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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510660378.9 (22)申请日 2015.10.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105165434 A (43)申请公布日 2015.12.23 (73)专利权人 广西壮族自治区农业科学院植物 保护研究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学 东路174号 (72)发明人 陆秀红 刘志明 黄金玲 张禹 黄婧 高淋淋 (74)专利代理机构 深圳市科吉华烽知识产权事 务所(普通合伙) 44248 代理人 胡吉科 (51)Int.Cl. A0。
2、1G 7/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102187774 A,2011.09.21,权利要求1. CN 101496481 A,2009.08.05,全文. CN 101999287 A,2011.04.06,全文. 陆秀红等. 番茄种质材料对南方根结线虫 的抗性鉴定及Mi-1基因检测 . 西南农业学报 .2013,第26卷(第1期),第163-165页. 李戌清. 番茄根结线虫研究进展 . 浙江农 业学报 .2012,第24卷(第4期),第748-752页. 审查员 宋慧娟 (54)发明名称 一种番茄苗期根结线虫病抗性鉴定方法 (57)摘要 本发明提供一种番茄苗期根结线虫。
3、病抗性 鉴定方法， 包括以下几个步骤： 步骤A： 材料准备： 步骤B:抗性鉴定:将番茄苗移至玻璃瓶中， 向玻 璃瓶内注入营养液， 接种根结线虫二龄幼虫,将 玻璃瓶放置人工气候箱进行培养， 记录根结及卵 囊产生的时间。 步骤C:抗性评价:接种根结线虫 二龄幼虫后， 观察根结线虫发育进程， 当侵染已 知感病番茄品种的根结线虫完成一个世代时将 待抗性评价的番茄品种取出调查根结病级， 按根 结病级计算根结指数， 根据根结指数进行品种的 抗感特性评价。 本方法可以对整个抗性鉴定过程 进行可视观察， 一旦侵染已知感病材料的根结线 虫完成一个世代立刻进行抗性评价。 权利要求书2页 说明书5页 CN 1051。
4、65434 B 2018.05.25 CN 105165434 B 1.一种番茄苗期根结线虫病抗性鉴定方法， 其特征在于， 包括以下几个步骤： 步骤A： 材料准备： 步骤1.制备霍格兰营养液； 步骤2.番茄材料： 将待抗性评价的番茄品种播种在无病的育苗盆中， 待苗长到4-5片真 叶时将番茄苗拔出用清水将根部冲洗干净后用于抗性鉴定实验； 步骤3.根结线虫二龄幼虫： 取形成大量根结及卵囊的植物根部在清水中冲洗， 洗去表 面的杂质； 然后将洗干净的植物根放于烧杯中， 加次氯酸钠并用玻璃棒迅速搅拌， 使其混合 均匀； 之后过筛， 反复多次冲洗后取过目筛， 即获得有大量卵粒的悬浮液； 再将该悬浮液缓 缓。
5、倒入孵化筛中孵化获取根结线虫二龄幼虫； 步骤B:抗性鉴定:分别将待抗性鉴定番茄品种即红吉星、 Bss368、 FLA653-3-1-0、 感性 对照大明星和抗病对照仙客1号， 即携带Mi抗病基因苗移至玻璃瓶中， 向玻璃瓶内注入营养 液， 接种根结线虫二龄幼虫,将玻璃瓶放置人工气候箱进行培养， 记录根结及卵囊产生的时 间； 步骤C:抗性评价:接种根结线虫二龄幼虫后， 观察根结线虫发育进程， 当侵染已知感病 番茄品种的根结线虫完成一个世代时将待抗性评价的番茄品种取出调查根结病级， 按根结 病级计算根结指数， 根据根结指数进行品种的抗感特性评价； 番茄品种根结线虫病抗性水 平按照以下标准进行确定： 。
6、根结分级标准： 0级： 无根结； 1级： 有根结根数占整个根系的5以下； 2级： 有根结根数占整个根系的525； 3级： 有根结根数占整个根系的2650； 4级： 有根结根数占整个根系的5175； 5级： 有根结根数占整个根系的76以上； 公式为： 抗性分级标准， 以根结指数为依据， 分为5个等级： 免疫： 根结指数为0； 高抗： 根结指数为1.010.0； 抗病： 根结指数为10.125.0； 感病： 根结指数为25.140.0； 高感： 根结指数为40.0以上； 所述步骤1中， 营养液配方由A液、 B液、 C铁盐溶液和D微量 无素液组成， A液为： 四水硝酸钙900-1000mg/L、 硝。
7、酸钾450-550mg/L、 硝酸铵70-90mg/L； B液 为： 磷酸二氢钾120-150mg/L、 七水硫酸镁450-550mg/L； C铁盐溶液为： 七水硫酸亚铁5-6mg/ L、 乙二胺四乙酸二钠6-8mg/L； D微量元素液为： 碘化钾0.002-0.005mg/L、 硼酸0.02- 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105165434 B 2 0.04mg/L、 硫酸锰0.1-0.2mg/L、 硫酸锌0.03-0.05mg/L、 钼酸钠0.0005-0.001mg/L、 硫酸铜 0.005-0.03mg/L； 所述步骤3中， 次氯酸钠的质量浓度为5-10。 2.如权利要求。
8、1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤3中， 过筛步骤分别过180目、 350目、 500目的筛。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤B中， 人工气候箱进行培养的培养条 件为： 温度： 25， 湿度： 75， 光照级数： 2级普光， 光照时间： 12h。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤B中， 玻璃瓶高9.5cm,直径 5.5cm。 5.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤B中， 玻璃瓶内注入营养液180mL/ 瓶， 玻璃瓶中的根结线虫二龄幼虫采用2000条/瓶。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105165434 B 3 一种番茄苗。
9、期根结线虫病抗性鉴定方法 技术领域 0001 本发明属于农业植保领域， 具体涉及一种番茄苗期根结线虫病抗性鉴定方法。 背景技术 0002 根结线虫(Meloidogyne spp .)引起的番茄根结线虫病是番茄(Solanum lycopersicum)的重要病害之一。 番茄受侵染后根系形成大量根结， 轻病株地上部分症状不 明显， 重病株发育不良， 矮小畸形， 结果少或不结果， 严重时整株枯死， 对番茄生产造成极大 损失。 选育和推广抗病品种是防治该病最经济有效的方法， 而植株的抗病性鉴定是抗病育 种研究的前提和基础。 目前番茄抗根结线虫病鉴定主要采用以下两种方法： 病土直接接种 鉴定方法， 。
10、将待鉴定植株种植在已发病的田块或装有病土的盆中， 一定时间(一般为50天左 右)后拔起植株观察根系发病情况进行根结分级， 计算根结指数评价植株的抗性水平， 该方 法发病条件更接近田间的自然发病条件且简单易行， 不用准备大量二龄幼虫， 缺点是较为 粗放病土的二龄幼虫和卵块没精确定量无法准确评价植株抗性； 二龄幼虫接种鉴定法， 将 鉴定植株种植在装有已消毒土壤或机质的盆中后接种二龄幼虫， 一定时间后观察发病情 况， 该方法需消毒土壤或机质费工费时。 两种方法均存在无法对线虫的繁殖进程和植株的 抗性水平进行可视观察， 导致抗性鉴定时间过长的缺点。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种番茄苗期根。
11、结线虫病抗性鉴定方法， 包括以下几个步 骤： 0004 步骤A： 材料准备： 0005 步骤1.制备霍格兰营养液； 0006 步骤2.番茄材料： 将待抗性评价的番茄品种播种在无病的育苗盆中， 待苗长到4-5 片真叶时将番茄苗拔出用清水将根部冲洗干净后用于抗性鉴定实验； 0007 步骤3.根结线虫二龄幼虫： 取形成大量根结及卵囊的植物根部在清水中冲洗， 洗 去表面的杂质； 然后将洗干净的植物根放于烧杯中， 加次氯酸钠并用玻璃棒迅速搅拌， 使其 混合均匀。 之后过筛， 反复多次冲洗后取过目筛， 即获得有大量卵粒的悬浮液； 再将该悬浮 液缓缓倒入孵化筛中孵化获取根结线虫二龄幼虫。 0008 步骤B:。
12、抗性鉴定:将番茄苗移至玻璃瓶中， 向玻璃瓶内注入营养液， 接种根结线虫 二龄幼虫,将玻璃瓶放置人工气候箱进行培养， 记录根结及卵囊产生的时间。 0009 步骤C:抗性评价:接种根结线虫二龄幼虫后， 观察根结线虫发育进程， 当侵染已知 感病番茄品种的根结线虫完成一个世代时将待抗性评价的番茄品种取出调查根结病级， 按 根结病级计算根结指数， 根据根结指数进行品种的抗感特性评价。 番茄品种根结线虫病抗 性水平按照以下标准进行确定： 0010 根结分级标准： 0011 0级： 无根结； 说 明 书 1/5 页 4 CN 105165434 B 4 0012 1级： 有根结根数占整个根系的5以下； 00。
13、13 2级： 有根结根数占整个根系的525； 0014 3级： 有根结根数占整个根系的2650； 0015 4级： 有根结根数占整个根系的5175； 0016 5级： 有根结根数占整个根系的76以上。 0017 公式为： 0018 0019 抗性分级标准， 以根结指数为依据， 分为5个等级： 0020 免疫： 根结指数为0； 0021 高抗： 根结指数为1.010.0； 0022 抗病： 根结指数为10.125.0； 0023 感病： 根结指数为25.140.0； 0024 高感： 根结指数为40.0以上。 0025 优选的， 所述步骤1中， 营养液配方由A液、 B液、 C铁盐溶液和D微量无素。
14、液组成， A液 为： 四水硝酸钙900-1000mg/L、 硝酸钾450-550mg/L、 硝酸铵70-90mg/L； B液为： 磷酸二氢钾 120-150mg/L、 七水硫酸镁450-550mg/L； C铁盐溶液为： 七水硫酸亚铁5-6mg/L、 乙二胺四乙 酸二钠6-8mg/L； D微量无素液为： 碘化钾0.002-0.005mg/L、 硼酸0.02-0.04mg/L、 硫酸锰 0.1-0.2mg/L、 硫酸锌0.03-0.05mg/L、 钼酸钠0.0005-0.001mg/L、 硫酸铜0.005-0.03mg/L。 0026 优选的， 营养液配方由A液、 B液、 C铁盐溶液和D微量元素液。
15、组成， A液为： 四水硝酸 钙945mg/L、 硝酸钾506mg/L、 硝酸铵80mg/L； B液为： 磷酸二氢钾136mg/L、 七水硫酸镁493mg/ L； C铁盐溶液为： 七水硫酸亚铁5.56mg/L、 乙二胺四乙酸二钠7.46mg/L； D微量元素液为： 碘 化钾0.004mg/L、 硼酸0.031mg/L、 硫酸锰0.112mg/L、 硫酸锌0.043mg/L、 钼酸钠0.001mg/L、 硫酸铜0.025mg/L。 0027 优选的， 所述步骤3中， 次氯酸钠的质量浓度为5-10。 0028 优选的， 所述步骤3中， 过筛步骤分别过180目、 350目、 500目的筛。 0029 。
16、优选的， 所述步骤B中， 人工气候箱进行培养的培养条件为： 温度： 25， 湿度： 75， 光照级数： 2级普光， 光照时间： 12h。 0030 优选的， 所述步骤B中， 玻璃瓶高9.5cm,直经5.5cm。 0031 优选的， 所述步骤B中， 玻璃瓶内注入营养液180mL/瓶， 玻璃瓶中的根结线虫二龄 幼虫采用2000-3000条/瓶。 0032 本发明的有益效果是： 该方法可以对整个抗性鉴定过程进行可视观察， 一旦侵染 已知感病材料的根结线虫完成一个世代立刻进行抗性评价； 解决番茄抗根结线虫鉴定中无 法对线虫的繁殖进程和植株的抗性进行可视观察， 无法快速精确分析评价植株抗感特性的 缺点。。
17、 具体实施方式 说 明 书 2/5 页 5 CN 105165434 B 5 0033 下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明： 0034 实施例1 0035 本发明采用的抗性鉴定方法， 以液体营养液为基础， 人工气候箱为条件， 具体方法 如下： 0036 材料准备 0037 A、 液体营养液： 采用霍格兰营养液， 各组份比例进行相应调整确保对线虫存活率 无影响。 营养液配方： A液(四水硝酸钙945mg/L、 硝酸钾506mg/L、 硝酸铵80mg/L)； B液(磷酸 二氢钾136mg/L、 七水硫酸镁493mg/L)； C铁盐溶液(七水硫酸亚铁5.56mg/L、 乙二胺四乙酸 二钠7。
18、.46mg/L)； D微量无素液(碘化钾0.004mg/L、 硼酸0.031mg/L、 硫酸锰0.112mg/L、 硫酸 锌0.043mg/L、 钼酸钠0.001mg/L、 硫酸铜0.025mg/L)。 0038 B、 番茄材料： 将待抗性评价的番茄品种播种在无病的育苗盆中， 待苗长到4-5片真 叶时将番茄苗拔出用清水将根部冲洗干净后用于抗性鉴定实验； 0039 C、 根结线虫二龄幼虫： 取形成大量根结及卵囊的植物根部在清水中轻轻地冲洗， 洗去表面的杂质。 然后将洗干净的植物根放于烧杯中加约200mL(浸没根部)的质量浓度 50次氯酸钠并用玻璃棒迅速搅拌约半分钟， 使其混合均匀。 之后分别过1。
19、80目、 350目、 500 目的筛子， 反复多次冲洗后取过500目筛的液体即能获得有大量卵粒的悬浮液。 将获得的大 量卵粒悬浮液缓缓倒入孵化筛中孵化获取根结线虫二龄幼虫。 0040 抗性鉴定 0041 分别将待抗性鉴定番茄品种(红吉星、 Bss368、 FLA653-3-1-0)、 感性对照大明星和 抗病对照仙客1号(携带Mi抗病基因)苗移至高9.5cm,直经5.5cm的玻璃瓶中， 每瓶4-6株， 每 个品种4瓶重复； 玻璃瓶内注入营养液180mL/瓶。 以2000-3000条/瓶接种根结线虫二龄幼 虫。 将玻璃瓶放置人工气候箱进行培养(培养条件： 温度： 25， 湿度： 75， 光照级数：。
20、 2级普 光， 光照时间： 12h)， 记录根结及卵囊产生的时间。 0042 抗性评价 0043 接种根结线虫二龄幼虫后， 观察根结线虫发育进程， 当侵染已知感病番茄品种的 根结线虫完成一个世代时将待抗性评价的番茄品种取出调查根结病级， 按根结病级计算根 结指数， 根据根结指数进行品种的抗感特性评价。 番茄品种根结线虫病抗性水平按照以下 标准进行确定： 0044 根结分级标准： 0045 0级： 无根结； 0046 1级： 有根结根数占整个根系的5以下； 0047 2级： 有根结根数占整个根系的525； 0048 3级： 有根结根数占整个根系的2650； 0049 4级： 有根结根数占整个根系。
21、的5175； 0050 5级： 有根结根数占整个根系的76以上。 0051 说 明 书 3/5 页 6 CN 105165434 B 6 0052 抗性分级标准， 以根结指数为依据， 分为5个等级： 0053 免疫： 根结指数为0； 0054 高抗： 根结指数为1.010.0； 0055 抗病： 根结指数为10.125.0； 0056 感病： 根结指数为25.140.0； 0057 高感： 根结指数为40.0以上。 0058 表1 三个番茄品种对根结线虫抗性鉴定结果 0059 Table1 Identification of tomato resistant to root-knot nema。
22、tode 0060 0061 结果与分析： 接种根结线虫二龄幼虫置于25人工气候箱中培养21天后调查各番 茄品种根结病级数， 各番茄品种供试的24株番茄苗根结病级存在一定差异， 其中感病对照 大明星根结病级分别为5级2株、 4级11株、 3级11株； 抗病对照仙客1号根结病级分别为1级1 株、 0级23株； 红吉星根结病级分别为5级1株、 4级1株、 3级22株； Bss368根结病级分别为1级3 株、 0级21株； FLA653-3-1-0根结病级分别为3级1株， 1级23株。 根据根结指数计算公式计算 各番茄品种的根结指数进行抗性评价结果如表1， 试验结果表明供试的三个番茄品种对根 结线虫。
23、的抗性有一定的差异， 其中感病对照大明星及抗性对照仙客1号的根结指数分别为 72.50和4.17， 抗性级别分别为高感和高抗； 红吉星的根结指数分别为62.50， 抗性级别为高 感； Bss368根结指数为12.50， 抗性级别为抗病； FLA653-3-1-0的根结指数为36.11， 抗性级 别为感病。 0062 下面为本鉴定方法与盆栽接种2龄幼虫鉴定法的比较 0063 盆栽接种2龄幼虫鉴定法 0064 与本发明鉴定方法的不同点： 抗性鉴定阶段待鉴定番茄苗移栽至直径20cm、 高 12cm的花盆中， 花盆内装已清除根结线虫的土壤， 每盆种4-6株， 每种材料4盆重复； 每盆接 虫量2000-。
24、3000条， 接虫后21天调查根结病级计算根结指数。 0065 表2 三个番茄品种对根结线虫抗性鉴定结果 说 明 书 4/5 页 7 CN 105165434 B 7 0066 0067 结果与分析： 接种根结线虫二龄幼虫置于25人工气候箱中培养21天后调查各番 茄品种根结病级数， 各番茄品种供试的16株番茄苗根结病级存在一定差异， 其中感病对照 大明星根结病级分别为5级2株、 4级13株、 3级1株； 抗病对照仙客1号根结病级分别为1级1 株、 0级15株； 红吉星根结病级分别为4级2株、 3级12株、 2级2株； Bss368根结病级分别为1级2 株、 0级14株； FLA653-3-1-。
25、0根结病级分别为3级1株、 2级1株、 1级14株。 根据根结指数计算公 式计算各番茄品种的根结指数进行抗性评价结果如表1， 试验结果表明供试的三个番茄品 种对根结线虫的抗性有一定的差异， 从表2看， 感病对照大明星及抗性对照仙客1号的根结 指数分别为81.25和6.25， 抗性级别分别为高感和高抗； 红吉星的根结指数分别为75.00， 抗 性级别为高感； Bss368根结指数为12.50， 抗性级别为抗病； FLA653-3-1-0的根结指数为 39.58， 抗性级别为感病。 0068 从实验结果来看， 本鉴定方法结果与盆栽接种2龄幼虫鉴定法结果基体吻合， 供试 的各番茄品种根结指数普遍较盆栽接种2龄幼虫鉴定法低， 原因可能是病土更适合于线虫 的繁殖及植株发病。 0069 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在 不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的 保护范围。 说 明 书 5/5 页 8 CN 105165434 B 8 。