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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610458263.6 (22)申请日 2016.06.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106035068 A (43)申请公布日 2016.10.26 (73)专利权人 成都市农林科学院 地址 611130 四川省成都市温江区农科路 200号 (72)发明人 付绍红 杨进 王继胜 李云 邹琼 陶兰蓉 康泽明 唐蓉 (74)专利代理机构 成都立信专利事务所有限公 司 51100 代理人 江晓萍 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01。
2、) A01H 4/00(2006.01) A01H 1/08(2006.01) 审查员 王岩 (54)发明名称 油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种 及材料的方法 (57)摘要 本发明油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油 菜品种及材料的方法， 包括： 1） 确定芥菜型油菜 品种及材料选育的目标性状； 2） 将至少2个具有 目标性状的芥菜型油菜杂交、 聚合杂交或回交。 3） 用油菜双单倍体诱导系对杂交、 聚合杂交或回 交后代授粉； 4） 鉴定诱导后代遗传稳定性,并按 株系自交繁殖； 5） 诱导稳定后代株系产量、 抗性、 品质性状鉴定； 6） 根据产量、 品质性状、 抗性， 确 定稳定株系形成芥菜型油菜。
3、常规品种； 7） 诱导后 代遗传稳定株系形成芥菜型油菜新品系并与芥 菜型油菜不育系测交， 形成保持系或恢复系， 或 进入下一轮品种及材料选育过程。 本发明方法能 大大提高芥菜型油菜杂交品种或常规品种的选 育速度和效率， 降低人力物力。 权利要求书3页 说明书10页 附图7页 CN 106035068 B 2018.05.25 CN 106035068 B 1.油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方法， 包括以下步骤： 1)确定芥菜型油菜品种选育的目标性状要求， 将至少2个具有目标性状的芥菜型油菜 与其他芥菜型油菜杂交或聚合杂交， 根据目标性状要求进行回交或多代回交， 形成回交后 代； 。
4、2)对上述步骤1） 中杂交后代、 聚合杂交后代或回交后代， 在花期， 对花蕾进行人工去 雄， 并套袋隔离； 3)用油菜双单倍体诱导系花粉对上述步骤2） 中去雄后24天植株进行人工授粉， 并套 袋隔离， 收获其诱导后代种子； 4)对上述步骤3） 中获得诱导后代种子进行单株种植， 苗期利用流式细胞仪鉴定倍性， 淘汰多倍体、 单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株， 选择正常育性、 外型像 芥菜型油菜的四倍体植株， 单株套袋自交； 5)上述步骤4） 中单株自交种子进行株系种植， 调查株系形态一致性， 并通过分子标记 鉴定株系一致性及稳定性； 6)上述步骤5） 中稳定株系进行产量潜力、 抗性、。
5、 品质性状鉴定， 产量、 品质性状、 抗性达 到生产需求的稳定株系， 形成芥菜型油菜常规品种； 7） 上述步骤5） 中形成的新品系与芥菜型油菜细胞质不育系或细胞核不育系测交， 根据 测交后代的育性， 测交后代全可育其测交父本为恢复系， 测交后代全不育其测交父本为保 持系； 8） 上述步骤7） 中确定测交父本为恢复系与对应不育系统的不育系测配， 选育芥菜型油 菜杂交组合或品种； 上述步骤7） 中确定测交父本为保持系与对应不育系统的不育系多代回 交， 选育与该保持系基因型一致的新芥菜型油菜不育系； 上述步骤3） 中油菜双单倍体诱导系选育方法， 包括如下步骤： （1） 选育具有孤雌生殖遗传特性的早代。
6、稳定系： 将两个油菜亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体 加倍获得加倍后的F1代植株； 加倍后的F1代植株进行自交或强制自交获得F2代， 对F2代进行田间种植观察， 并鉴定 每个单株的育性， 选择可育后代自交获得F3代， 对F3代进行纯合度鉴定， 通过形态、 细胞学以 及分子标记鉴定， 对后代DNA进行聚合酶链反应扩增， 电泳观察每个特异引物扩增下单株的 DNA带型及条带数目， 显示每个单株都是两个亲本的杂交后代， 每个单株之间分子标记图谱 一致， 说明这些单株是纯合系早代稳定系； 获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交， F1代、 F2代鉴定早代。
7、 稳定系的遗传特性， 即是否有孤雌生殖特性； 上述正反交， 如有F1分离， F2代出现部分稳定株 系， 对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系； （2） 选育携带显性遗传性状、 具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜： 具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到杂交F1代种子， 杂交F1种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 得到加倍后的带显性性 状的F1代植株； 对加倍的带显性性状的F1代植株， 通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定， 选择带显性性状的多倍体的F1代植株， 淘汰非正常加倍株、 非整倍体植株、 以及不带显性性 权 利 要 求 。
8、书 1/3 页 2 CN 106035068 B 2 状加倍植株； 带显性性状的多倍体的F1代植株是倍性遗传稳定、 结实性好、 具有孤雌生殖遗 传特性、 带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株； 油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定： 倍性遗传稳定、 具有孤雌生殖遗传特性、 带显性性状的多倍体植株中的显性性状能 去除测交后代中产生的杂交株， 如果测交后代中出现显性性状植株、 或非整倍体植株， 说明 该植株是多倍体植株和母本杂交产生的， 去除该植株； 上述单株测交后代如果出现全不育、 为正常倍性即二倍体或四倍体油菜、 且不带显 性性状， 说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中， 显性多倍体植株。
9、为油菜双单 倍体诱导系。 2.如权利要求1所述的中油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方法， 其 特征在于在于油菜双单倍体诱导系选育是将两个亲本材料杂交F1代种子或具有孤雌生殖 遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F1代种子在培养基上用染色 体加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 具体方法如下： 1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒2540秒， 用0.1%升汞消毒1217分钟， 然后用 无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在 第一培养基上； 2） 让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件： 温度23250C， 白天光照1216小时。
10、， 光 照强度20003000勒克斯， 夜晚暗培养812小时， 待植株长到12片真叶时， 从下胚轴处 剪下植株继续在第二培养基上生长； 3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植株转 入第三培养基中进行生根培养； 4)生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗37天， 取出植株将植株 上的培养基用自来水冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡1530分钟后移栽到温室中， 温室 温度160C250C， 相对湿度6080%， 能保证移栽成活率在95%以上； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： MS 培养基 1L 6苄基腺嘌呤 0.51.5mg 染色体加倍。
11、诱导剂 3070mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第一培养基的pH=5.86.0， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： MS培养基 1L 6苄基腺嘌呤 0.51mg 染色体加倍诱导剂 2040mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第二培养基的pH=5.86.0， 上述的第三培养基由以下配比的组分组成： 权 利 要 求 书 2/3 页 3 CN 106035068 B 3 MS 培养基 1L 萘乙酸 0.030.5mg 染色体加倍诱导剂 520mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第三培养基的pH=5.86.0， 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成： 水 1L 易保或克露。
12、 0.61.2g 萘乙酸 0.51mg。 3.如权利要求1或2所述的油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方法， 其 特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、 氟乐灵、 氨磺乐灵中的至少一种。 权 利 要 求 书 3/3 页 4 CN 106035068 B 4 油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方法 0001 技术领域： 0002 本发明与农业有关， 特别与油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方 法有关。 0003 背景技术： 0004 油菜是我国主要的油料作物， 包括3个栽培种， 甘蓝型油菜 （Brassica napus， 芸苔 （aa， n=10） 与甘蓝 （cc。
13、， n=9） 通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种， 根据染 色体来源判断为四倍体， 2n=38） ； 白菜型油菜 （Brassia campestris L. 包括原产中国的芸 苔和油白菜。 中国又称小白菜、 矮油菜、 甜油菜等。 染色体组为aa， n=10， 根据来源染色体组 来源判断为二倍体， 2n=20， ） ； 芥菜型油菜 （Brassica juncea， , 由芸薹(aa， n=10)和黑芥 (bb， n=8)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一个复合种， 根据染色体来源判断为四 倍体， 2n=36） 。 芥菜型油菜具有耐贫瘠、 黄籽、 高含油等优点， 适合在山区、 。
14、土地贫瘠地区种 植， 且一些研究发现芥菜型油菜具有富集土壤重金属的特性。 目前， 推广的芥菜型油菜多为 常规品种， 杂交品种由于不育系、 恢复系选育困难不宜实现三系配套。 0005 芥菜型油菜新品种选育， 首先是选育新的自交系或遗传稳定的纯合株系纯合系 （自交系） ， 如这些纯合株系在抗性、 产量、 品质等要求上满足生产需要， 通过区域试验最后 审定为新的芥菜型油菜新品种 （常规品种） 。 其次， 纯合株系与不育系测交， 判断恢保关系， 如果是恢复系与不育系杂交测配新的杂交品种， 如果是保持系与不育系测配， 选育具有该 保持系特性的新的不育系， 如果稳定株系不恢不保 （测配后代不能完全恢复育性。
15、或不能完 全保持高度不育） ， 也不能形成生产上使用的常规品种， 这样的纯合株系要么淘汰， 要么与 其他保持系或恢复系杂交进入下一轮育种材料选育。 正常情况下通过常规的人工杂交选育 一个常规芥菜型油菜品种需要67代的时间， 如果选育杂交品种， 需要培育稳定的不育系、 保持系、 恢复系， 芥菜型油菜新品种选育时间更长， 1020年。 常规芥菜型油菜新品系选育 是通过两个或多个遗传背景不同的品系杂交、 聚合杂交或回交形成杂交F1代(或回交BC1代， 根据目标性状的选择要求可进行多代回交形成BC2、 BC3等等)， 回交后代或 F1代自交 形成F2代， F2代再选择优良单株自交形成F3代， F3再选。
16、单株自交， 一直到F6F7代才能获得稳 定的油菜新品系， 以1年1代计算， 所花时间大概在78年的时间， 通过异地加代也需要4年 左右的时间。 0006 目前， 在油菜中还未有诱导系或双单倍体诱导系的报道。 所谓 “诱导系” 是指， 用该 植物作为父本用其花粉对同类植株授粉， 能诱导同类植株 （母本） 产生相应的效应， 如产生 单倍体、 双单倍体 （DH系） 等。 在植物中运用诱导系进行新品种选育最多的是玉米， 但玉米中 的诱导系也只是单倍体诱导系。 最早出现的玉米单倍体诱导系为stock6， 该诱导系只能诱 导玉米产生单倍体， 然后单倍体植株再进行人工染色体加倍形成纯合二倍体 （双单倍体） 。
17、， 且诱导效率较低， 一般诱导效率在10%以下 （以收获种子中获得单倍体数计算） 。 0007 发明内容： 0008 本发明的目的为了提供一种能快速、 有效， 只需3代 （2年或3年） 获得稳定纯合的芥 菜型油菜株系， 提高芥菜型油菜选育新材料、 常规油菜品种、 以及杂种优势利用的效率， 使 说 明 书 1/10 页 5 CN 106035068 B 5 芥菜型油菜杂交育种更为便捷高效的油菜双单倍体选育芥菜型油菜品种及材料的方法。 0009 本发明的目的是这样来实现的： 0010 本发明油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料的方法， 包括如下步骤： 0011 1)确定芥菜型油菜品种选育的目。
18、标性状要求， 如高含油、 抗倒伏、 抗低温、 黄籽， 早 熟、 耐贫瘠、 高富集重金属等性状， 将至少2个具有目标性状的芥菜型油菜与其他芥菜型油 菜杂交或聚合杂交， 根据目标性状要求进行回交或多代回交， 形成回交后代； 0012 2)对上述步骤1） 中杂交后代、 聚合杂交后代或回交后代， 在花期， 对花蕾进行人工 去雄， 并套袋隔离； 0013 3)用油菜双单倍体诱导系花粉对上述步骤2） 中去雄后24天植株进行人工授粉， 并套袋隔离， 收获其诱导后代种子； 0014 4)对上述步骤3） 中获得诱导后代种子进行单株种植， 苗期利用流式细胞仪鉴定倍 性， 淘汰多倍体、 单倍体或具有油菜双单倍体诱导。
19、系显性性状特征植株， 选择正常育性、 外 型像芥菜型油菜的四倍体植株， 单株套袋自交； 0015 5)上述步骤4） 中单株自交种子进行株系种植， 调查株系形态一致性， 并通过分子 标记 （SSR或SRAP） 鉴定株系一致性及稳定性； 0016 6)上述步骤5） 中稳定株系进行产量潜力、 抗性、 品质性状鉴定， 产量、 品质性状、 抗 性达到生产需求的稳定株系， 形成芥菜型油菜常规品种。 0017 7） 上述步骤5） 中形成的新品系与芥菜型油菜细胞质不育系或细胞核不育系测交， 根据测交后代的育性， 测交后代全可育其测交父本为恢复系， 测交后代全不育其测交父本 为保持系； 0018 8） 上述步骤。
20、7） 中确定测交父本为恢复系与对应不育系统的不育系测配， 选育芥菜 型油菜杂交组合或品种； 上述步骤7） 中确定测交父本为保持系与对应不育系统的不育系多 代回交， 选育与该保持系基因型一致的新芥菜型油菜不育系； 0019 采用本发明方法获得芥菜型油菜稳定遗传后代借助了油菜双单倍体诱导系能诱 导母体植株在F1代发生孤雌生殖， 在F2代形成稳定的双单倍体个体， F3代进行稳定性、 一致 性鉴定， 获得稳定遗传后代； 0020 上述步骤3） 中油菜双单倍体诱导系选育方法， 包括如下步骤： 0021 (1)选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系： 0022 将两个油菜亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染。
21、色体加倍诱导剂进行人工 染色体加倍获得加倍后的F1代植株； 0023 加倍后的F1代植株进行自交或强制自交获得F2代， 对F2代进行田间种植观察， 并 鉴定每个单株的育性， 选择可育后代自交获得F3代， 对F3代进行纯合度鉴定， 通过形态、 细胞 学以及分子标记鉴定， 对后代DNA进行聚合酶链反应扩增， 电泳观察每个特异引物扩增下单 株的DNA带型及条带数目， 显示每个单株都是两个亲本的杂交后代， 每个单株之间分子标记 图谱一致， 说明这些单株是纯合系早代稳定系； 0024 获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交， F1代、 F2代鉴定 早代稳定系的遗传特性， 即是否有孤雌生。
22、殖特性； 上述正反交， 如有F1分离， F2代出现部分稳 定株系， 对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系； 0025 （2） 选育携带显性遗传性状、 具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜： 说 明 书 2/10 页 6 CN 106035068 B 6 0026 具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交 （如显性矮杆、 紫叶、 花叶、 黄叶、 高芥酸等性状） ， 得到杂交F1代种子。 上述杂交F1种子在培养基上用染色体 加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 得到加倍后的带显性性状的F1值株； 0027 对加倍的带显性性状的F1植株， 通过显微观察或流式细胞仪进行染色。
23、体倍性鉴 定， 选择带显性性状的多倍体的F1代植株， 淘汰非正常加倍株、 非整倍体植株、 以及不带显 性性状加倍植株； 带显性性状的多倍体F1代植株主要是倍性遗传稳定、 结实性好、 具有孤雌 生殖遗传特性、 带显性性状 （如显性矮杆、 紫叶、 花叶、 黄叶、 高芥酸等性状） 的六倍体或八倍 体油菜植株； 0028 （3） 油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定： 0029 倍性遗传稳定、 具有孤雌生殖遗传特性、 带显性性状的多倍体植株中的显性性 状能去除测交后代中产生的杂交株， 如果测交后代中出现显性性状植株、 或非整倍体植株， 说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的， 去除该植株； 0030 。
24、上述单株测交后代如果出现全不育、 为正常倍性 （二倍体或四倍体） 油菜、 且不 带显性性状， 说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中， 显性多倍体植株为油菜 双单倍体诱导系。 0031 上述方法中获得油菜双单倍体诱导系是将两个亲本材料杂交F1代种子或具有孤 雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F1代种子在培养基上 用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 具体方法如下： 0032 1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒2540秒， 用0.1%升汞消毒1217分钟， 然 后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接 种在第一培养基上。
25、； 0033 2） 让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件： 温度23250C， 白天光照1216小 时， 光照强度20003000勒克斯， 夜晚暗培养812小时， 待植株长到12片真叶时， 从下胚 轴处剪下植株继续在第二培养基上生长； 0034 3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基中进行生根培养； 0035 4)生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗37天， 取出植株将 植株上的培养基用自来水冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡1530分钟后移栽到温室中， 温室温度160C250C， 相对湿度6080%， 能保证移栽成。
26、活率在95%以上； 0036 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： 0037MS 培养基 1L 0038 6苄基腺嘌呤 0.51.5mg 0039 染色体加倍诱导剂 3070mg 0040 蔗糖 2030g 0041 琼脂 810g， 0042 第一培养基的pH=5.86.0， 0043 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： 0044 MS培养基 1L 0045 6苄基腺嘌呤 0.51mg 说 明 书 3/10 页 7 CN 106035068 B 7 0046 染色体加倍诱导剂 2040mg 0047 蔗糖 2030g 0048 琼脂 810g， 0049 第二培养基的pH=5.86.0。
27、， 0050 上述的第三培养基由以下配比的组分组成： 0051 MS 培养基 1L 0052 萘乙酸 0.030.5mg 0053 染色体加倍诱导剂 520mg 0054 蔗糖 2030g 0055 琼脂 810g， 0056 第三培养基的pH=5.86.0， 0057 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成： 0058 水 1L 0059 易保或克露 0.61.2g 0060 萘乙酸 0.51mg。 0061 油菜双单倍体诱导系能直接诱导油菜产生双单倍体后代， 无需进行人工染色体加 倍来获得纯合系； 且诱导效率高， 最高可达100%， 一般的诱导效率都在50%以上。 双单倍体诱 导系诱导母体。
28、植株产生双单倍体的主要原理是： 诱导系能诱导母体植株， 大孢子生殖细胞 （卵细胞） 产生孤雌生殖效应， 且卵细胞能进行染色体加倍， 即卵细胞孤雌生殖产生的后代 就双单倍体。 本发明是油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜新材料及品种的方法， 对芥菜 型油菜品种选育、 育种材料、 育种资源创新具有积极的促进作用。 该专利方法可以快速 （3 代） 、 高效获得育种上有应用价值的芥菜型油菜材料及常规品种， 对芥菜型油菜开展杂交品 种选育也具有积极的促进作用。 0062 上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、 氟乐灵、 氨磺乐灵中的至少一种。 0063 以上描述的方法可以快速用于芥菜型油菜新材料及品种选育， 。
29、特别是芥菜型油菜 恢复系、 保持系材料的快速选育， 以及芥菜型油菜常规品种的快速选育。 可以在2年或3代的 时间内获得上述材料或品种， 大大节约芥菜型油菜的育种时间， 提高育种效率。 0064 上述油菜双单倍体诱导系 （六倍体或八倍体植株） 的基本原理是： 诱导系具有孤雌 生殖诱导基因， 诱导系作父本时， 诱导系染色体 （或基因） 没有与母体植株染色体融合， 而是 诱导母体植株 （即卵细胞） 产生孤雌生殖效应， 且母体植株卵细胞染色体自身加倍形成双单 倍体。 0065 本发明具有以下优点： 0066 1、 该方法可快速 （2年或3代） 选育芥菜型油菜杂交种亲本材料 （恢复系、 保持系） ， 极。
30、大地提高了芥菜型油菜杂交品种选育速度和效率。 0067 2、 该方法可快速 （2年或3代） 选育芥菜型油菜常规品种， 极大地提高了芥菜型油菜 品种选育速度和效率。 0068 3、 该方法可运用于芥菜型油菜， 特别是杂交品种选育的不同杂种优势利用途径。 芥菜型油菜细胞质不育系统(CMS)， 芥菜型油菜核不育系统 （GMS） 均可应用。 0069 4、 油菜双单倍体诱导系直接诱导母体植株产生双单倍体， 无需进行人工染色体加 说 明 书 4/10 页 8 CN 106035068 B 8 倍， 可一步形成稳定后代。 0070 附图说明： 0071 图1为利用油菜双单倍体诱导系选育芥菜型油菜品种及材料。
31、流程图。 0072 图2为油菜双单倍体诱导系选育流程图。 0073 图3为获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0074 图4为油菜双单倍体诱导系Y3560选育流程图。 0075 图5为油菜双单倍体诱导系Y4958的选育流程图。 0076 图6为油菜早代稳定系P32选育流程图。 0077 图7为芥菜型油菜新品系GS5的选育流程图。 0078 图8为芥菜型油菜新品系GZ8的选育流程图。 0079 图9为P32四倍体油菜根尖染色体倍性鉴定图。 0080 图10为P32四倍体油菜流式细胞倍性鉴定图。 0081 图11为为Y3560流式细胞倍性鉴定图。 0082 图12为Y4958流式细胞倍性鉴定图。 0。
32、083 具体实施方式： 0084 实施例1： 0085 参见图1、 图2、 图5、 图7， 芥菜型油菜狗尾巴GW(四川山区地方品种， 四倍体， 2n 36） 具有黄籽、 抗病、 抗倒、 含油率高 （45%） 、 植株紧凑、 耐土壤贫瘠等特性， 但植株高 （2.5米 以上） ， 熟期较晚； 另外一个芥菜型油菜扫把芥SBJ （成都金堂地方品种， 四倍体， 2n36） 具 有生育期短、 早熟、 分枝多、 株高较矮 （150cm左右） 、 耐土壤贫瘠等特点， 但含有率低 （35 38%） ， 褐色籽粒、 株体纤细蓬松不紧凑。 为了选育株型更好、 植株高度适中 （160170cm） 、 黄 籽粒、 生育。
33、期短、 早熟、 高含油、 耐土壤贫瘠芥菜性油菜品系， 将上述两个地方品种去雄杂 交， 1代花期剥蕾去雄， 用本申请人获得的油菜双单倍体诱导系Y4958作父本进行授粉诱 导， F2代 （诱导后代） 单株种植， 并进行流式细胞检测、 选育性正常、 倍性 （四倍体） 正常、 无诱 导系显性性状 （花叶） 植株套袋自交， 3代按株系种植， 鉴定株系内性状一致性和稳定性， 选育出一个遗传稳定、 含油率45%、 株高165cm、 熟期较早、 黄籽粒、 分枝多而2紧凑的芥菜型 油菜新品系GS5。 0086 上述油菜双单倍体诱导系是通过以下方法获得的： 0087 参见图2、 图4、 图9、 图10、 图11，。
34、 由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系 P32， 与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交， 3个正反交F1代出现分离， 且这3个组合F2代出 现稳定株系， 说明P32具有孤雌生殖遗传特性。 用P32与高芥酸、 矮杆油菜4247正反交 （矮杆、 高芥酸为显性性状） ， 然后将杂交F1代种子进行染色体加倍， 加倍后代用流式细胞仪 鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株， 该植株定名为Y3560。 0088 参见图2、 图5、 图9、 图10、 图12， 由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系 P32， 与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交， 3个正反交F1代出现分离， 且这3个组合F2代。
35、出 现稳定株系， 说明P32具有孤雌生殖遗传特性。 用P32与白菜型花叶油菜08nl杂交 （花叶 为显性性状） ， 然后将杂交F1代种子进行染色体加倍， 加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显 微镜观察鉴定为显示矮杆六倍体植株， 该植株定名为Y4958。 0089 本实施例中将P32与矮杆、 高芥酸油菜4247杂交F1以及P32与白菜型花叶油菜 说 明 书 5/10 页 9 CN 106035068 B 9 08nl杂交1种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下： 0090 1） 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒， 用0.1%升汞消毒12分钟， 然后用无菌 水将种子表面的升汞。
36、冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在第一 培养基 （染色体加倍诱导培养基） 上； 0091 2)让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件： 温度250C， 白天光照16小时， 光照 强度2000勒克斯， 晚上暗培养8小时,待长到12片真叶时， 将植株从下胚轴剪下继续在第 二培养基上生长； 0092 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养； 0093 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗3天后， 取出植株将 植株上的培养基冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡15。
37、分钟后移栽到温室中， 温室温度250C， 相对湿度60%， 能保证移栽成活率在95%以上； 0094 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： 0095MS 培养基 1L 0096 6苄基腺嘌呤 （6BA） 0.5mg 0097 秋水仙素 50mg 0098 蔗糖 20g 0099 琼脂 8g， 0100 第一培养基的pH=5.86.0， 0101 MS培养基由Murashige和Skoog发明， 简写为MS， 其配方参见附表1， 0102 上述的第二培养基由以下配比的组分组成： 0103 MS培养基 1L 0104 6苄基腺嘌呤 （6BA） 0.5mg 0105 秋水仙素 30mg 0106 。
38、蔗糖 30g 0107 琼脂 8g， 0108 第二培养基的pH=5.86.0， 0109 上述的第三培养基由以下配比的组分组成： 0110 MS 培养基 1L 0111 萘乙酸 0.03mg 0112 秋水仙素 20mg 0113 蔗糖 20g 0114 琼脂 8g， 0115 第三培养基的pH=5.86.0， 0116 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成： 0117 水 1L 0118 易保或克露 0.6g 0119 萘乙酸 0.5mg。 0120 参见图2、 图4、 图11， 用Y3560作父本， 与甘蓝型油菜细胞质不育系 （0464A） 测交， 测 说 明 书 6/10 页 10 C。
39、N 106035068 B 10 交后代80株， 全为高杆,且76为四倍体油菜、 2株为二倍体、 2株为八倍体； 其中76株四倍体植 株为全不育， 4株半不育， 且形态特征与0464A完全相同。 同时用P32与矮杆、 高芥酸油菜 4247杂交F1（非加倍株） 做父本与0464A测交作为对照验证， 测交后代153株， 出现矮杆102 株、 高杆51株、 且育性分离较大， 出现全可育65株、 半不育35株、 全不育53株。 说明Y3560中的 基因并未进入测交株， 测交后代为0464A孤雌生殖而来， 诱导率95%。 0121 用Y3560做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH （二倍体油菜， 2n20）。
40、 去雄杂交， 获得 杂交F1植株145株， 143株F1形态与YH完全相同， 且每个单株自交后F2代形态都为二倍体、 外 形与YH一致， 说明Y3560与YH杂交过程， 诱导YH发生了孤雌生殖， 所产生的F1为孤雌生殖自 交， 且与YH形态完全相同， 该诱导率98 6%。 0122 同样用Y3560做父本与芥菜型油菜GW （四倍体油菜， 2n36） 去雄杂交， 获得杂交F1 植株124株， 123株F1形态与GW完全相同， 且每个单株自交后F2代形态都为四倍体、 外形与YH 一致， 说明Y3560与GW杂交过程， 诱导GW发生了孤雌生殖， 所产生的F1为孤雌生殖自交， 且与 GW形态完全相同，。
41、 该诱导率99 2%。 最终， 显性矮杆八倍体植株Y3560确定为油菜双单倍体诱 导系。 0123 参加图2、 图5、 图12， 用Y4958作父本， 与甘蓝型油菜细胞质不育系 （0068A） 测交， 测 交后代112株， 全为高杆,且全为四倍体油菜， 其中108株为全不育， 4株半不育， 且形态特征 与0068A完全相同。 同时用P32与白菜型花叶油菜08nl杂交F1（非加倍株） 做父本与0068A 测交作为对照验证， 测交后代89株， 出现常叶植株59株、 花叶植株30株、 且育性分离较大， 出 现全可育45株、 半不育20株、 全不育24株。 说明Y4958中的基因并未进入测交株， 测交。
42、后代为 0068A孤雌生殖而来， 诱导率96 4%。 0124 用Y4958做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH （二倍体油菜， 2n20） 去雄杂交， 获得 杂交F1植株88株， 88株F1形态与YH完全相同， 且每个单株自交后F2代形态都为二倍体、 外形 与YH一致， 说明Y4959与YH杂交过程， 诱导YH发生了孤雌生殖， 所产生的F1为孤雌生殖自交， 且与YH形态完全相同， 该诱导率100%。 0125 用Y4958做父本与芥菜型油菜GW （四倍体油菜， 2n36） 去雄杂交， 获得杂交F1植株 75株， 75株F1形态与GW完全相同， 且每个单株自交后F2代形态都为四倍体、 外形与GW一。
43、致， 说 明Y4958与GW杂交过程， 诱导GW发生了孤雌生殖， 所产生的F1为孤雌生殖自交， 且与GW形态 完全相同， 该诱导率100%。 0126 同样Y4958做父本与核不育不育系3306测交， 测交后代159株， 且全为四倍 体油菜， 其中108株为全不育， 4株半不育， 且形态特征与0068A完全相同。 同时用P32与白 菜型花叶油菜08nl杂交F1（非加倍株） 做父本与0068A测交作为对照验证， 测交后代89株， 出 现常叶植株59株、 花叶植株30株、 且育性分离较大， 出现全可育45株、 半不育20株、 全不育24 株。 说明Y4958中的基因并未进入测交株， 测交后代为00。
44、68A孤雌生殖而来， 诱导率96 4%。 0127 最终， 显性花叶六倍体植株Y4958确定为油菜双单倍体诱导系。 0128 参见图3、 图6、 图9、 图10， 获得早代稳定系P32方法如下： 0129 甘蓝型油菜F009 （四倍体， 染色体2n=38） 与白菜型油菜YH （二倍体， 雅安黄油菜， 染 色体2n=20） 剥蕾进行人工去雄杂交获得F1代杂交种子。 F1代杂交种子在培养基上用秋水仙 素进行人工染色体加倍。 对加倍后的F1代植株进行自交 （或强制自交） 获得F2代， 对F2代进行 田间种植观察、 育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色， 判断花粉育性， 出现三种情况 （1、 单 说 明 。
45、书 7/10 页 11 CN 106035068 B 11 倍体植株， 花粉极少， 且育性极低； 2、 多倍体植株完全不育， 花器官发育受阻， 不能正常的开 花， 无花粉； 3、 正常可育的植株， 花粉量多， 花粉育性95%以上） 。 对F2代正常可育单株进行自 交获得F3代。 对F3代进行纯合度鉴定， 种植F3代单株株系， 32%的可育株系单株植株整齐一 致， 开花结实正常。 对整齐一致株系进行细胞学鉴定， 染色体条数一致 （38条） ， 染色体形态 未出现异常。 SSR分子标记， 通过DNA聚合酶链反应， 电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA 带型， 显示每个单株都是F009与YH的杂交后。
46、代， 且每个单株DNA扩增条带数目及带型一致， 可以判断这些株系为纯合系， 即早代稳定系。 将其中1个叶片较大、 无裂叶、 叶片着生紧凑、 含油率55%的甘蓝型 （染色体38条） 油菜早代稳定系定名为P32。 0130 本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体 方法如下： 0131 1） 用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒， 用0.1%升汞消毒12分钟， 然后用无菌 水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在第一 培养基 （染色体加倍诱导培养基） 上； 0132 2)让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件： 温度250C。
47、， 白天光照16小时， 光照 强度2000勒克斯， 晚上暗培养8小时,待长到12片真叶时， 将植株从下胚轴剪下继续在第 二培养基上生长； 0133 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养； 0134 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗3天后， 取出植株将 植株上的培养基冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中， 温室温度250C， 相对湿度60%， 能保证移栽成活率在95%以上； 0135 上述的第一培养基由以下配比的组分组成： 0136MS 培养基 1L 0137 6苄基腺嘌呤 （6BA） 0.5mg 0138 秋水仙素 。