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1、(10)申请公布号 CN 103704135 A (43)申请公布日 2014.04.09 CN 103704135 A (21)申请号 201310710565.4 (22)申请日 2013.12.20 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 长沙学院 地址 410022 湖南省长沙市开福区洪山路 98 号 (72)发明人 陈建荣 唐映红 刘芳 郭清泉 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 一种车前草离体快速繁殖的方法 (57) 摘要 本发明提供一种车前草离体快速繁殖的方 法， 包括如下步骤 ： 1） 愈伤组织诱导。
2、培养 ： 将经灭 菌消毒的车前草叶片切去叶脉和叶缘， 切成小块， 接种到愈伤组织诱导培养基上， 常规培养至形成 愈伤组织和不定芽 ； 2） 生根培养 ： 挑选步骤 1） 中 芽长达 2-3 厘米的不定芽， 将其从愈伤组织上切 下， 其余愈伤组织和不定芽继续愈伤组织诱导培 养， 切下的不定芽接种到生根培养基上， 常规培养 至长出白色的根， 获得无菌车前草种苗。 本发明的 方法外植体消毒效率高达 80%， 无菌苗生根率达 100%， 可快速繁殖车前草无菌种苗， 解决了车前草 植株的繁殖能力低、 繁殖周期长、 资源匮乏、 农药 残留等诸多问题， 在保护野生车前草自然资源和 良好的生态环境等方面具有重。
3、要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103704135 A CN 103704135 A 1/1 页 2 1. 一种车前草离体快速繁殖的方法， 包括如下步骤 ： 1） 愈伤组织诱导培养 ： 将经灭菌消毒的车前草叶片切去叶脉和叶缘， 切成小块， 接种到 愈伤组织诱导培养基上， 常规培养至形成愈伤组织和不定芽 ； 2） 生根培养 ： 挑选步骤 1） 中芽长达 2-3 厘米的不定芽， 将其从愈伤组织上切下， 其余 愈伤组织和不定芽继续愈伤组织诱导培养， 。
4、切下的不定芽接种到生根培养基上， 常规培养 至长出白色的根， 获得无菌车前草种苗。 2. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述灭菌消毒的具 体方法为 ： 采摘无病虫害的车前草叶片， 流水冲洗， 在超净工作台上用酒精浸泡 30s， 再转 入 0.1% 的升汞溶液中浸泡 8min， 用无菌水冲洗 3-5 次。 3. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述小块优选 0.8mm0.8mm 的小块。 4. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述愈伤组织诱导 培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 。
5、10 50g/L、 萘乙酸浓度为 0.05 0.5mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 1.0 4.0mg/L 的培养基。 5. 如权利要求 4 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述愈伤组织诱导 培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄 氨基嘌呤浓度为 1.0mg/L 的培养基， 或以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 2.0mg/L 的培养基。 6. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述生根培养基为。
6、 以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤 浓度为 2.0mg/L 的培养基。 7. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述常规培养的培 养条件为 pH 值 6.0， 培养温度 25， 光照周期 12 小时 / 天， 光照强度为 2000lx。 8. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述愈伤组织诱导 培养的时间为 28-32 天。 9. 如权利要求 1 所述的车前草离体快速繁殖的方法， 其特征在于， 所述生根培养的时 间为 14-16 天。 10. 权利要求 1-。
7、9 任一项所述的车前草离体快速繁殖的方法在车前草繁育中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103704135 A 2 1/3 页 3 一种车前草离体快速繁殖的方法 技术领域 0001 本发明属于植物的组织培养领域， 具体涉及一种车前草离体快速繁殖的方法。 背景技术 0002 车前草属于车前草科植物， 别名又为牛甜草、 车前菜、 车轮菜、 猪耳草等， 长在潮湿 的环境中， 如池塘、 树下、 河边、 路旁等地。车前草具有食用及食疗价值， 富含多种维生素和 蛋白质， 含丰富优良的可溶性膳食纤维。 0003 车前草的种子和全草均可入药， 且毒副作用较小， 是一种优良的药用植物， 含有多 种药用成份， 。
8、如熊果酸， 车前苷、 - 谷甾醇等， 具有利水消肿、 止泻、 清热杀菌、 明目化痰、 消 炎、 降血压等功效 ； 含有的 - 表马钱酸 （-epiloganic acid） 、 胡萝卜苷和木犀草苷三种 成分不但能够能够清除体内的氧自由基防止衰老， 而且还具有抗抑郁的作用， 临床方面的 应用有 ： 治疗阴道炎、 治疗急性乳腺炎、 治疗产后尿潴留、 治疗隐匿性肾炎、 治疗褥疮、 治疗 慢性活动性肝炎、 治疗运动性血红蛋白尿等 ； 还具有一定的利尿作用， 可以治疗血尿、 感冒 和腹泻， 治疗妇科病 （如白带过多） ， 治疗顽固性牙痛。目前也有以车前草为原料生产制剂的 （如软膏， 糖浆， 保健含片， 。
9、保健饮料等） 。另外， 车前草中还含有乌苏酸 B- 谷甾醇、 车前甙桃 叶珊瑚甙、 苯乙醇苷、 维生素 B、 正三十一烷等药用化学成分以及车前果胶、 梓醇、 胆碱、 花生 酸和亚麻酸等脂肪酸、 腺嘌呤等物质。 0004 目前对于车前草的繁殖仅有传统栽培技术。 但因长期过度采伐导致野生车前草逐 渐减少、 种子携带病毒， 环境条件恶化导致药用价值的差异、 育种周期长、 优良品质退化和 农药残余量超标等诸多缺点， 都已严重地影响了车前草的开发利用。研究车前草组织离体 培养快速繁殖技术是解决目前车前草利用困境的有效方法。 发明内容 0005 为解决目前车前草利用中存在的种子携毒、 繁殖周期长、 品质退。
10、化、 药用价值参差 不齐、 农药残余量超标等诸多问题， 本发明提供一种车前草离体快速繁殖的方法。 0006 本发明提供的车前草离体快速繁殖的方法， 包括如下步骤 ： 0007 1） 愈伤组织诱导培养 ： 将经灭菌消毒的车前草叶片切去叶脉和叶缘， 切成小块， 接 种到愈伤组织诱导培养基上， 常规培养至形成愈伤组织和不定芽 ； 0008 2） 生根培养 ： 挑选步骤 1） 中芽长达 2-3 厘米的不定芽， 将其从愈伤组织上切下， 其余愈伤组织和不定芽继续愈伤组织诱导培养， 切下的不定芽接种到生根培养基上， 常规 培养至长出白色的根， 获得无菌车前草种苗。 0009 其中， 所述灭菌消毒的具体方法为。
11、 ： 采摘无病虫害的车前草叶片， 流水冲洗， 在超 净工作台上用酒精浸泡 30s， 再转入 0.1% 的升汞溶液中浸泡 8min， 用无菌水冲洗 3-5 次。 0010 其中， 所述小块优选 0.8mm0.8mm 的小块。 0011 其中， 所述愈伤组织诱导培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 10 50g/L、 萘乙酸 （NAA）浓度为 0.05 0.5mg/L、 6- 苄氨基嘌呤 （6-BA）浓度为 1.0 说 明 书 CN 103704135 A 3 2/3 页 4 4.0mg/L 的培养基。 0012 优选的， 所述愈伤组织诱导培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 。
12、所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 1.0mg/L 的培养基， 或以 MS 培养基为 基本培养基， 所含蔗糖浓度为30g/L、 萘乙酸浓度为0.1mg/L、 6-苄氨基嘌呤浓度为2.0mg/L 的培养基。 0013 其中， 所述生根培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙 酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 2.0mg/L 的培养基。 0014 其中， 所述常规培养的培养条件为 pH 值 6.0， 培养温度 25， 光照周期 12 小时 / 天， 光照强度为 2000lx。 0015 其中， 所。
13、述愈伤组织诱导培养的时间为 30 天。 0016 其中， 所述生根培养的时间为 15 天。 0017 本发明还提供所述车前草离体快速繁殖的方法在车前草繁育中的应用。 0018 本发明的有益效果在于 ： 0019 1） 本发明外植体消毒效率高达 80%， 无菌苗生根率达 100%， 可快速繁殖车前草无 菌种苗。 0020 2） 本发明解决了车前草植株的繁殖能力低、 繁殖周期长、 资源匮乏、 农药残留等诸 多问题。 0021 3） 本发明首次采用离体快速繁殖技术对车前草进行组织培养， 不仅可以满足市场 需求， 而且还可以为工厂大规模生产提供有益的理论参考。 0022 4） 本发明在保护野生车前草自。
14、然资源和良好的生态环境等方面具有重要意义。 具体实施方式 0023 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。 0024 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中所用化学试剂均可市购。 0025 实施例 1 0026 利用本发明进行车前草离体快速繁殖。 0027 外植体的选择及消毒 ： 从野外采摘无病虫害的野生车前草叶片， 在流水下洗去尘 土， 在超净工作台上先用酒精浸泡30s， 再转入0.1%的升汞溶液中浸泡8min， 用无菌水冲洗 3。
15、-5 次， 最后在无菌条件下切去车前草叶片的叶脉和边缘， 切成 0.8mm0.8mm 的小块。 0028 1） 愈伤组织诱导培养 ： 将经灭菌消毒的车前草叶片切成的 0.8mm0.8mm 小块接 种到愈伤组织诱导培养基上， 常规培养。所述愈伤组织诱导培养基为以 MS 培养基为基本培 养基， 所含蔗糖浓度为30g/L、 萘乙酸浓度为0.1mg/L、 6-苄氨基嘌呤浓度为1.0mg/L的培养 基， 培养基 pH 值为 6.0。所述常规培养的培养条件为 pH 值 6.0， 培养温度 25， 光照周期 12 小时 / 天， 光照强度为 2000lx。培养 30 天， 形成了愈伤组织和大量不定芽， 其中。
16、有些不 定芽长达 2-3 厘米。 0029 2） 生根培养 ： 挑选步骤 1） 中芽长达 2-3 厘米的不定芽， 将其从愈伤组织上切下， 其余愈伤组织和不定芽继续愈伤组织诱导培养， 切下的不定芽接种到生根培养基上， 常规 说 明 书 CN 103704135 A 4 3/3 页 5 培养， 培养条件同步骤 1） 。所述生根培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度 为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 2.0mg/L 的培养基， 培养基 pH 值为 6.0。培养 15 天， 长出了白色的根， 获得无菌车前草种苗。 0030 结果表明， 外植体消毒效。
17、率高达 80%， 能快速获得无菌不定芽， 生根率达 100%， 能 够得到保持母株优良性状的大量车前草种苗。 0031 实施例 2 0032 利用本发明进行车前草离体快速繁殖。 0033 所述愈伤组织诱导培养基为以 MS 培养基为基本培养基， 所含蔗糖浓度为 30g/L、 萘乙酸浓度为 0.1mg/L、 6- 苄氨基嘌呤浓度为 2.0mg/L 的培养基， 培养基 pH 值为 6.0。其他 条件同实施例 1。 0034 结果表明， 外植体消毒效率高达 80%， 能快速获得无菌不定芽， 生根率达 100%， 能 够得到保持母株优良性状的大量车前草种苗。 0035 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103704135 A 5 。