技术领域
本发明涉及鸡蛋的孵化工艺，具体涉及提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工艺。
背景技术
鸡胚蛋是受精鸡蛋经特殊孵化工艺，使胚胎不断生长发育，具有生命力的鸡蛋，又称之为“活珠子”、“毛蛋”等。实际上鸡胚蛋就是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳，可食用的鸡蛋。《本草纲目》记载：“鸡胚蛋有治头痛、偏头痛、头疯病及四肢疯瘴之功能”。童叟弱者常食之，有健脾胃作用，遂而起到强身健体之功效。鸡胚蛋味道鲜美，功效神奇，民间早有食用习惯，并作为营养、进补和治病的佳品，广为流传。
现代医学研究证明，鸡胚蛋所含成分大体上可分为三类，即营养成分、抗感染成分和生物活性物质。营养成分有蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素和矿物质等；抗感染成分有球蛋白、干扰素、溶菌酶和磷酸二酯酶；生物活性物质有免疫球蛋白、唾液酸等。免疫球蛋白，尤其是鸡蛋黄免疫球蛋白IgY，具有抗体活性，参与人体营养代谢和生理调节功能，能排除人体毒素，防御和杀死进入人体的细菌和病毒，具有抗疲劳和提高免疫力的作用。在鸡胚生长发育过程中，IgY的含量会逐渐增加，一般情况下，在孵化期的第10～19天内维持在一个较高水平，通常比鲜鸡蛋提高50％，鲜鸡蛋中IgY的含量为8～10mg/ml。因此，在孵化期的第10～19天内突然中断孵化，得到的胚蛋中IgY含量最高，具有较高的抗疲劳和提高免疫力的功效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种进一步提高蛋黄免疫球蛋白(IgY)含量的提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工艺。
本发明提供的技术方案是一种提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工艺，将受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化10～19天，在孵化期，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射总时间为2～5min，辐射剂量率为20～30GY/min。
在整个孵化期间，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射总时间为2～5min，辐射剂量率为20～30GY/min。受精种蛋为鸡受精种蛋，在鸡胚蛋在孵育期，进行低剂量的60Coγ射线辐射，可以刺激淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖，促进细胞分化，提高免疫球蛋白的合成。
在整个孵化期间，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射总时间为2～5min，辐射剂量率为20～30GY/min。其中，可以在孵化期的第4～5天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1～1.5min,,辐射剂量率为20～25GY/min，剩余辐射剂量和辐射时间可以在孵化期内任意时间内进行。
鸡胚蛋在孵育期的第4～5天，腔上囊出现上皮细胞团的原基，继之原基发育出粘膜腔，此时是腔上囊的发育的第一个高峰期，在这个时候对鸡蛋进行60Coγ射线辐射，可以刺激上皮细胞的分化，而上皮细胞可以大量分化产生淋巴细胞，而淋巴细胞又能分化产生免疫球蛋白，从而为免疫球蛋白的合成提供了前提。
在整个孵化期间，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射总时间为2～5min，辐射剂量率为20～30GY/min。其中，可以在孵化期的第4～5天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1～1.5min,,辐射剂量率为20～25GY/min；进一步地，还可以在孵化期的第12～13天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1～3.5min,辐射剂量率为25～30GY/min。
鸡胚蛋在孵育期的第12～13天，腔上囊的粘膜上皮出现上皮芽的芽状突起，上皮芽不断分化、长大，逐渐深入粘膜上皮下的固有膜中，同时，淋巴细胞在芽体中和芽体周围的组织中出现，最后形成滤泡。滤泡形成的同时，粘膜上皮也随之分化成连滤泡上皮和滤泡间上皮。此时是腔上囊发育的第二个高峰期，腔上囊粘膜层固有膜中有大量淋巴上皮滤泡和与此相关的粘膜上皮的分化，淋巴上皮滤泡的顶部朝向粘膜腔，在固有膜中紧密排成层；滤泡由皮质和髓质组成，中央为髓质，皮质套在髓质外。髓质来源于粘膜上皮，多凸起的网状上皮细胞构成网状支架，网眼中填充着淋巴细胞、巨噬细胞和少量浆细胞、粒细胞。此时对其进行第二次60Coγ射线辐射可以刺激网眼中淋巴细胞和单核巨噬细胞的增殖，促进细胞分化，从而产生大量的免疫球蛋白。
孵化期间，控制孵化温度为37.5～38.5℃，湿度为50～60％。
受精种蛋孵化14～19天为宜，因为孵育期第12-13天时，大量的巨噬细胞和淋巴细胞生成，从而产生大量的免疫球蛋白。
与现有技术相比，本发明的孵化工艺可以大大提高胚蛋中免疫球蛋白的含量，尤其是蛋黄免疫球蛋白的含量，从而大大提升了胚蛋的抗疲劳和提高免疫力的功效，十分具有商业价值。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化10天，控制孵化温度为37.5℃，湿度为50％；在孵化期的第1天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射2min，辐射剂量率为20GY/min。
实施例2
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡鸡受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化15天，控制孵化温度为38.5℃，湿度为60％；在孵化期的第10天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射5min，辐射剂量率为30GY/min。
实施例3
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化19天，控制孵化温度为38℃，湿度为55％；在孵化期的第19天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射3min，辐射剂量率为25GY/min。
实施例4
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化19天，控制孵化温度为38℃，湿度为55％；在孵化期的第4天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1min,辐射剂量率为20GY/min。在孵化期的第19天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射3min,辐射剂量率为20GY/min。
实施例5
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化19天，控制孵化温度为38℃，湿度为55％；在孵化期的第4天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1.5min,辐射剂量率为25GY/min。在孵化期的第19天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射3.5min,辐射剂量率为30GY/min。
实施例6
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化19天，控制孵化温度为38℃，湿度为55％；在孵化期的第5天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射1min,辐射剂量率为25GY/min。在孵化期的第13天，对受精种蛋进行60Coγ射线辐射3.5min,辐射剂量率为30GY/min。
对照例
将商品代尼克珊瑚粉蛋鸡的受精种蛋送入孵化器中，在黑暗条件下孵化孵化19天，控制孵化温度为38℃，湿度为55％。
取实施例1～6和对照例的胚蛋各10枚，去壳，逐一检测每枚胚蛋中IgY的含量，具体结果见下表：
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
为检测本申请的胚蛋提高免疫力的效果，对小鼠进行免疫试验，详情如下：
1、试验方法
将实施例1～6以及对照例的鸡胚进行预煮，煮制，去壳，绞碎，烘干，粉碎过筛加生理盐水分别配制成浓度为1.2g/kg的胚蛋混悬液。
免疫试验：将2月龄SPF级KM雌性小白鼠56只，随机分为7组，分别为试验组1～6和对照组，每组8只。试验组1～6的每只小鼠分别灌喂0.4ml实施例1～6的胚蛋制成的胚蛋混悬液，对照组的每只小鼠灌胃0.4ml对照例的胚蛋制成胚蛋混悬液。小鼠自由采食、饮水，饲养过程中，每天换水，隔日换垫料。每日灌胃一次，连续灌胃30d。
2、试剂配制
鸡红细胞CRBC)悬液：新鲜抗凝鸡血，置2500r/min离心5min，弃上层血浆和白细胞层，用生理盐水稀释红细胞8倍，轻轻混合洗涤，吸弃上清液，反复洗涤，至上清液无色，以除去血浆蛋白的蛋白细胞，最后一次尽量吸弃生理盐水，即为压积红细胞，根据所需浓度，用生理盐水稀释鸡红细胞即可。
绵羊红细胞(SRBC)悬液：绵羊静脉取血，将羊血放入玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用。
补体：采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心去上清，分装，-70℃保存。用时以SA缓冲液按1：10稀释。
Hank’s液：NaCl 8g、KCl 0.4g、Na2HPO4·12H2O 0.152g、KH2PO4 0.06g、酚红(0.005g，先用NaHCO3溶液溶解)用蒸馏水定容至1000ml，用NaHCO3溶液调节PH值7.2～7.4，高温灭菌。
3、脾脏指数的测定
试验结束后小鼠禁食12h称重，取小鼠脾脏称重，按下式计算脾脏指数：脾脏指数＝脾脏重/体重；
4、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定
小鼠巨噬细胞的激活：试验前4d给每只小鼠腹腔注射2％压积绵羊红细胞0.2ml。
巨噬细胞的孵育：用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加入小牛血清的Hank’s液4ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹腔剪开一个小口，吸取腹腔洗液0.5ml与0.5ml 1％CRBC悬液混合，取0.5ml混合液，低于载玻片的琼脂圈内，放置孵化器内孵育15min。
染色：孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min，用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40倍显微镜计数，并按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100％
吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞
5、血清溶血素(IgM)测定
免疫动物：将压积SRBC用生理盐水配成2％的细胞悬液，每只小鼠付清注射0.2ml进行免疫。免疫7d后摘除眼球取血置于离心管，放置约1h,将凝固血瘀管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。取血清10μl，用生理盐水稀释100倍。稀释血清1ml与0.5ml 5％CRBC\0.5ml 10％补体混合，在37℃下保温30min，冰水浴上终止反应。离心取上清液，在540nm波长处比色，以不加血清的空白作为对照。
6、对小鼠游泳时间的影响
末次灌胃30min后，将尾根部负荷5％(体重)铅皮的小鼠置游泳箱(50cm×50cm×40cm)中游泳，水温25℃±1.0℃，记录小鼠自游泳开始至死亡时间，即小鼠负重游泳时间(min)。
7、试验结果
1)鸡胚蛋对小鼠脾脏指数的影响(x±s)
组别 脾脏指数(mg/g) 对照组 3.6134±0.6465 试验1组 5.5261±0.6338* 试验2组 5.4285±0.2334* 试验3组 5.5282±0.4965* 试验4组 6.0921±0.7335** 试验5组 6.0295±0.9591* 试验6组 6.6134±0.3579*
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
组别 吞噬率 吞噬指数 对照组 43.50±3.70 0.64±0.07 试验1组 59.75±2.84* 0.81±0.17* 试验2组 60.75±4.5** 0.82±0.02* 试验3组 58.00±3.74* 0.80±0.03* 试验4组 65.50±4.43* 0.85±0.06** 试验5组 65.16±1.73* 0.84±0.08* 试验6组 70.25±5.31** 0.89±0.05*
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
3)对小鼠血清溶血素生成的影响
鸡红细胞CRBC)悬液：新鲜抗凝鸡血，置2500r/min离心5min，弃上层血浆和白细胞层，用生理盐水稀释红细胞8倍，轻轻混合洗涤，吸弃上清液，反复洗涤，至上清液无色，以除去血浆蛋白的蛋白细胞，最后一次尽量吸弃生理盐水，即为压积红细胞，根据所需浓度，用生理盐水稀释鸡红细胞即可。
对CRBC免疫小鼠，使其淋巴细胞产生特异性抗CRBC抗体，并释放至外周血，含抗体的血清与CRBC一起孵育时，在补体参与下产生溶血并释放出血红蛋白，溶液呈红色，测定溶液的吸收值，计算半数溶血值HC50，反映IgM抗体水平。
组别 半数溶血值HC50 对照组 428.91±36.43 试验1组 585.35±61.40* 试验2组 576.71±27.89* 试验3组 568.16±26.94* 试验4组 594.98±79.24** 试验5组 599.60±19.17* 试验6组 609.42±94.18*
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
4)对小鼠游泳时间的影响
组别 时间(min) 对照组 7.67±0.35 试验1组 16.65±1.42 试验2组 16.72±2.01 试验3组 16.49±1.31 试验4组 18.35±2.43 试验5组 18.26±3.16 试验6组 19.47±1.43
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
为检测本申请的胚蛋抗疲劳的效果，对小鼠进行抗疲劳试验，详情如下：
1、试验方法
将实施例1～6以及对照例的鸡胚进行预煮，煮制，去壳，绞碎，烘干，粉碎过筛加生理盐水分别配制成浓度为1.2g/kg的胚蛋混悬液。
SPF级昆明种雄性小白鼠210只，体重20g±2g，小白鼠预饲一周后，随机分为7组，分别为试验组1～6和对照组，每组30只。试验组1～6的每只小鼠分别灌喂0.4ml实施例1～6的胚蛋制成的胚蛋混悬液，对照组的每只小鼠灌胃0.4ml对照例的胚蛋制成胚蛋混悬液。小鼠自由采食、饮水，饲养过程中，每天换水，隔日换垫料。每日灌胃一次，连续灌胃30d。
2、负重游泳试验
末次灌胃30min后，将尾根部负荷5％(体重)铅皮的小鼠置游泳箱(50cm×50cm×40cm)中游泳，水温25℃±1.0℃，记录小鼠自游泳开始至沉下水8s不浮起，即小鼠游泳时间(min)。逐只记录运动开始至力竭时间，作为小鼠游泳时间，小鼠力竭后，迅速将其捞出水池，于保温箱内用吹风筒吹干放入笼中正常饲养。
3、血尿素氮BUN乳酸脱氢酶LDH的测定
末次灌胃30min后，在水温30℃±1.0℃的水中不负重游泳90min，休息60min后眼球采血，分离出血清，全自动生化分析仪测定血清尿素氮含量。末次灌胃30min后，眼球采血，分离出血清，全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶活性。
4、肝糖原HG的测定
1)样品制备
小鼠末次灌胃30min后，在水温30℃±1.0℃的水中游泳90min，立即处死，取肝脏，经审理盐水漂洗后用滤渣吸干，精确称取肝脏越100mg，加入4mlTCA，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000r/min离心15min，将上清液移至另一试管内。在沉淀中再加入TCA，匀浆1min，再离心15min，去上清液，并与第一次离心的上清液合并，充分混匀。
取1ml上清液，放入10ml离心管中，每管加入95％乙醇4ml，充分混匀至两种液体间不留界面。用干净塞子塞上，室温下竖直放置过夜。沉淀完全后，经试管于3000r/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min.
用2ml蒸馏水溶解糖原，加水时管壁的糖原洗下。
试剂空白：吸2ml蒸馏水到干净离心管。
标准管：吸0.5ml葡萄糖标准液和1.5ml蒸馏水放入同一管中。
2)样品糖原含量测定
72％H2SO4：烧杯中加入280ml蒸馏水，再加入浓硫酸720ml。
蒽酮试剂：H2SO4中放入500mg蒽酮，10g高纯度的硫脲，适当晃动烧杯混匀。冷却后放入冰箱备用。
将10ml蒽酮试剂加入样品试管，充分混匀。从试管注入蒽酮试剂时起，将试管放在冷水龙头下冲凉。在所有试管都达到凉水温度后，将其浸入沸水浴15min，然后移到冷水浴，冷却到室温。将管内液体移入比色管，在620nm波长下用试剂空白管调零后测定吸光度。根据所称取的肝脏的质量换算成糖原含量。
3)糖原含量计算
肝组织中糖原含量(mg/100g)＝A1/A2×0.5×8/0.1×100×0.9；
式中A1，A2：分别代表样品管吸光度和标准管吸光度；
0.5：0.5ml葡萄糖标准液中的葡萄糖含量；
0.9：将葡萄糖换算成糖原的系数；
8：提取液体积，ml；
0.1：肝组织克数，g。
6、血乳酸(LD)的测定
末次灌胃30min后，负重2％(体重)在温度30℃±1.0℃的水中游泳30min后停止，安静15min后眼球采血，分离出血清，严格按照试剂盒说明操作测定吸光度，计算血乳酸含量。
6、试验结果
1)鸡胚对小鼠游泳时间的影响
组别 游泳时间(min) 对照组 12.52±1.06 试验1组 25.30±3.07* 试验2组 23.08±2.43* 试验3组 26.52±3.50* 试验4组 30.42±2.50** 试验5组 31.95±6.60* 试验6组 35.15±2.82*
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2)对小鼠血尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)的影响
机体血尿素氮含量随着劳动及运动负荷的增加而增加，机体对负荷适应能力越差，血尿素氮增加越明显。
组别 BUN(mmol/L) LDH(U/L) 对照组 9.37±1.08 1877.67±134.03 试验1组 6.98±0.58* 2302.33±147.00 试验2组 6.89±0.95* 2377.50±89.80* 试验3组 6.78±0.47* 2351.33±250.86* 试验4组 6.45±0.68* 2495.00±104.65* 试验5组 6.52±0.78** 2405.00±89.10* 试验6组 6.11±0.78* 2485.00±81.17*
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
3)对小鼠肝糖原(HG)含量的影响
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
4)对小鼠血乳酸(LD)含量的影响
血乳酸含量的变化说明在无氧条件下体内的糖酵解的程度，是评价抗疲劳常用的生化指标。
组别 LD(mmol/L) 对照组 10.18±1.48 试验1组 7.98±0.77* 试验2组 7.56±1.00* 试验3组 7.73±0.66* 试验4组 6.59±0.84* 试验5组 6.20±0.45* 试验6组 6.01±0.22**
注：与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。