技术领域
本发明涉及植物农药技术，更具体地说，是涉及一种抑杀植物病原真菌的植物提 取物活性成分及其制备方法与应用。
背景技术
在化学合成农药使用之前，最早的农药有很多是从植物中提取出来的，有些植物 的天然活性物质已被开发成商品杀虫剂，如鱼藤酮、烟碱等。但自20世纪40年代以 来，有机化学合成农药纷纷代替了植物性农药而雄居市场，致使植物源农药的研究一 度陷入低谷。目前在中国使用的农药80％以上为化学制剂，这些化学农药对减少植物 病虫害，提高作物产量起到了重要的作用，但同时也带来了环境污染、残毒危害、病 菌产生抗药性、人畜安全受到威胁等一系列问题，给人们的健康带来隐患。因此开发 生物活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的天然活性物质已成为农药发展的新 趋势，植物源农药的开发又成为了研究的热点，如公告号为CN1218645C的专利申请 就公开了一种由百部、南鹤虱、苦楝皮、使君子、苦参、艾叶的抽提物与乳化剂、松 节油和乙醇制成的中草药杀虫灭菌剂。李敬武等用山苍籽油配制成乳剂，对茶树主要 病害茶红锈病、茶黄萎病、茶云纹叶枯病和棉花枯萎病、黄萎病等进行防治，取得了 较好的防治效果。但现今登记的植物源农药几乎都是杀虫剂，抑杀植物病原真菌的制 剂产品却甚少，而在农业生产中，植物病原真菌对植物的危害极大，是农业增产、农 民增收的障碍，因此，人们迫切需要提供更多品种的能有效抑杀植物病原真菌，且环 境友好能保障人畜安全的农药制剂产品，以促进农民增收。
发明内容
针对现有的植物源抑杀植物病原真菌制剂品种甚少的现状，本发明目的旨在提供一 种可用于制备抑杀植物病原真菌的新制剂，且制剂生物活性高、对非靶标生物安全、 环境相容性好的郁金活性成分，以及该活性成分的制备方法与应用。
本发明提供的抑杀植物病原真菌的郁金活性成分，为以乙醇或甲醇为萃取溶剂萃 取郁金得到的提取物。作为抑杀植物病原真菌活性成分的提取物，可以是以乙醇或甲 醇为萃取溶剂萃取郁金得到的总提取物，也可以是以正己烷为萃取溶剂对以乙醇或甲 醇为萃取溶剂萃取郁金得到的总提取物进一步萃取得到的精提取物。总提取物和精提 取物都可用于制备抑杀植物病原真菌制剂的活性成分，优先选用精提取物作为制备抑 杀植物病原真菌制剂的活性成分，特别是选用萃取溶剂萃取郁金得到的提取物经进一 步浓缩处理得到的膏状提取物。
在上述方案中，用乙醇或甲醇作为萃取溶剂萃取郁金所得到的提取物，对植物病 原真菌的抑杀都有很好的活性，也就是说，既可以选用乙醇作为萃取溶剂，也可以选 用甲醇作为萃取溶剂，选用乙醇作萃取溶剂效果更好，优先选用体积分数不低于75％ 的乙醇，尤其是优先选用体积分数为90％～98％的乙醇。
本发明揭示的抑杀植物病原真菌的郁金活性成分，可由包括以下步骤的方法来制 备：
(1)将干燥粉碎的郁金根状茎或块根用乙醇或甲醇浸提12～24h，然后在45～ 55℃的条件下水浴搅拌提取6～12h，使郁金中的活性成分充分浸出，收集浸提液。
(2)将收集到的浸提液浓缩，得到郁金总提物，并回收作为溶剂的乙醇或甲醇。
上述得到的郁金总提物，还可进一步用正己烷萃取，得到郁金精提取物。萃取得 到的郁金总提取物与精提取物，可进一步浓缩为膏状提取物，作为抑杀植物病原真菌 制剂的活性成分。膏状提取物可以用丙酮溶解后直接用于制备抑杀植物病原真菌的制 剂。
本发明揭示的抑杀植物病原真菌的郁金活性成分，可用于制备抑杀植物病原真菌 和蘑菇病原真菌制剂，特别是用于制备抑杀山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、 轮枝孢子菌、小麦赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄榄绿霉或苍白青霉等制剂，作为制剂的 活性成分。
本发明揭示的抑杀植物病原真菌的郁金活性成分，可制备成水剂、可溶性粉剂、 可湿性粉剂、浓悬剂和粒剂等剂型的植物病原真菌抑杀制剂。各种剂型的制备方法为 本领域的常规方法，各剂型制备过程中所用助剂为农药领域中的常用助剂。各剂型在 使用时所配制的溶液，其中郁金提取物的浓度应在0.1mg/ml～1000mg/ml的范围。
郁金中抑菌活性成分还可以进一步采用植物化学的方法进行分离和鉴定，以发现 新的具有杀菌和抑菌活性的化合物，并且可以在此基础上，以该化合物结构为模板， 进行分子结构改造，开发成新的抑杀真菌制剂品种。
本发明提供的郁金提取物对山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、轮枝孢子 菌、小麦赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄榄绿霉或苍白青霉等具有明显的活性，且由于郁 金原料来源广泛，对人体无毒，对作物无害，作为植物源抑杀真菌制剂有易降解的特 点，因此有望开发为一种无公害的植物源抑杀真菌制剂。
具体实施方式
以下通过实施例描述本发明的具体实施方式，对本发明的内容再作进一步的详细 说明。但不应将此理解为本发明的保护范围仅限于实例，相反地，凡基于本发明的内 容所实现的技术应用均属于本发明的保护范围。
以下实施例使用的是购自四川崇州产的郁金。活性测定是在离体的条件下，采用 生长速率法测定所制备样品对病原真菌的抑菌活性，供试菌种为山葵墨入菌(Phoma wasabiae Yokogi)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary)、番茄灰霉病 菌(Botrytis Cirerea)、轮枝孢子菌(Verticillium dahliae Kled)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、食用菌疣孢霉(Mycogone peniciosa)、橄榄绿霉(Chaetomium olivaceum Cooket Ell)或苍白青霉(penicillium pallidum Smith)，分别由四川省农业厅植检站、 中国科学院成都生物研究所提供。
实施例1郁金提取物的制备及抑菌活性测定
制备郁金提取物的步骤：
(1)将干燥郁金根状茎(或块根)粉碎后过40目筛，得到郁金干粉。
(2)取相当于原料质量约7倍(一般控制范围为5～10倍)体积的95％的乙醇在 室温(温度一般在18～24℃范围)下浸提约20h(一般控制范围为12～24h)。
(3)在约50℃(一般控制范围为45～60℃)恒温水浴中连续搅拌提取约10h(一 般控制范围为6～12h)。用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液①。
(4)将残渣再用相当于原料质量约6倍(一般控制范围为5～10倍)体积的95％ 的乙醇进一步搅拌提取8h(一般控制范围为6～12h)，使郁金中的活性成分充分提出， 用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液②。
(5)合并滤液①和滤液②，滤液用旋转蒸发仪在约55℃(一般控制范围为45～ 60℃)水浴下浓缩，得到浸提浓缩膏，4℃保存。
(6)取少量郁金总提物，清水配置成浓度为0.05g·ml-1溶液作为实验备用样品。
上述提取溶剂也可为甲醇。
生物活性的测定：在离体条件下，采用菌丝生长速率法测定郁金提取物的抑菌活 性。分别取实验备用样品(质量浓度为0.05g·ml-1)配制培养基，制成5个浓度梯度， 即2.5mg·ml-1、2.0mg·ml-1、1.0mg·ml-1、0.5mg·ml-1、0.25mg·ml-1。待平板凝固后 在平皿中央接入已培养好的、生长一致的山葵墨入菌菌饼(d＝6.0mm)。每皿接一个 菌饼，以加入无菌水培养基接种后作为空白对照(CK)，每个处理设3个重复，26℃ 下恒温培养箱中培养，至对照培养皿菌落即将长满培养皿时记录数据。每个菌落按照 十字交叉法测量两次，以平均数代表其菌落的大小，抑菌率的计算公式如下：
菌落直径(mm)＝菌落平均直径-菌饼直径(6.0mm)
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)÷对照菌落直径×100％
实验结果如表1所示。
表1郁金提取浸膏对墨入菌的抑制效果 提取溶剂 Extraction solvent 抑菌率(％) Inhibition rate 毒力回归方程(Y＝) Toxicity regression equatioin 相关系数 R2 EC50 mg·ml-1 甲醇 乙醇 65.29 67.08 1.3371x+5.2326 1.2923x+5.3148 0.9622 0.9781 0.6699 0.5707
注：抑菌率为药液浓度在1.0mg·ml-1时测定
由表1可以看出，郁金甲醇、乙醇提取物对山葵墨入菌表现出较强的抑菌活性， 其抑制中浓度即EC50分别为0.6699mg·ml-1、0.5707mg·ml-1。
实施例2郁金乙醇总提物、正己烷萃取物对病原菌孢子萌发的影响
(1)供试菌种：山葵墨入菌、橄榄绿霉、苍白青霉、轮枝孢子菌。
(2)采用凹玻片法：取配制的含药孢子悬浮液(药液的终浓度为10mg·ml-1)和空 白对照、丙酮对照的孢子悬浮液各100μl滴加在凹玻片上，放入已灭菌的培养皿中， 置于26℃培养箱中培养，药液处理和对照组均设4个重复。12小时后检查孢子萌发情 况。镜检10个视野，每一处理大约观察200个孢子，计算孢子萌发率。当孢子芽管长 度超过孢子直径长度的一半(最小直径)，作为已经萌发的孢子，计算公式如下：
孢子萌发率＝萌发孢子数÷检查孢子数×100％
孢子萌发抑制率＝(对照萌发率-处理萌发率)÷对照萌发率×100％
实验结果如表2所示。
表2郁金提取物对病原菌孢子萌发抑制作用 病原菌 Pathogeny 乙醇提取物处 理后萌发率％ 乙醇提取物处 理后抑制率％ 正己烷萃取物处 理后萌发率％ 正己烷萃取物处 理后抑制率％ 丙酮对照 萌发率％ 空白对照萌 发率％ 墨入菌 橄榄绿霉 苍白青霉 轮枝孢子 菌 8.8 9.5 7.9 7.1 90.5 90.2 91.7 92.5 2.6 3.1 3.3 2.5 97.1 96.7 96.5 97.4 90.1 94.0 93.6 94.5 93.0 96.5 94.7 94.2
由表2可以看出，在供试质量浓度为10mg/ml时，郁金乙醇粗提物对供试病原 菌孢子萌发抑制率均＞90％，正己烷萃取物对孢子萌发抑制率均＞96％。说明郁金 的乙醇粗膏、正己烷萃取浸膏对病原菌孢子萌发均有较强的抑制能力。
实施例3郁金正己烷萃取物的制备和生物活性测定。
(1)郁金乙醇总提物用8倍体积正己烷萃取分离得到正己烷萃取液，萃取液用旋 转蒸发仪浓缩，浓缩温度为40℃左右，得到膏状萃取物。
(2)上述萃取膏状物用丙酮溶液配置成浓度为0.05g·ml-1药液作为实验备用样品。 以山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、轮枝孢子菌、小麦赤霉菌、食用菌疣孢 霉、橄榄绿霉、苍白青霉为供试菌种，测定不同药液浓度下的抑菌活性，抑菌活性测 定方法同实施例1。
实验结果如表3所示。
表3郁金正己烷萃取物对8种病原菌菌丝生长的抑制作用 病原菌 Pathogeny 抑菌率(％) Inhibition rate 毒力回归方程(Y＝) Toxicity regression equatioinpic 相关系数 R2 EC50 mg·ml-1 山葵墨入菌 小麦赤霉菌 油菜菌核菌 橄榄绿霉 苍白青霉 食用菌疣孢霉 番茄灰霉菌 轮枝孢子菌 79.70 76.82 86.58 54.78 74.85 71.72 100 78.19 1.5427x+5.7430 1.1319x+5.6782 1.6137x+5.8899 1.3975x+5.0791 1.2270x+5.7781 2.1487x+5.3058 2.9576x+7.2392 1.6640x+5.6480 0.9468 0.9248 0.9475 0.9796 0.9561 0.9534 0.9172 0.9559 0.3299 0.2517 0.2809 0.8778 0.2322 0.7206 0.1749 0.4080
注：抑菌率为药液浓度在1.0mg·ml-1时测定
由表3可以看出，郁金乙醇总提物正己烷萃取物对8种病原真菌均具有明显的抑 制效果，其中对番茄灰霉菌的抑制率达到100％，对山葵墨入菌的抑菌率和郁金乙醇总 提物相比有所提高，说明郁金的有效成分存在于正己烷萃取物中。
实施例4最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度MBC的测定
配制马铃薯液体培养基分装于若干试管中，每管4ml，取郁金醇提物正己烷萃取 物配置的母液(浓度0.05g·ml-1)，倍比稀释法配制培养基，使各管含药量依次为25 mg·ml-1、12.5mg·ml-1、6.25mg·ml-1、3.13mg·ml-1、1.56mg·ml-1、0.78mg·ml-1，分别 取调整好浓度的供试菌悬液40μl，加入6支含药管和清水、丙酮分别做阳性对照管，另 外分别以清水、丙酮不接种，作阴性对照。26℃摇床培养48h，以阴性管为对照，若培 养物出现浑浊或底部出现絮状物为生长，即阳性；反之，澄清或无絮状物则为不生长， 即阴性。倍比稀释的各管以无菌生长的郁金丙酮溶解液的最高稀释度作为该受试菌种 的最低抑菌浓度，即为该菌的MIC值。取出真菌不生长的药液培养基涂布到马铃薯培 养基制成的平板上，于26℃培养一周，再观察结果，真菌不生长的最高稀释度为该药 的最低杀菌浓度(MBC)。
实验结果如表4所示。
表4郁金正己烷萃取物的MIC和MBC值 病原菌 Pathogeny MIC(mg·ml-1) MBC(mg·ml-1) 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 1.56 3.13 6.25 12.5 山葵墨入菌 小麦赤霉菌 油菜菌核菌 橄榄绿霉 苍白青霉 食用菌疣孢霉 番茄灰霉菌 轮枝孢子菌 + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + - + - + - - - + - - - - - - - - - - - - + + + + + + - + + + - + - + - + - - - - - - - - - - - - - - - -
注：+：生长 -：不生长
表4可以看出郁金正己烷萃取物对于供试的病原菌均有不同程度的抑制作用， 高浓度药剂对病原菌均具有杀菌能力。