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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410436524.5 (22)申请日 2014.08.29 (73)专利权人 广西壮族自治区药用植物园 地址 530023 广西壮族自治区南宁市长岗 路189号 (72)发明人 缪剑华 师凤华 谭木秀 蒲祖宁 莫乔程 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 靳浩 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 CN 101455180 A,2009.06.17,全文. CN A 101574055。
2、 A,2009.11.11,全文. CN 102577970 A,2012.07.18,全文. US 58423709 P2,2009.09.02,全文. N. Palacios et alRegeneration of Lonicera tatarica plants via adventitious organogenesis from cultured stem explants. Plant Cell Rep .2002,第20卷第 808-813页. 陈良坚.华南忍冬Lonicera confusa离体快 繁体系的建立. 广东中医药大学硕士学位论 文 .2009,第1-72页， 尤其。
3、是17页第1.2.1.4节. 路俊仙等.忍冬组织培养研究进展. 辽宁中 医药大学学报 .2013,第15卷(第12期),第90-92 页. 陈巧玲等.山银花的离体培养. 2005年全国 植物生长物质研讨会论文摘要汇编 .2005,第 100页. 陈巧玲等.山银花的离体培养. 2005年全国 植物生长物质研讨会论文摘要汇编 .2005,第 100页. 陈少荣等.红腺忍冬的扦插繁殖体系研究. 中国农学通报 .2013,第29卷(第22期),第135- 141页. Nong Yan-Feng et alTissue culture and rapid propagation of L.hypogla。
4、uca. JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE .2013, 第44卷(第5期),第717-721页. 审查员 杜玉娟 (54)发明名称 红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根 诱导的方法 (57)摘要 本发明公开了一种红腺忍冬无菌组培苗叶 柄愈伤组织不定根诱导的方法。 本发明利用植物 细胞的全能性和植物组织培养技术， 以苗龄为 20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植 体， 经过增加伤口处理后， 置于愈伤组织诱导培 养基中， 在适宜的条件下培养， 使其脱分化成愈 伤组织， 进而在愈伤组织生根诱导培养基中培 养 ， 将此愈伤组织诱导出不定根 ， 诱导率达 62.5。
5、0。 本发明简单方便， 在短期内能够快速有 效地将红腺叶柄诱导出愈伤组织， 并将此愈伤组 织诱导出不定根， 为红腺忍冬优良种质保存、 快 速繁育及在研究、 生产中的应用提供了新的技术 参考。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 104170733 B 2016.08.24 CN 104170733 B 1.一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 1)材料准备： 将红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.无菌组培苗接种到壮苗培养基中 壮苗， 得到苗龄为20-30d的无菌组培苗； 2)材料取样： 取苗龄为20-30d的红腺忍冬无。
6、菌组培苗的带有1/4叶片的叶柄待用； 3)愈伤组织不定根的诱导： 将选定待用的带有1/4叶片的叶柄进行增加伤口处理后接 种于愈伤组织诱导培养基中培养， 诱导出叶柄愈伤组织； 再将此叶柄愈伤组织转接至愈伤 组织不定根诱导培养基中， 进而诱导出不定根， 其中愈伤组织培养与不定根诱导培养的培 养温度为(253)， 相对湿度为50-75， 光照为12h/d， 光照强度为2000-3000Lux； 其中， 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.0-2.5mg， 2, 4-二氯苯基氧乙酸0.0-2.5mg、 呋喃氨基嘌呤0.1-1.0mg， -萘乙酸0.0-1.0mg， 其余成分为。
7、 MS培养基； 所述的愈伤组织不定根诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.5- 2.5mg、 呋喃氨基嘌呤0.5-2.5mg、 -萘乙酸0.1-1.0mg， 其余成分为MS培养基。 2.根据权利要求1所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法， 其特 征在于， 所述第1)步， 所述的壮苗培养基为于每升1/2MS培养基中加入 -萘乙酸0.2mg所形 成的培养基， 其中所述的1/2MS培养基是国际通用的MS培养基中大量元素减半， 其他成分不 变而形成的培养基。 3.根据权利要求1所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法， 其特 征在于， 所述第3)步， 所述的进行增。
8、加伤口处理是指用灭过菌的手术剪刀在待用的带有1/4 叶片的叶柄上沿着叶柄上凹陷线剪开以增加伤口面积。 4.根据权利要求1所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法， 其特 征在于， 所述愈伤组织的培养与不定根诱导的培养均在培养室的培养架上光照培养。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104170733 B 2 红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养领域， 具体涉及一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织 不定根诱导的方法。 背景技术 0002 红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)， 为忍冬科忍冬属(Loni。
9、cera)植物， 属多 年生半缠绕藤本或者藤状灌木， 又名盘腺忍冬、 菰腺忍冬、 腺背金银花等， 茎中空， 主要产于 河南、 广西、 山东、 云南等地。 按照2005年版 中国药典 的规定， 红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq .与灰毡毛忍冬Lonicera nuwranthoides Hand .Mazz.和华南忍冬 Lonicera confuse DC.为山银花(我国名贵中药材之一)的三种来源。 其社会需求量大， 产 需供求缺口大， 其药用价值和保健作用足以推动山银花的种植、 加工、 销售等行业的发展及 临床应用研究。 0003 目前关于山银花组织培养的报道较少， 关。
10、于红腺忍冬组织培养研究的报道不多， 而对于红腺忍冬组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的研究尚未有报道。 发明内容 0004 本发明设计开发了一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导方法。 本发 明利用植物细胞的全能性和植物组织培养技术， 以苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的 叶柄作为外植体， 经过增加伤口处理后， 置于愈伤组织诱导培养基中， 在适宜的条件下培 养， 使其脱分化成愈伤组织， 进而在愈伤组织生根诱导培养基中培养， 将此愈伤组织诱导出 不定根， 诱导率达62.50。 本发明简单方便， 在短期内能够快速有效地将红腺叶柄诱导出 愈伤组织， 并将此愈伤组织诱导出不定根， 为红腺忍冬优良。
11、种质保存、 快速繁育及在研究、 生产中的应用提供了新的技术参考。 0005 本发明提供的技术方案为： 0006 红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导方法， 包括： 0007 1)材料准备： 将红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.无菌组培苗接种到壮苗培养 基中壮苗， 得到苗龄为20-30d的无菌组培苗； 0008 2)材料取样： 取苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的带有1/4叶片的叶柄待用； 0009 3)愈伤组织不定根的诱导： 将选定待用的带有1/4叶片的叶柄进行增加伤口处理 后接种于愈伤组织诱导培养基中培养， 诱导出叶柄愈伤组织； 再将此叶柄愈伤组织转接至 愈伤。
12、组织不定根诱导培养基中， 进而诱导出不定根， 其中愈伤组织培养与不定根诱导培养 的培养温度为(253)， 相对湿度为50-75， 光照为12h/d， 光照强度为2000-3000Lux； 0010 优选的是， 所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导方法中， 所述第 1)步， 所述的壮苗培养基为每升1/2MS培养基中加入 -萘乙酸( -NAA)0.2mg所形成的培养 基， 其中所述的1/2MS培养基是国际通用的MS培养基中大量元素减半， 其他成分不变而形成 的培养基。 说 明 书 1/4 页 3 CN 104170733 B 3 0011 优选的是， 所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织。
13、不定根诱导方法中， 所述第 3)步， 所述的进一步处理是指用灭过菌的手术剪刀在待用的带有1/4叶片的叶柄上沿着叶 柄上凹陷线剪开以增加伤口面积。 0012 优选的是， 所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导方法中， 所述第 3)步， 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.0-2.5mg， 2， 4-二氯苯基氧乙酸(2， 4-D)0.0-2.5mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.1-1.0mg， -萘乙酸( -NAA) 0.0-1.0mg， 其余成分为MS培养基。 0013 优选的是， 所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导方法中， 所述第 3)步。
14、， 所述的愈伤组织生根诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5- 2.5mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.5-2.5mg、 -萘乙酸( -NAA)0.1-1.0mg， 其余成分为MS培养基。 0014 优选的是， 所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法中， 所述 愈伤组织培养与不定根诱导培养均是在培养室的培养架上光照培养。 0015 本发明的有益效果在于： 0016 本发明能利用苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体诱导愈伤 组织， 进而促进愈伤组织分化出根， 从叶柄愈伤组织诱导到愈伤组织不定根诱导过程只需 50天， 可以在短期内使红腺忍冬无菌。
15、试管苗的叶柄脱分化成愈伤组织， 并诱导此愈伤组织 生根， 为红腺忍冬种质资源的保存和药材的来源提供新的参考途径， 为更进一步利用该物 种提供了技术参考。 附图说明 0017 图1红腺忍冬叶柄愈伤组织诱导效果图 0018 图2红腺忍冬叶柄愈伤组织生根诱导效果图 具体实施方式 0019 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。 0020 实施例1 0021 以本课题组培育的苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体， 在超 净工作台上剪取附带有1/4叶片的叶柄， 并沿此叶柄上的凹陷线剪开以增加伤口面积。 之后 将此经过处理的叶柄转接入愈。
16、伤组织诱导培养基中， 置于培养室的培养架上光照培养， 培 养10天即可长出米白色愈伤组织； 待此愈伤组织生长健壮之后(一个月)(图1A)， 将其转接 入愈伤组织根诱导培养基中培养， 培养20天之后即可长出不定根。 愈伤组织与愈伤组织不 定根诱导的培养条件为： 培养温度： (253)， 相对湿度： 50-75， 光照12h/d， 光照强度 2000-3000Lux； 培养30天之后(图2A)， 根据公式： 不定根诱导率()(诱导出不定根的叶 柄愈伤组织总个数/接种的叶柄愈伤组织总个数)100， 计算出不定根诱导率达 62.50。 0022 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有2， 4-二氯。
17、苯基氧乙酸(2， 4-D) 2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg， 其余成分为MS培养基； 所述的愈伤组织根诱导培养为每升 培养基中含有含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)2.0mg， -萘乙酸( - 说 明 书 2/4 页 4 CN 104170733 B 4 NAA)0.5mg， 其余成分为MS培养基。 0023 实施例2 0024 以本课题组培育的苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体， 在超 净工作台上剪取附带有1/4叶片的叶柄， 并沿此叶柄上的凹陷线剪开以增加伤口面积。 之后 将此经过处理的叶柄转接入愈伤组织诱导培养基中， 置于培。
18、养室的培养架上光照培养， 培 养10天即可长出米白色愈伤组织； 待此愈伤组织生长健壮之后(一个月)(图1B)， 将之转接 入愈伤组织根诱导培养基中培养， 培养20天之后即可长出健壮的根， 其中愈伤组织与愈伤 组织不定根诱导的培养条件为： 培养温度： (253)， 相对湿度： 50-75， 光照12h/d， 光照 强度2000-3000Lux； 培养30天之后(图2B)， 根据实施例1中所示不定根诱导率计算公式计算 出愈伤组织不定根诱导率为14.29。 0025 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有2， 4-二氯苯基氧乙酸(2， 4-D) 2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg， -。
19、萘乙酸( -NAA)0.2mg， 其余成分为MS培养基； 所述的愈 伤组织根诱导培养为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg， -萘乙酸( -NAA)0.5mg， 其余成分为MS培养基。 0026 实施例3 0027 以本课题组培育的苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体， 在超 净工作台上剪取附带有1/4叶片的叶柄， 并沿此叶柄上的凹陷线剪开以增加伤口面积。 之后 将此经过处理的叶柄转接入愈伤组织诱导培养基中， 置于培养室的培养架上光照培养， 培 养10天即可长出淡绿色愈伤组织； 待此愈伤组织生长健壮之后(一个月)(图1C)。
20、， 将之转接 入根诱导培养基中培养， 其中愈伤组织与愈伤组织不定根诱导的培养条件为： 培养温度： (253)， 相对湿度： 50-75， 光照12h/d， 光照强度2000-3000Lux； 培养30天之后， 愈伤组 织褐化死亡， 根据实施例1中所示不定根诱导率计算公式计算出愈伤根诱导率为0。 0028 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg， 其余成分为MS培养基； 所述的愈伤组织根诱导培养为每升培养基 中含有含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)2.0mg、 -萘乙酸( -NAA) 0.。
21、5mg， 其余成分为MS培养基。 0029 实施例4 0030 以本课题组培育的苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体， 在超 净工作台上剪取附带有1/4叶片的叶柄， 并沿此叶柄上的凹陷线剪开以增加伤口面积。 之后 将此经过处理的叶柄转接入愈伤组织诱导培养基中， 置于培养室的培养架上光照培养， 培 养10天即可长出淡绿色愈伤组织； 待此愈伤组织生长健壮之后(一个月)(图1D)， 将之转接 入根诱导培养基中培养， 其中愈伤组织与愈伤组织不定根诱导的培养条件为： 培养温度： (253)， 相对湿度： 50-75， 光照12h/d， 光照强度2000-3000Lux； 培养30天之后。
22、， 愈伤组 织褐化死亡， 根据实施例1中所示不定根诱导率计算公式计算出愈伤根诱导率为0。 0031 所述的愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg， -萘乙酸( -NAA)0.2mg， 其余成分为MS培养基； 所述的根诱导培 养为每升培养基中含有含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)2.0mg、 -萘 乙酸( -NAA)0.5mg， 其余成分为MS培养基。 0032 本发明能利用苗龄为20-30d的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体诱导愈伤 说 明 书 3/4 页 5 CN 104170733 B 。
23、5 组织， 进而促进愈伤组织分化出根， 从叶柄愈伤组织诱导到愈伤组织不定根诱导过程只需 50天， 当愈伤组织诱导培养基为每升培养基中含有2， 4-二氯苯基氧乙酸(2， 4-D)2.0mg、 呋 喃氨基嘌呤(KT)0.5mg， 其余成分为MS培养基时， 可以在短期内使红腺忍冬无菌组培苗的叶 柄脱分化成愈伤组织， 利用愈伤组织根诱导培养为每升培养基中含有含有6-苄氨基腺嘌呤 (6-BA)2.0mg、 呋喃氨基嘌呤(KT)2.0mg， -萘乙酸( -NAA)0.5mg， 其余成分为MS培养基诱导 此愈伤组织生根， 培养30天之后根诱导率达62.50， 其为红腺忍冬种质资源的保存和药材 的来源提供新的参考途径， 为更进一步利用该物种提供了技术参考。 0033 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104170733 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 104170733 B 7 。