一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102027886 A (43)申请公布日 2011.04.27 CN 102027886 A *CN102027886A* (21)申请号 201110001159.1 (22)申请日 2011.01.05 A01K 61/00(2006.01) A23K 1/18(2006.01) A23K 1/175(2006.01) (71)申请人 苏州大学 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁 爱路 199 号 (72)发明人 叶元土 蔡春芳 张宝彤 向超林 殷永凤 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (54) 发明。

2、名称 一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法 (57) 摘要 本发明属于动物实验模型领域， 涉及一种建 立鱼类脂肪肝实验模型的方法。包括以下步骤 ： 1） 采用腹腔注射的方式， 对草鱼一次性注射硫代 乙酰胺的生理盐水溶液， 注射完毕后进行养殖 ； 所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的 浓度为100200mg/ml ； 2） 养殖过程中， 投喂油脂 总量为 4 6% 的配合饲料， 养殖 2 6 周 ； 由于 本发明对草鱼注射硫代乙酰胺引起草鱼肝胰脏组 织、 细胞损伤， 干扰草鱼的脂质代谢和能量代谢， 同时投喂适当油脂含量的配合饲料， 可以快速地 获得脂肪性肝病的试验草鱼。 (51)Int.Cl。

3、. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102027887 A1/1 页 2 1. 一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 采用腹腔注射的方式， 对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液， 注射完毕后 进行养殖 ； 所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为 100 200mg/ml ； 2） 养殖过程中， 投喂油脂总量为 4 6% 的配合饲料， 养殖 2 6 周 ； 所述配合饲料包 括 ： 鱼粉、 豆粕、 菜籽粕、 棉籽粕、 小麦、 米糠、 米糠粕、 磷酸二氢钙、 沸石粉。

4、、 膨润土、 豆油， 还 包括 ： 维生素和矿物质预混料 ； 所述鱼粉为秘鲁鱼粉 ； 其中， 按照质量百分比， 上述组分的 配比为 ： 秘鲁鱼粉 5 8% ； 豆粕 6 10% ； 菜籽粕 15 20% ； 棉籽粕 15 20% ； 小麦 15 22% ； 米糠 8 10% ； 米糠粕 4 6% ； 磷酸二氢钙 1.8 2% ； 沸石粉 1.5 2% ； 膨润土 1.5 2%， 豆油 2 5% ； 维生素和矿物质预混料 1%。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1）中， 所述草鱼的体重为 50 300g。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 每 1k。

5、g 草鱼注射 250 450mg 硫代乙酰 胺。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 中， 注射前对草鱼进行消毒处理。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 2） 中， 养殖期间水质条件为 ： 水温 20 30、 溶解氧 6.0 mg/L 以上、 pH 值 7.0 7.4、 氨氮含量 0.200.40 mg/L、 亚硝酸盐 氮 0.050.1 mg/L。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 2） 中， 投喂的频率为一天 2 4 次， 每天投喂量为 ： 鱼体体重的 3 4%。 权 利 要 求 书 CN 102027886。

6、 A CN 102027887 A1/4 页 3 一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法 技术领域 0001 本发明属于动物实验模型领域， 涉及一种建立鱼类脂肪肝实验模型的方法。 背景技术 0002 鱼类由饲料原因引起的脂肪性肝病 （fatty liver disease， FLD） 是指以脂肪肝、 脂肪性肝炎、 肝纤维化、 肝功能衰竭等为主要形式的一类疾病， 是影响鱼类生长、 健康以及 鱼产品食用安全的主要疾病。 主要病理特点是肝细胞、 组织脂肪积累特性和肝细胞、 组织的 实质性损伤作用 ； 在发病历程方面也显示出 “脂肪肝肝实质性损伤脂肪性肝炎肝纤 维化肝功能衰竭 （多器官功能障碍综合症） ”。

7、 的基本过程。研究养殖鱼类饲料源性肝病的 发生机制、 发病历程及其影响因素， 研究不同的防治对策， 研究安全的防治药物或功能性饲 料物质等既具有重要的科学基础理论价值， 同时对于合理维护养殖鱼类正常生理健康、 保 障养殖鱼类最大的生长潜力、 保障养殖渔产品的食用安全、 维护养殖生态环境安全等具有 非常重要的意义。 0003 脂肪肝、 肝损伤的实验模型就是为了研究脂肪肝、 肝损伤的发生原因、 阐述其发生 和发展的生物学机制、 研究进行有效防治对策与技术方法等而建立的实验研究模型， 主要 用途有 ： 用于发生和发展机理研究 ； 用于防治药物、 饲料对策的研究。因此， 建立鱼类 脂肪肝、 肝损伤实验。

8、模型的基本目标是研究养殖鱼类脂肪肝的发病原因、 发展历程和发生、 发展的机制需要 ； 也是研究有效预防和治疗脂肪肝病的营养与饲料控制方法 （如饲料安全 控制、 营养素的平衡、 饲料配方的优化等） 、 研究有效的饲料添加物和药物， 阐明饲料物质、 药物的作用机理的需要， 是研究方法方面的重大进步。 0004 鱼类脂肪性肝病研究的最大难点在于 ： 不能在可控条件下、 在较短的时间内、 批量 地、 稳定地复制出脂肪性肝病试验鱼。 鱼类饲料源性脂肪性肝病实验模型在肝损伤机制、 防 治药物的研究具有关键性作用。 0005 鱼类脂肪性肝病实验模型建立的关键是能够在实验条件下， 比较快速、 准确地、 稳 定。

9、地、 批量地复制出脂肪肝、 肝损伤的实验鱼类。 利用鱼类脂肪性肝病实验模型可以研究其 发生和发展的原因、 生物学机制进行科学的实验研究， 阐明其发生和发展基本过程、 基本的 生物学或化学原理和机制 ； 在此基础上， 对防止和治疗研究对象脂肪肝、 肝损伤发生、 发展 的技术方法、 药物等进行研究， 再进行研究对象的活体规模化验证、 临床实验， 实现有效预 防和治疗的目标。 0006 现有技术中， 在人体医学中关于非酒精性脂肪肝的实验模型研究非常多， 包括实 验模型的类型、 造模方法、 检测指标体系、 模型的应用等都有较多的研究， 但是关于鱼类肝 损伤的实验模型的研究还处于起步阶段。 0007 发。

10、明目的 本发明目的是提供一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法。 0008 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立 方法， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 102027886 A CN 102027887 A2/4 页 4 1） 采用腹腔注射的方式， 对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液， 注射完毕后 进行养殖 ； 所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为 100 200mg/ml ； 2） 养殖过程中， 投喂油脂总量为 4 6% 的配合饲料， 养殖 2 6 周， 得到草鱼脂肪性肝 病实验模型 ； 所述配合饲料包括 ： 鱼粉、 豆粕、 菜籽粕、。

11、 棉籽粕、 小麦、 米糠、 米糠粕、 磷酸二 氢钙、 沸石粉、 膨润土、 豆油， 还包括 ： 维生素和矿物质预混料 ； 所述鱼粉为秘鲁鱼粉 ； 其中， 按照质量百分比， 上述组分的配比为 ： 秘鲁鱼粉58% ； 豆粕610% ； 菜籽粕1520% ； 棉 籽粕 15 20% ； 小麦 15 22% ； 米糠 8 10% ； 米糠粕 4 6% ； 磷酸二氢钙 1.8 2% ； 沸石 粉 1.5 2% ； 膨润土 1.5 2%， 豆油 2 5% ； 维生素和矿物质预混料 1%。 0009 上述技术方案中， 步骤 1） 中， 所述草鱼的体重优选为 50 300g， 每一尾草鱼注射 0.2ml 硫代乙。

12、酰胺的生理盐水溶液。 0010 上述技术方案中， 步骤 1） 中， 注射前对草鱼进行消毒处理 ： 用 5（质量百分数） 的食盐水浸泡草鱼 5min， 对鱼消毒， 且使鱼处于轻微的麻醉状态， 便于注射操作 ； 注射方法 是 ： 用纱布包裹草鱼但露出腹部， 以 45 度角度进行腹部注射 ； 注射完毕后草鱼直接放回养 殖桶进行养殖。 0011 上述技术方案中， 步骤 1） 中， 每一尾草鱼注射 0.2ml 硫代乙酰胺的生理盐水溶液， 注射的硫代乙酰胺量为 ： 每 1kg 草鱼注射硫代乙酰胺 250 450mg ； 注射液用 0.22m 过滤 除菌， 4冰箱贮存备用， 保存期不超过 3 天。 0012。

13、 上述技术方案中， 步骤 2） 中所述配合饲料中各组分均为常规饲料原料， 所述维生 素和矿物质预混料含有 13 种维生素， 具体为 VA、 VD3、 VK3 VE、 VB1、 VB2、 VB6、 VB12、 VC、 泛 酸钙、 烟酸、 叶酸和肌醇， 所述维生素和矿物质预混料中的矿物质包括铜 Cu、 锰 Mn、 锌 Zn、 碘 I、 硒 Se、 钴 Co、 镁 Mg、 钾 K ； 所述配合饲料的制作方法为 ： 按照配比， 将秘鲁鱼粉、 豆粕、 菜籽 粕、 棉籽粕、 小麦、 米糠、 米糠粕、 磷酸二氢钙、 沸石粉、 膨润土、 豆油、 维生素和矿物质预混料 粉碎后过 60 目筛， 混合均匀， 使用饲。

14、料制粒机加工成直径 1.5mm 或 2.0mm、 或 2.5mm 不同规 格的颗粒， 颗粒的直径与长度比保持在12左右 ； 冷却、 风干， 双层塑料袋封口包装， 4保 存备用。 0013 上述技术方案中， 步骤 2） 中， 养殖期间水质条件为 ： 水温 20 30、 溶解氧 6.0 mg/L 以上、 pH 值 7.0 7.4、 氨氮含量 0.200.40 mg/L、 亚硝酸盐氮 0.050.1 mg/L。 0014 上述技术方案中， 步骤 2） 中， 投喂的频率为一天 2 4 次， 优选地， 投喂饲料的时 间为 ： 每天 8 ： 00、 12 ： 00、 17 ： 30 各投喂饲料一次， 每天。

15、投喂量为 ： 鱼体体重的 3 4%。 0015 采用上述技术方案养殖 2 6 周的草鱼可以产生明显的脂肪性肝病， 用于不同的 实验需要。 0016 由于上述技术方案运用， 本发明具有下列优点 ： 1、 本发明对草鱼注射硫代乙酰胺引起草鱼肝胰脏组织、 细胞损伤， 干扰草鱼的脂质代 谢和能量代谢， 同时投喂适当油脂含量的配合饲料， 可以快速地获得脂肪性肝病的试验草 鱼。 0017 2、 本发明的技术方案建立模型的时间短， 可以在 2 6 周内得到脂肪性肝病的草 鱼。 0018 3、 本发明的技术方案具有批量建模的规模、 且保持较为稳定的模型草鱼成活率在 68% 以上， 可以获得足够数量的用于不同试。

16、验的脂肪性肝病草鱼。 说 明 书 CN 102027886 A CN 102027887 A3/4 页 5 0019 4、 采用本发明的技术方案建立的草鱼脂肪性肝病实验模型稳定性好、 可重复， 对 于体重在 50 300g/ 尾的草鱼， 采用本发明的方法建模效果最佳。 0020 5、 采用本发明的技术方案建立模型草鱼的主要病理特征是草鱼肝胰脏脂质代谢 功能紊乱 ； 血清 AST/ALT 比值在 2 周就显著性升高、 碱性磷酸酶活力显著性下降， 显示肝胰 脏实质性损伤显著 ； 肝细胞、 肝组织有实质性病理变化 ； 在 4 周以后出现较为明显的肝胰脏 纤维化病变 ； 大量的脂肪在肝胰脏沉积， 肝胰。

17、脏脂肪含量显著性增加、 达到脂肪肝水平。 0021 6、 采用本发明的方法建立的草鱼脂肪性肝病实验模型成模快、 可批量建模、 模型 较为稳定、 可重复， 模型草鱼具备脂肪性肝病特征， 可以用于草鱼脂肪性肝病形成机制、 发 展病理机制的基础研究， 同样适用于防治草鱼脂肪肝、 草鱼肝纤维化、 草鱼肝功能障碍和衰 竭的药物筛选、 饲料添加剂筛选及其作用机制的研究。 附图说明 0022 附图 1 为实施例一中对照组正常草鱼肝胰脏组织切片观察结果 （400） ； 附图 2 为实施例一中模型组草鱼肝胰脏组织切片观察结果 （400） 。 具体实施方式 0023 下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述 ： 。

18、实施例一 ： 1） 选择体重 50 300g/ 尾的试验草鱼， 设立了 3 个试验组， 每组草鱼 30 尾、 每个组设 定 3 个平行， 共 3330=270 尾 ； 同时设立 3 个对照组， 每组草鱼 30 尾、 每个设定 3 个平 行， 共 270 尾 ； 合计试验草鱼 540 尾 ； 根据情况配置硫代乙酰胺浓度为100200mg/ml的硫代乙酰胺生理盐水溶液， 然后用 0.22m 过滤除菌， 4冰箱贮存备用， 保存期不超过 3 天。 0024 向试验组草鱼注射前， 对试验组的草鱼进行消毒处理 ： 用 5的食盐水浸泡草鱼 5min， 对鱼消毒， 且使鱼处于轻微的麻醉状态， 然后一次性注射硫。

19、代乙酰胺的生理盐水溶 液， 每一尾草鱼注射 0.2ml 硫代乙酰胺的生理盐水溶液， 注射的硫代乙酰胺量为 ： 每 1kg 草 鱼注射硫代乙酰胺250450mg ； 注射方法是 ： 用纱布包裹草鱼但露出腹部， 以45度角度进 行腹部注射 ； 注射完毕后草鱼直接放回养殖桶进行养殖。 0025 2） 养殖过程中， 投喂油脂总量为 4 6% 的配合饲料， 养殖 2 6 周 ； 所述配合饲料 包括 ： 鱼粉、 豆粕、 菜籽粕、 棉籽粕、 小麦、 米糠、 米糠粕、 磷酸二氢钙、 沸石粉、 膨润土、 豆油， 还包括 ： 维生素和矿物质预混料 ； 所述鱼粉为秘鲁鱼粉 ； 其中， 按照质量百分比， 上述组分 的。

20、配比为 ： 秘鲁鱼粉 5 8% ； 豆粕 6 10% ； 菜籽粕 15 20% ； 棉籽粕 15 20% ； 小麦 15 22% ； 米糠 8 10% ； 米糠粕 4 6% ； 磷酸二氢钙 1.8 2% ； 沸石粉 1.5 2% ； 膨润土 1.5 2%， 豆油 2 5% ； 维生素和矿物质预混料 1%。 0026 所述配合饲料中各组分均为常规饲料原料， 所述维生素和矿物质预混料含有 13 种维生素， 具体为 VA、 VD3、 VK3 VE、 VB1、 VB2、 VB6、 VB12、 VC、 泛酸钙、 烟酸、 叶酸和肌醇， 所 述维生素和矿物质预混料中的矿物质包括铜 Cu、 锰 Mn、 锌 Z。

21、n、 碘 I、 硒 Se、 钴 Co、 镁 Mg、 钾 K ； 所述配合饲料的制作方法为 ： 按照配比， 将秘鲁鱼粉、 豆粕、 菜籽粕、 棉籽粕、 小麦、 米糠、 米 糠粕、 磷酸二氢钙、 沸石粉、 膨润土、 豆油、 维生素和矿物质预混料粉碎后过 60 目筛， 混合均 说 明 书 CN 102027886 A CN 102027887 A4/4 页 6 匀， 使用饲料制粒机加工成直径1.5mm或2.0mm、 或2.5mm不同规格的颗粒， 颗粒的直径与长 度比保持在 1 2 左右 ； 冷却、 风干， 双层塑料袋封口包装， 4保存备用。 0027 上述技术方案中， 步骤 2） 中， 养殖期间水质条。

22、件为 ： 水温 20 30、 溶解氧 6.0 mg/L 以上、 pH 值 7.0 7.4、 氨氮含量 0.200.40 mg/L、 亚硝酸盐氮 0.050.1 mg/L ； 投喂 饲料的时间为 ： 每天 8 ： 00、 12 ： 00、 17 ： 30 各投喂饲料一次， 投喂量为 ： 鱼体体重的 3 4%。 0028 对照组不注射硫代乙酰胺， 只是投喂所述配合饲料。 0029 在水泥池中设置网箱， 网箱规格为 1.51.51.5m3。每个网箱放养草鱼 30 尾， 共 18 个网箱。试验组和对照组草鱼养殖 4 周， 得到以下结果。 0030 1、 模型组草鱼成活率、 生长速度 （与对照组相比较）。

23、 、 肝胰脏脂肪含量 ： 经过 6 周养 殖试验， 各模型组草鱼的成活率和特定生长率的结果如下表所示， 可见 ： 模型组草鱼特定生 长率降低了 30.5%， 同时草鱼成活率降低了， 但都在 68.0% 以上 ； 模型组草鱼肝胰脏粗脂肪 含量 （湿重的 %） 分别达到 10.31%、 8.37% 和 9.97%， 均超过湿重的 5%（脂肪肝判别标准） ， 显 示出全部出现较为严重的脂肪肝， 达到脂肪肝模型要求 ； 模型组草鱼的肌肉粗脂肪含量显 著降低了 17.6%。 分组成活率 (%)特定生长率 (%/d)肌肉脂肪 %（湿重）肝胰脏脂肪 %（湿重） 对照 1 组 71.675.770.970.0。

24、70.730.083.630.35 对照 2 组 81.6716.071.190.440.780.012.140.09 对照 3 组 85.0013.231.200.150.610.032.840.21 模型 1 组 60.005.000.600.310.570.0310.310.18 模型 2 组 58.332.890.760.040.500.038.370.22 模型 3 组 66.677.640.960.090.680.079.970.10 0031 2、 养殖的 2 周、 4 周和 6 周草鱼血清 AST/ALT 变化 ： 养殖过程中， 各模型组 2 周、 4 周和 6 周 AST/A。

25、LT 如下表所示， 第 2 周模型组的血清 AST/ALT 值高于相应的对照组 ； 随着养 殖期的延长， 各组血清 AST/ALT 值逐渐增大 ； 在 2 周、 4 周和 6 周时， 模型组组血清 AST/ALT 分别为对照组组的 1.94 倍、 1.38 倍和 1.31 倍 ； 结果显示本发明的草鱼脂肪性肝病实验模 型草鱼的肝胰脏受到损伤， 达到模型的要求。 分组2 周 AST/ALT 4 周 AST/ALT 6 周 AST/ALT 对照1组 5.251.238.401.3724.401.82 对照2组 0.760.109.442.0225.312.16 对照3组 1.690.5611.42。

26、2.4922.821.55 模型1组 5.940.8912.201.9137.923.07 模型2组 5.421.0114.802.7226.651.63 模型3组 3.620.7613.290.9430.112.18 0032 3、 血清碱性磷酸酶活力变化 ： AST/ALT 值越大， CHE 越小， 预示着肝脏病变越严重。 与正常对照组比较， 模型组草鱼碱性磷酸酶活力下降了 13.5 15.3%。 0033 4、 草鱼肝胰脏组织切片观察结果 （见附图 1 和图 2） ： 正常对照组草鱼各肝胰脏组 织学切片可见肝细胞排列整齐， 无变性、 坏死及炎性细胞浸润， 而模型组草鱼肝细胞肿胀， 有较明显的脂肪浸润， 并出现肝纤维化， 显示出脂肪肝、 肝纤维病理特征。 说 明 书 CN 102027886 A CN 102027887 A1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102027886 A 。