一种黑腹果蝇GMRSNAIL细胞死亡模型的建立方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810054001.2 (22)申请日 2018.01.19 (71)申请人 华北理工大学 地址 063210 河北省唐山市曹妃甸区曹妃 甸新城渤海大道21号 (72)发明人 吴晨曦 喇孝瑾 江春花 高秀娟 白素芬 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 李明 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) (54)发明名称 一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建 立方法 (57)摘要 本发明公开一种。

2、果蝇GMRSnail细胞死亡模 型的建立方法， 将基因型为+;GMR-Gal4W/SM6B- TM6B.Tb的GMR-Gal4果蝇品系与基因型为w1118; UAS-Snail74b的UAS-Snail74b果蝇品系进行杂交， 选择正常， 非短粗的后代基因型为UAS-Snail74b/ +;GMR-Gal4W/+的果蝇， 即为GMRSnail细胞死亡 模型。 本发明所构建的黑腹果蝇GMRSnail细胞 死亡模型， 可以用于涵盖果蝇全基因组的RNA干 扰 （RNAi） 品系库的大规模遗传筛选， 以期寻找介 导Snail诱导的细胞死亡的全新调控因子。 这有 助于研究者进一步了解发育过程中不同细胞因。

3、 子或信号通路的相互作用， 构建和完善调控细胞 死亡的信号转导网络， 为癌症等疾病的防治提供 新的药物靶点和治疗方案。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 108271741 A 2018.07.13 CN 108271741 A 1.一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 其特征在于： 采用特定的果蝇品 系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型， 具体包括以下步骤： （1） 将基因型为+;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的 GMR-Gal4果蝇品系与基因型为w1118; UAS-Snail74b的UAS-Snail74b果蝇品系进行杂交。

4、， 选择正常， 非短粗， 红色小眼的后代基因型 为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的果蝇， 即为GMRSnail细胞死亡模型； （2） 为了进一步传代和保存该模型， 将得到的基因型为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的 雌性果蝇与基因型为Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb 的雄性果蝇品系进行杂交， 引入平衡子， 在后代 中选择小眼、 卷翅、 短粗， 基因型为UAS-Snail74b;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的果蝇， 建立细 胞死亡模型的保存品系。 2.根据权利要求1所述的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 其特征在于： 。

5、步骤 （1） 中所述的GMR-Gal4果蝇品系与UAS-Snail74b果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组 合均可。 3.根据权利要求1所述的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 其特征在于： 所述培养过程中所用的培养基的配方为红糖135g， 琼脂7g， 玉米粉85g， 酵母8g， 丙酸4ml和 水1000ml。 4.根据权利要求1所述的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 其特征在于： 所述培养的条件为： 温度2030恒温， 湿度50%-60%； 优选为温度25恒温， 湿度50%-60%。 5.根据权利要求1所述的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 其特征。

6、在于： 步骤 （1） 和步骤 （2） 将不同果蝇品系进行杂交的过程为： 将果蝇麻醉后， 在通有CO2的平板上 进行挑选雌雄、 杂交和观察表型的操作； 做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇； 所述处 女蝇选取方法为将原种瓶中的成虫全部清除， 此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇即为处 女蝇。 6.权利要求15中任一所述的方法在构建黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型中的应用。 7.权利要求15中任一所述的方法构建的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108271741 A 2 一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法 技术领域 0001 本发明。

7、属于生物遗传学技术领域， 具体涉及一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模 型的建立方法。 背景技术 0002 果蝇遗传学操作系统， 有Gal4/UAS双表达系统。 Gal4/UAS双表达系统： Gal4/UAS系统是 果蝇中最为常用的转基因技术体系， 可以让外源基因或RNAi在特定细胞或组织选择性表 达。 半乳糖调节上游启动子元件 （galactose-regulated upstream promoter element 4） ， 缩写Gal4， 是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。 上游激活序列UAS （upstream activate sequense） ， 是酵母中另一。

8、种类似高等真核生物增强子的序列。 Gal4 通过与UAS相结合， 调节与半乳糖代谢相关基因的表达。 1993年， 科学家将目的基因X连接在 UAS之后， 通过转基因技术建立UAS-X果蝇品系， 然后与特定的Gal4果蝇品系杂交， 在后代中 就可以得到同时具有Y-Gal4和UAS-X的果蝇， 从而实现特异性的在Y组织表达X基因 （参考文 献1， Brand A. H. and Perrimon N., Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Dev。

9、elopment, 1993, 118: 401-15） 。 因为果蝇基因组不编码Gal4转录因子， 所以在果蝇体内过量表达Gal4， 不会 对果蝇的发育产生显著的影响。 同样， 在果蝇体内插入UAS调控序列， 也不会对果蝇产生影 响。 这个系统的建立为利用果蝇作为研究模型的科学家在实验设计上提供了有利、 便捷、 高 效的遗传操作工具。 Gal4/UAS双表达系统示意图如图1所示。 0003 果蝇作为研究人类疾病的模式生物, 与哺乳动物不仅在基本的生物学、 生理学和 神经系统机能等方面比较相似, 而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。 近年来的研究表 明, 果蝇和人类在肿瘤发生信号通路等方面的保。

10、守性很高, 而且果蝇具有很强的遗传学 可操作性, 是肿瘤学研究有效的模型之一, 可用于研究人类肿瘤发生、 发展、 转移等分子 机制。 近年来研究人员已经建立了很多用于研究特定的果蝇模型， 但是新的特定的果蝇模 型的建立对阐明疾病发生的分子机制起到重要作用， 将会为更多疾病的临床治疗提供新的 药物靶点和治疗方案。 因此， 建立新的特定的果蝇模型是本领域技术人员亟待解决的技术 问题。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法及其应用。 0005 本发明的另一目的在于提供上述方法建立的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型。 0006 本发明的目的可以。

11、通过以下技术方案实现： 一种黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立方法， 采用特定的果蝇品系进行杂交后 培养并筛选获得黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型， 具体包括以下步骤： 说 明 书 1/5 页 3 CN 108271741 A 3 （1） 将基因型为+;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的GMR-Gal4果蝇品系与基因型为w1118; UAS-Snail74b的UAS-Snail74b果蝇品系进行杂交， 选择正常， 非短粗、 红色小眼的后代基因型 为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的果蝇， 即为GMRSnail细胞死亡模型； （2） 为了进一步传代和保。

12、存该模型， 将得到的基因型为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的 雌性果蝇与基因型为Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb 的雄性果蝇品系进行杂交， 引入平衡子， 在后代 中选择小眼、 卷翅、 短粗， 基因型为UAS-Snail74b;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的果蝇， 建立细 胞死亡模型的保存品系。 0007 步骤 （1） 中所述的GMR-Gal4果蝇品系与UAS-Snail74b果蝇品系进行杂交时亲本雌 雄任意组合均可。 0008 所述培养过程中所用的培养基的配方为红糖135g， 琼脂7g， 玉米粉85g， 酵母8g， 丙 酸4ml和水1000ml。 00。

13、09 所述培养的条件为： 温度2030恒温， 湿度50%-60%； 优选为温度25恒温， 湿度 50%-60%。 0010 步骤 （1） 和步骤 （2） 将不同果蝇品系进行杂交的过程为： 将果蝇麻醉后， 在通有CO2 的平板上进行挑选雌雄、 杂交和观察表型的操作； 做杂交实验前必需收集未交配过的处女 蝇； 所述处女蝇选取方法为将原种瓶中的成虫全部清除， 此后每隔8小时收集刚羽化的雌果 蝇即为处女蝇。 0011 上述的方法在构建黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型中的应用。 0012 上述方法构建的黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型。 0013 本发明的有益效果： 本发明所构建的黑腹果蝇GMR。

14、Snail细胞死亡模型， 可以用于涵盖果蝇全基因组的RNA 干扰 （RNAi） 品系库的大规模遗传筛选， 以期寻找介导Snail诱导的细胞死亡的全新调控因 子。 这有助于研究者进一步了解发育过程中不同细胞因子或信号通路的相互作用， 构建和 完善调控细胞死亡的信号转导网络， 为癌症等疾病的防治提供新的药物靶点和治疗方案。 附图说明 0014 图1为Gal4/UAS双表达系统示意图。 0015 图2为果蝇雌雄辨别示意图。 0016 图3为果蝇杂交流程示意图。 0017 图4为上调Snail的表达可以诱导果蝇眼睛发育过程的细胞凋亡。 0018 其中， 图A， 图B为通过Acridine Orange。

15、 (AO) 染色检测到大量的细胞死亡； 图C 为图A， B中AO染色标记的细胞死亡数量的统计图； 图D， 图E为在果蝇成体中观察到细胞死亡 导致的小眼表型； 图F， G为小眼表型可以被表达两个不同来源的snail的RNA干扰 （RNAi， 下 调snail） 几乎完全抑制， 说明这一细胞死亡的眼睛表型确实是由过表达Snail引起的。 0019 图5 dFoxO调控了Snail诱导的细胞死亡。 0020 其中， 图A为单独GMR-Gal4的成虫果蝇眼睛， 此处作为正常组的对照； 图B为GMR- Gal4驱动UAS-Snail过表达的成虫果蝇眼睛， 即GMRSnail的小眼模型； 图C， D为GM。

16、RSnail 的细胞死亡小眼模型可以分别表达dFoxO的RNAi或移除一份内源性的dFoxO明显抑制， 说明 说 明 书 2/5 页 4 CN 108271741 A 4 dFoxO参与调控了Snail诱导的细胞死亡。 具体实施方式 0021 实施例1 建立黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型 一、 果蝇的饲养及实验条件 （一） 果蝇培养基的配制 实验用的果蝇品系及杂交实验均将果蝇饲养于标准的红糖-玉米粉-酵母培养基上， 其 中培养基的配方如下： 红糖135g， 琼脂7g， 玉米粉85g， 酵母8g， 丙酸4ml和水1000ml。 0022 配制过程：（1） 将称量好的红糖和琼脂一起倒入电饭锅。

17、中， 加入适量水， 充分搅拌； （2） 加热至沸腾；（3） 将已用水充分溶解好的玉米粉缓慢倒入锅中， 持续搅拌；（4） 加热至沸 腾；（5） 待混合物冷却至80左右， 加入提前用温水溶解好的酵母， 充分搅拌；（6） 加入适量 丙酸溶液， 充分搅拌；（7） 将培养基分装于灭菌的玻璃管中；（8） 塞上棉花后， 置于阴凉处存 放。 0023 （二） 实验条件 温度25恒温， 湿度50%-60%， 一般饲养于25恒温恒湿的培养箱或果蝇房中。 0024 （三） 果蝇雌雄的鉴别 （1） 体型： 雌果蝇体型较大， 雄的较小。（2） 腹部末端： 雌果蝇腹部椭圆末端稍尖， 雄果蝇 末端钝圆。（3） 腹部背面： 。

18、雌果蝇有明显5条黑色条纹， 雄果蝇的有3条， 前2条细， 后1条宽， 至 腹面， 肉眼可见腹部末端有一明显黑点。（4） 腹部腹面： 雌果蝇有较明显的6个腹片， 雄果蝇 有4个腹片。（5） 性梳： 雄果蝇第一节足底侧最上部附足前端表面有黑色鬃毛性梳。（6） 交 尾器： 判断雌雄果蝇的最主要的区别。 果蝇雌雄辨别示意图如图2所示。 0025 （四） 果蝇的麻醉及杂交 果蝇的麻醉方法是二氧化碳 (CO2) 气体麻醉法。 用作杂交实验的亲本果蝇， 不能过度 麻醉， 否则会影响果蝇的生活力。 果蝇的麻醉状态和麻醉后死亡的区别以翅膀是否外展为 依据。 麻醉状态的果蝇两个翅膀仍然重叠在背腹上， 而死亡的果蝇。

19、翅膀离开腹部呈外展状 态。 0026 将果蝇置于通有CO2的平板上， 3-5秒可将果蝇麻醉。 待果蝇麻醉后， 依照雌果蝇和 雄果蝇外观表型的不同， 分别收集未交配的雌性处女蝇和健康的雄性果蝇， 按照杂交实验 流程， 将杂交需要的亲本 （雌蝇和雄蝇） 进行组合后， 置于同一果蝇管内 （已添加新鲜的培养 基） 饲养， 收集后代， 并观察杂交目标后代的表型。 0027 由于雌果蝇生殖器官中有储精囊， 一次交配后可储存大量精子， 供多次排卵受精 用， 因此做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇， 否则实验结果是不可靠的。 选取方法： 将原种瓶中的成虫全部清除， 此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇， 放入培。

20、养瓶中备用。 由 于刚羽化的果蝇， 其身体细长而幼嫩得几乎透明， 从腹部的腹面透过几丁质的外壳， 可以看 到腹腔内的黑色消化道。 因此， 可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。 0028 二、 黑腹果蝇GMRSnail细胞死亡模型的建立 1、 建立模型所需果蝇品系 1）GMR-Gal4， 位于果蝇第三号染色体上， 该品系果蝇眼睛为红色， 不能纯合， 具体基因 说 明 书 3/5 页 5 CN 108271741 A 5 型为： +;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb， 订购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技 术平台。 0029 2）UAS-Snail74b， 为野生型Sna。

21、il， 位于果蝇第二号染色体上， 该品系果蝇眼睛为黄 色， 可以纯合， 具体基因型为：w1118;UAS-Snail74b， 订购于中科院上海生科院生化与细胞所 果蝇资源与技术平台。 0030 3）UAS-snail-IR V ， 位于果蝇第三号染色体上， 可以纯合， 订购于Vienna Drosophila RNAi Center， 编号： V6232。 0031 4）UAS-snail-IRB， 位于果蝇第三号染色体上， 可以纯合， 订购于美国Indiana大学 的Bloomington Drosophila Stock Center， 编号： BL28679。 0032 5）w1118,。

22、 位于果蝇X染色体上， 订购于清华大学果蝇中心， 编号： THJ0265。 0033 6） Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb， 果蝇二号三号染色体相连接的工具果蝇， 订购于中科院 上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。 0034 2、 结果基因型如下 图4A：GMR-Gal4W/+ 图4B：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+ 图4D：GMR-Gal4W/+ 图4E：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+ 图4F：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/UAS-snail-IRV 图4G：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/UAS-。

23、snail-IRB 3、 实验方法 （1） 将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交， 果蝇杂交流程见 图3， 详细步骤如下： a. 模型建立 选取基因型为+;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的GMR-Gal4果蝇品系， 分别于w1118和UAS- Snail74b（基因型为w1118;UAS-Snail74b） 的果蝇品系进行杂交， 此杂交的亲本雌雄可互换； 其 中w1118组为对照组，UAS-Snail74b组为模型组， 杂交的培养基中可添加适量酵母颗粒， 有利 于雌果蝇大量产卵， 以便收集后代； 杂交应温度25恒温， 湿度50%-60%的培养箱中； 对照组 中，。

24、 选取体型正常 （非卷翅， 非短粗） 、 红色大眼的杂交后代 （基因型为：GMR-Gal4W/+） 为对 照， 模型组中， 选取体型正常、 红色小眼的杂交后代 （基因型为：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/ +） ， 即为GMRSnail细胞死亡模型。 0035 b. 模型保存 由于在基因型为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的果蝇后代中， 配对的染色体之间会发 生同源染色体重组， 导致我们所得到的细胞死亡模型不能传代保存。 为了解决这一问题， 我 们使用工具果蝇Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb品系， 引入平衡子 （Balancer） ， 避免同源染色体重。

25、组 的发生。 具体操作方法： 将基因型为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的雌性处女蝇与Sp;Sb/ SM6B-TM6B.Tb品系的雄性果蝇进行杂交， 在杂交后代中选取小眼、 卷翅、 身体短粗的果蝇， 即得到了基因型为UAS-Snail74b;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的模型保存品系。 0036 c. 模型验证 为了进一步验证我们得到的UAS-Snail74b;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的细胞死亡模型 说 明 书 4/5 页 6 CN 108271741 A 6 保存品系确实是因为Snail蛋白的过量表达激发的， 我们在GMRSnail的细。

26、胞死亡小眼模型 的基础上通过表达snail的RNAi下调snail， 发现小眼表型确实被抑制， 进一步验证了我们 建立的模型。 具体操作方法： 基因型为UAS-Snail74b;GMR-Gal4W/SM6B-TM6B.Tb的模型保存 品系分别于两个snail的RNAi品系进行杂交， 在后代选取体型正常、 非短粗的果蝇， 基因型 分别为：UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/UAS-snail-IRV和UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/UAS- snail-IRB， 将得到的目标果蝇的眼睛与基因型为UAS-Snail74b/+;GMR-Gal4W/+的眼睛进行 对比，。

27、 观察果蝇眼睛大小有无改变。 0037 （2） 收集杂交后代的目标果蝇， 置于-20冷冻处死， 对成虫果蝇眼睛的拍照， 用于 拍照的体式显微镜为日本Olympus-BX51显微镜。 0038 （3） 收集杂交后代的目标果蝇， 对其三龄幼虫期的眼成虫盘 （eye discs） 进行解 剖， 固定剂固定后用于AO染色， 并拍照解剖。 0039 （4） AO染色： 吖啶橙 (Acridine Orange， AO) 是一种荧光染料， 它能够嵌入到单链 的DNA或者RNA上并发出荧光。 凋亡或死的细胞中DNA会发生断裂， 使AO能够嵌入到核中的 DNA上， 因此AO染色被应用于检测细胞死亡 （参考文献。

28、2， Abrams J . M., White K ., Fessler L. I., et al., Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development, 1993, 117: 29-43） 。 0040 AO试剂配制： 将AO粉末溶解于灭菌的ddH2O水中， 配置浓度110-3M， 作为母液， 保 存于4。 0041 果蝇眼成虫盘AO染色步骤如下： （1） 将解剖好的组织加入到含有110-6 M AO的1PBS溶液中； （2） 室温避光染色5分钟； （3） 用PBS漂洗3次； （4） 光学显微镜下， 在载玻片。

29、上迅速解剖分离出所需组织； （5） 制片并用荧光显微镜， 选择相应通道进行拍照并保存。 0042 4模型简介 利用GMR-Gal4在黑腹果蝇眼部特异性地过表达转录因子Snail （UAS-Snail74b） ， 可以在 三龄幼虫期眼成虫盘形态发生沟 (Morphogenetic furrow， MF) 后部区域中， 通过 Acridine Orange (AO) 染色检测到大量的细胞死亡 (图4A， B) ， 图4C为图4A， B中AO染色 标记的细胞死亡数量的统计图。 0043 同时我们可以在果蝇成体中观察到细胞死亡导致的小眼表型 （图4D， E） ， 且这一小 眼表型可以被表达两个不同来源。

30、的snail的RNAi （下调snail） 几乎完全抑制 （图4F， G） ， 说明 这一细胞死亡的眼睛表型确实是由过表达Snail引起的。GMRSnail细胞死亡模型因此成功 建立。 如图4为上调Snail的表达可以诱导果蝇眼睛发育过程的细胞凋亡。 0044 GMRSnail细胞死亡模型， 可以用于涵盖果蝇全基因组的RNA干扰 （RNAi） 品系库的 大规模遗传筛选， 以期寻找介导Snail诱导的细胞死亡的全新调控因子。 这有助于研究者进 一步了解发育过程中不同细胞因子或信号通路的相互作用， 构建和完善调控细胞死亡的信 号转导网络， 为癌症等疾病的防治提供新的药物靶点和治疗方案。 例如： 通过遗传筛选， 我 们发现GMRSnail的小眼表型可以被表达转录因子dFoxO的RNAi或缺失一份内源性的dFoxO 部分抑制 （图5） ， 说明dFoxO调控了Snail诱导的细胞死亡。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108271741 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 108271741 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 108271741 A 9 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 108271741 A 10 。