鼠尾草种(Salvia spp.)、欧芹种(Petroselinum spp.)、迷迭香种(Rosmarinus spp.)(例如，迷迭香)、夏枯草种(Prunella spp.)、孜然芹种(Cuminum spp.)(例 如，孜然芹)。
在一些其他的实施方案中，天然油是用作拮抗微生物的碳源，例如用 作养料/营养素的植物来源的油。在本文中这些被称为术语“碳基油 (carbon-base oil)”或“富含碳的营养油(carbon-rich nutrient oil)”。在一些实 施方案中，碳基油是植物油。不限于以下，碳基油选自由以下组成的组： 芝麻油、橄榄油、花生(Peanut)油、棉籽油、大豆油、棕榈油、葵花油、红 花油、菜籽油、蓖麻油、椰子油、落花生(groundnut)油。
在本公开内容的上下文中，当提及“天然油”时，其应被理解为指单一 类型的油以及指油的组合。在一些实施方案中，天然油包括至少一种精油 和至少一种碳基油的组合，所述至少一种精油和所述至少一种碳基油两者 均是天然来源的。
在一些实施方案中，天然油至少包含牛至油与至少一种碳基油组合。 有时，牛至油与至少芝麻油组合。
依据使用的天然油的类型、装载的量、颗粒物质的类型、将天然油装 载到颗粒物质上的条件、用于装载的表面活性剂或溶剂等，第一组分内的 天然油(例如，由颗粒物质容纳的)的量可以变化。
当提及将油装载到颗粒物质上时，其应被理解为意指在油和颗粒物质 (例如，二氧化硅颗粒)之间的任何形式的缔合。不限于以下，油通过被吸 收到颗粒上和/或被吸收进颗粒中而被颗粒物质容纳。颗粒和油之间的缔合 是可逆的，即在合适的条件下，诸如当与水接触时，油被容易地从颗粒释 放以形成乳状液。
在一些实施方案中，颗粒物质容纳按颗粒物质的总重量计(在装载之后) 在20％至50％w/w之间的天然油。这通过常规技术诸如HPLC或GC色谱 法来确定，如以下还示例的。在一些其他的实施方案中，颗粒物质容纳约 30％w/w的天然油(“约”包括在25％-35％之间、有时在28％至32％之间或 在30％左右的范围)。
在一些实施方案中，天然油仅包含一种或更多种精油或包含至少一种 精油和至少一种碳基油的组合。如此，当提及天然油时，其应被理解为包 含一种或更多种精油以及一种或更多种碳基油。至少一种精油和至少一种 碳基油之间的比率在60:40和100:0的范围内，有时范围是约80:20。
当使用油的组合时，应理解它们可以一起被吸收到颗粒物质上，即相 同的颗粒物质容纳多于一种类型的油。在一些实施方案中，为了易于操作， 使每种油类型被单独地容纳在颗粒物质上以使得形成不同类型的颗粒物 质，每种通过其容纳的油的类型来表征。
因此，当提及以80:20的比率提供牛至和芝麻的颗粒物质时，其应被 理解为颗粒物质的两个群体的混合物，80％携带牛至油并且20％的类型携 带芝麻油；或颗粒的单个群体，每个颗粒以定义的或期望的比率吸收两种 油(即，油是预先混合的并且然后使其与吸收载体/颗粒接触)。与油的类型 无关，颗粒物质总重的20％至50％w/w由颗粒物质上装载的油提供。
颗粒物质还可包含至少一种表面活性剂。如广泛认同的，表面活性剂 是降低液体的表面张力以及同样地两种液体之间的界面张力以允许形成 例如乳状液的化合物。表面活性剂可以是被本领域认为使用安全的(例如， 对植物或动物无毒的)任何种类，包括离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、 阳离子表面活性剂以及两性离子(或非离子)表面活性剂。
在一些实施方案中，表面活性剂是有机农业中可接受的类型。根据本 公开内容待使用的可能的表面活性剂的非限制性列表包括聚乙二醇山梨 糖醇酐三油酸酯(Tween，例如，Tween 85、Tween 65、Tween R85)、山梨 糖醇酐脂肪酸酯(例如，Span 40)、蛋黄卵磷脂、Zohar LQ-215(脂肪酸钾) 和Zohar PT-50(脂肪酸钾)、香芹酚(Carvacrol)。
在一些其他的实施方案中，表面活性剂包括脂肪酸的盐。盐可包括碱 性的诸如钾盐、钙盐、钠盐以及铵盐。
在一些实施方案中，脂肪酸的盐包括脂肪酸的钾盐(也被称为皂盐)， 所述脂肪酸的盐有时被用作杀虫剂、除草剂、杀真菌剂和/或除藻剂。在一 些实施方案中，可通过将氢氧化钾添加到天然的脂肪酸来获得脂肪酸的钾 盐，所述天然的脂肪酸诸如在动物脂肪中和在植物油中发现的那些。可以 从橄榄、棉籽、大豆、花生、向日葵、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻油、苋 菜、玉米、麻风树提取脂肪酸。
形成表面活性剂的脂肪酸还可以是合成的脂肪酸以及半合成的(例如， 经过修饰的天然的脂肪酸)。
根据一些实施方案，至少一种表面活性剂为被识别为或标记为具有杀 虫剂和/或杀真菌剂活性的表面活性剂。不限于以下，杀虫的和/或杀真菌 的表面活性剂可包括商业产品Zohar PT-50和Zohar LQ-215，两者均由 Zohar Dalia,Israel生产。
在一个特定的实施方案中，表面活性剂选自Zohar PT-50和Zohar LQ-215。
这些表面活性剂的组成是从Zohar Dalia可得的。例如，已知Zohar PT-50具有如下文表1中示出的组成：
表1：表面活性剂组成
第一组分中的表面活性剂的量可变化。但是，在一些实施方案中，颗 粒物质包含在5％至10％w/w之间的表面活性剂或表面活性剂的组合。
在与第二组分混合之前，第一组分包含颗粒物质，呈基本干燥的形式。 当提及“基本干燥”时，应理解，第一组分可以包含低量的水，在一些实施 方案中，不超过10％(w/w)。在一些其他或另外的实施方案中，第一组分中 的水含量在1％至7％(w/w)的范围内。在又一些其他的实施方案中，“基本 干燥”应被理解为不包含通过常规方法检测到的水(即，无可检测量的水)。
第一组分还可以包含一些痕量的有机溶剂。如下文将进一步讨论的， 溶剂可以是制备颗粒物质所必需的并且一些残留量可以保留，只要溶剂是 无毒的。在一些实施方案中，第一组分是无溶剂的(即，不包含可检测量的 有机溶剂)或包含痕量即不超过5％、4％、3％或甚至2％w/w的有机溶剂。 溶剂通常是有机挥发性的极性溶剂，诸如，不限于以下，选自由以下组成 的组的溶剂：丙酮、异丙醇(isopropyl alcohol)(异丙醇(isopropanol)，IPA)、 乙腈、丙酮、乙醇和甲醇。在一些实施方案中，在第一组分中检测到痕量 的醇(alcohol)。
第一组分的颗粒物质的独特之处在于其在使颗粒物质与水或者与第 二组分接触后形成稳定的乳状液的能力。这特别是由于第一组分中表面活 性剂的存在而被实现。在使组分干燥之前表面活性剂被添加到带有油的颗 粒中。
当提及稳定的乳状液时，其应被理解为指在乳状液形成之后，油(被分 散的相)在水(分散介质)中的分散持续至少1小时、有时至少2、3、4、5、10、12或甚至24小时的时间段。换言之，稳定性通过不分离成油相和水 相来确定。可以通过本领域已知的任何方式(包括可视检测)来确定不分离。
为了形成乳状液，将颗粒物质与水或者与第二组分中包含的水混合。 水的量取决于颗粒物质的量。在一些实施方案中，对于每克颗粒物质(其 30％是油)，添加水以提供一升乳状液。如此，在1升乳状液中，0.1克颗 粒物质提供0.03％(v/v)的油浓度。在一些实施方案中，最终的乳状液中油 的百分比在0.03％和2％v/v的范围内。
在一些实施方案中，颗粒物质与水的混合提供了具有在1μm至20μm 之间的范围内并且在一些实施方案中在3μm至10μm之间的范围内的液 滴尺寸的乳状液。
在一些实施方案中，乳状液是抗微生物乳状液。
回到第二组分，其具有拮抗活性。在本公开内容的上下文中，当提及 微生物病原体的拮抗物或病原体拮抗物时，应被理解为抑制植物病原体(植 物病原体(plant pathogen)也可被称为植物病原体(phytopathogen))的生物学 实体。抑制，在本公开内容的上下文中应被理解为使病原体的生长减少至 少50％、至少70％、至少90％或甚至基本上消除病原体。在本发明的上下 文中，植物病原体可以是任何原核生物或真核生物，包括但不限于细菌、 真菌、原生动物、线虫或任何其他引起病害的寄生虫。如此，至少一种拮 抗物的微生物活性可以是抗细菌的、抗真菌的、抗原生动物的、抗线虫动 物等的任何一种。
第二组分包含至少一种拮抗性细菌，并且在一些优选的实施方案中， 第二组分包含拮抗物的混合物。混合物应被理解为以相同的或不同的浓度 组合在一起的两种或更多种、有时3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或15种拮抗物的组合。
在一些实施方案中，至少一种拮抗物是能在作为唯一碳源的芝麻油上 生长的类型。这样的拮抗物可通过以下来容易地鉴定：利用芝麻油作为唯 一碳源进行常规培养测定并鉴定实验生长期间存活的那些品种。具体地， 可以根据本公开内容使用的拮抗性细菌是可以区别于针对至少导致番茄 细菌性溃疡的Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis(CBM)不具有 拮抗活性的其他细菌的细菌；或者是能够在碳基油诸如芝麻油上生长的细 菌。在一个实施方案中，所有的拮抗性细菌在其上生长(而测试的非拮抗性 细菌不生长)的碳基油是芝麻油。
在一些实施方案中，拮抗物可被称为抑细菌剂，即其减慢生物体的生 长，并且在一些其他的实施方案中，拮抗物可被称为杀细菌剂(bactericide)， 即其杀死生物体。
在一些实施方案中，微生物病原体的至少一种拮抗物是土源性(soil born)拮抗物。在该上下文中，应理解可从对微生物病原体显示出耐受性(例 如，部分地抵抗)或抵抗的植物的根、土壤和/或根际获得和分离至少一种 拮抗物。
在一些其他的实施方案中，微生物病原体的至少一种拮抗物是植物来 源的拮抗物，例如，从植物的部分诸如叶、茎、花、维管系统分离的。
微生物病原体的至少一种拮抗物也可以是存在于并且因此源自土壤 (即，土源性)和源自植物的部分(例如，维管系统)。
如上文指出的，第二组分可以包含多于一种拮抗物。在一些实施方案 中，第二组分包含在相同的凝胶中的若干种拮抗物的组合，即混合物。但 是，在一些其他的实施方案中，当使用拮抗物的组合时，它们能够各自通 过单独的凝胶携带并且仅在使用之前混合。当使用两种或更多种拮抗性细 菌的组合时，该组合在本文中被称为拮抗混合物。
当使用拮抗物的组合时，可以以相同的量(CFU/ml)或以不同的量将拮 抗物提供/应用至植物。
根据一些实施方案，第二组分中的拮抗物(作为单一的拮抗物或作为拮 抗物的混合物)的量可在500CFU/ml至5,000CFU/ml之间的范围内。当作 为混合物使用时，拮抗物之间的比率可依据待处理的病原体的类型而变 化，且可通过常规实验室方法，例如，在培养皿中最好的抑细菌/杀细菌效 果推理确定。
在一些实施方案中，优选的拮抗物选自由以下组成的组：假单胞菌种(Pseudomonas species)(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)(登录号CBS133254)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(登录号 CBS133255)、Pseudomonas cedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌种(登录 号CBS133257)、假单胞菌种(登录号CBS133258)、假单胞菌种(登录号 CBS134568)、Pseudomonas spanius(登录号CBS133259)、地中海假单胞菌 (Pseudomonas mediterranea)(登录号CBS134566)、绿针假单胞菌 (Pseudomonas chlororaphis)(登录号CBS134567)。
可以与以上列出的至少一种拮抗物组合使用的其他拮抗物在 International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants的报告的表4中提供[由Philippe C.Nicot 2011编辑]，其 内容通过引用并入本文。
另外，待与以上列出的至少一种优选的拮抗物组合的拮抗物可见于多 个文献中，诸如但不限于以下文献，其通过引用并入本文：
如上文指出的，在一些实施方案中，拮抗物是能够在作为唯一碳源的 芝麻油上生长的类型。
为了制备乳状液，可以添加水(除了来自凝胶的水)。当添加水时，水 的总量将取决于第一组分的量。在一些实施方案中，对于每克第一组分(例 如，其30％是油)，添加水以提供一升乳状液。如此，在1升乳状液中，0.1 克颗粒物质提供0.03％v/v的油浓度。
在一些实施方案中，最终的乳状液中油的百分比在0.03％和2％v/v的 范围内。
根据以上，可以由20克第一组分(其30％是油)的粉末和120ml第二 组分的拮抗物凝胶，并且将第一组分和第二组分与水混合以形成包含0.3％v/v油的20升乳状液，来提供最终的制剂。
相似地，可以由50克或100克第一组分的粉末和120ml第二组分的 拮抗物凝胶，并且将第一组分和第二组分与水混合以形成50升或100升 乳状液，来提供制剂。
根据本公开内容，使用以上详细描述的由第一组分和第二组分制备的 生物防治制剂用于治疗或预防被甚至单个种源性感染的种子感染的流行 性传播。
非限制性实施例的描述
实施例1：制备生物防治制剂
通过将两种组分干燥的颗粒物质和拮抗性细菌混合物混合来制备用 于生物防治卵(eggs)的组合物。
精油粉末的制备
材料
为了制备该油粉末，使用以下材料：
天然油：
100％牛至油(精油)和100％芝麻油(碳基油)，两者均购自Makes Scents Natural SPA line,Lancaster PA,USA。
表面活性剂：
购自Sigma-Aldrich的香芹酚。
二氧化硅珠：
购自Evonik Industries AG的Sipernat 50S(SiO2,20μm)。
溶剂：
异丙醇(IPA)、Gadot
方法
对于实验室规模生产，包含天然油、表面活性剂和二氧化硅珠的粉末 利用包括20-50ml容量的实验室瓶、药匙(spatulas)、磁力搅拌器和加热板 的常见的实验室玻璃器皿装置来制备。通常，将天然油称重并在向其添加 了溶剂的20ml小瓶中将每种天然油单独地与选择的表面活性剂混合。将 每种油的混合物混合并加热至约40℃的温度，直到获得均匀溶液。将二氧 化硅珠添加至均匀的溶液中，直到液体被珠吸收。将瓶置于通风橱中过夜， 直到所有的溶剂蒸发。
每种油在最终的干燥粉末中的载量是30％-42％。干燥粉末包含2％-7％ 的水。
用于油粉末的替代性制剂在具有公布号WO/2014/170894的国际专利 申请号PCT/IL2014/050348中详细描述，所述专利的内容通过引用以其整 体并入本文。
拮抗混合物的制备
材料
拮抗混合物包含土源性细菌的混合物作为活性成分。用于产生的分 离、鉴定和培养基条件在具有公布号WO/2014/170894的国际专利申请号 PCT/IL2014/050348中详细描述，所述专利的内容通过引用以其整体并入 本文。
表2提供了于2012年11月19日(并于2013年9月11日请求将原始 保藏转为根据布达佩斯条约的保藏)保藏在CBS-真菌菌种保藏中心 (CBS-KNAW研究院)且用于最终的组合/混合物的菌种的列表。这些菌种贮 存在-80℃下的甘油溶液中(15％)。
表2：保藏的拮抗物
拮抗物 登陆号 名称 假单胞菌种 CBS133252 BN12-27A 嗜碱性假单胞菌 CBS133254 BN12-28 枯草芽孢杆菌 CBS133255 BN12-29 Pseudomonas cedrina CBS133256 BN12-30 假单胞菌种 CBS133257 BN-12-31 假单胞菌种 CBS133258 BN12-32 Pseudomonas spanius CBS133259 BN12-33 地中海假单胞菌AN1 CBS134566 BN13-01 绿针假单胞菌AN10 CBS134567 BN13-02 假单胞菌种AN21 CBS134568 BN13-03
方法
制备拮抗微生物凝胶
将表2中列出的分离的拮抗物单独地转移到包含补充有0.15％粒状琼 脂(Difco)的用于增殖的培养基(蛋白胨(10克/升)、酵母提取物(20克/升)、 甘油(10克/升)、MgSO4(0.1克/升)、CaCO3(2克/升))的锥形烧瓶内，且每种 拮抗物浓度在107至108CFU/ml之间，并在28℃下振摇72小时。然后， 在室温下，使得到的凝胶样混合物维持凝胶形式，直到使用。已显示拮抗 物可以以这种形式保存多达12个月而细菌群体的减少以对数级 (logarithmic order)计不超过2。
细菌长期储存
以包含琼脂的培养基的形式维持拮抗性细菌，所述培养基被发现支持 拮抗性细菌长期(294天)存活。
表2中列出的每种拮抗性细菌还通过它们以牛至油为唯一碳源而存活 长期培养时间段的能力被表征。
生物防治制剂的制备
通过将携带牛至油和芝麻油的干燥的颗粒物质与携带呈混合物的 107-108CFU/ml的每种细菌的琼脂凝胶混合来制备生物防治制剂。然后， 将混合物用水稀释以获得在103-105CFU/ml范围内的每种细菌的浓度，以 及从0.02％-1％(w/v液体)的颗粒物质的浓度。
将油颗粒物质和细菌混合物与适量的水混合至预定的浓度(在以上定 义的范围内)之后，即制备了生物防治混合物并且其随时可用。随时可用型 制剂(ready for use formulation)可在其从制备时起被维持12小时的时间段。
实施例2：幼苗的生物防治
幼苗的处理
在商业苗圃托盘中制备不同植物学的科的并且在其萌发的刚开始阶 段的幼苗(以一式四份，250株幼苗/托盘，参见下文表3)。将托盘在雾条件 下孵育(子叶上和第一片叶上有随用的水)。在2片子叶以及约第一片叶突 出(形成幼嫩植株的第一片真叶的顶端分生组织和胚芽暴露)的生理阶段， 用约15ml/m2的如以上描述制备的制剂喷洒托盘。
第二次喷洒是在第一次喷洒之后3天。最后喷洒是在种植之前2天， 这对于每种类型的植株是特异的。
作为对照，相同植物学的科的幼苗被类似地喷洒，只是仅用水。
结果
在所有的实验中，在测试组和对照组中的一些幼苗由于固有的种源性 病原体细菌而被感染。
在对照(未处理的托盘)，观察到流行病区域，而在大多数被处理的托 盘未观察到病原体症状。参考相关图号，将显示处理的和未处理的幼苗之 间的差异的结果总结于下文表2中(统计学显著的数值)。
表3：处理的效果
1最初侵袭的幼苗意指病原体是种源性或种传的
所有图清楚地显示，与对照幼苗相比，处理的幼苗具有大得多的活力。 在一些图中，种源性病害的来源通过星形圈出。具体地，图1B显示 Xanthomonas campestris pv.campestris从天然侵袭的辣椒种子(标星的区域) 的传播；图3B显示黄单胞菌种在茄子幼苗中的传播；图7B显示 Xanthomonas campestris pv.Campestris由天然侵袭的花椰菜种子的传播。
在一个另外的实验中，还确定了在商业温室种植之前仅两天将番茄幼 苗暴露于第三量的制剂(a third amount of the formulation)的效果。为此目 的，将在苗圃中生长的番茄幼苗分成6组，每组300株幼苗。每组被处理 如下：
未处理的组：未被处理也未人为地用病原体感染的组；
铜组：通过用商业铜杀真菌剂101杀真菌剂/杀细菌剂可湿的 粉末(活性成分氢氧化铜77.0％)喷洒处理的组
第I组：通过用如以上描述制备的颗粒物质的浓度为0.02％的生物防 治制剂喷洒处理的组。
第II组：通过用Pseudomonas syringae pv.Tomato(107CFU/ml)喷洒人 为感染并且不用本发明的制剂处理的组。
第III组：用铜组的商业铜杀真菌剂处理并且通过用Pseudomonas syringae pv.Tomato(107CFU/ml)喷洒人为感染的组。
第IV组：用制剂0.02％(如在第I组中的)处理并且通过喷洒 Pseudomonas syringae pv.Tomato(107CFU/ml)人为感染的组。
多种处理的结果总结在表4中：
表4：比较处理组
组 感染的植物(％) 未处理的组 0.67 铜组 1.00 第I组 0.00 第II组 68.67 第III组 54.67 第IV组 1.33
如表4中显示的，在田间条件下(即在商业温室中种植之后)，与未处 理的组相比，用基于铜的杀真菌剂的处理对感染的幼苗的％没有影响。
如通过与未处理的组相比感染的幼苗的增加显示的，通过用 Pseudomonas syringae pv.Tomato(107CFU/ml)喷洒预先接种是成功的。
此外，用商业杀真菌剂的处理未足够有效降低感染水平(第III组)，而 用本文公开的制剂的处理显著降低了感染的发生率(第IV组)，并且因此被 确定为用于预防病害传播的有效的生物防治处理。
用于不同植物学的科的蔬菜幼苗的所有苗圃处理在复合物中的0.02％ 至2.0％固体制剂(重量/体积)的范围内，而细菌混合物浓度保持不变—在喷 洒罐混合物中不少于5X103CFU/ml。每个品种根据病原体和其植物毒性反 应具有最佳浓度。
在以下实验时，所有幼苗以复合物中的0.6％的相同浓度的固体颗粒物 质(重量/体积)被处理，并且细菌的混合物在喷洒罐混合物中在8X103至 1X104CFU/ml的范围内。
具体地，为了终止细菌流行，在出现两片子叶的阶段，通过用如以上 描述制备的颗粒物质的浓度为0.6％的生物防治制剂喷洒处理幼苗。作为对 照，观察未处理的幼苗。种源性细菌流行从接种物的最初来源—包含种源 性致病细菌的幼苗—开始。在第一次处理之后两天出现第一片叶时第二次 处理同一幼苗。在幼苗准备上市之前两天应用第三次处理(以确保在温室或 田间的种植阶段期间的保护)。
表5A-两次处理之后的病害指数
*病原体在实验室中被分离并鉴定。
**用于幼苗托盘的病害指数是：10＝无病害；0＝100％侵袭的幼苗
***未检测到病原体
表5B-两次处理之后感染的植株(％)
*病原体在实验室中被分离并鉴定。
在运送到市场之前两天给予的第三次处理对每种作物的100株幼苗来 进行，所述作物然后被种植在商业温室中。
表6-第三次处理并且种植在商业地块中之后感染的植株(％)
*病原体在实验室中被分离并鉴定。
**百分比指示其中鉴定出病原体的具有症状的植株。
***种植每种作物的一百株植株。
结果表明在种植之后30天期间无病害发展。