一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制肝癌细胞HEPA16细胞增殖药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103768207 A (43)申请公布日 2014.05.07 CN 103768207 A (21)申请号 201310653940.6 (22)申请日 2013.12.06 A61K 36/752(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 11/14(2006.01) A61P 11/02(2006.01) (71)申请人 济南新起点医药科技有限公司 地址 250001 山东省济南。

2、市市中区 288 号恒 昌大厦 2303 (72)发明人 孙波 (54) 发明名称 一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制肝癌 细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种青 梅感冒片的制备方法及应用。本发明的青梅感冒 片的制备方法， 由青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗梅 267g 作为原料药制成， 采用超临界萃取和微波萃 取制备而成， 使得甘草酸含量有很大提高。本发 明还提供了青梅感冒片在制备抑制小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用。 (51)I。

3、nt.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103768207 A CN 103768207 A 1/1 页 2 1. 一种青梅感冒片的制备方法， 由青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘 草134g、 积雪草134g、 岗梅267g作为原料药制成， 其特征在于， 所述的制备方法由下列步骤 组成 ： 取青蒿、 香薷， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30M。

4、Pa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药 min， 萃取时 间 180-220min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 5L 的 50% 乙醇， 投入微波萃 取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩 并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇 制颗粒， 干燥， 压片， 制成 150 片， 每片重 0.3g。 2.根据权利要求l。

5、所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3.根据权利要求l所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取压力为 25MPa。 4.根据权利要求l所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取温度为 60。 5.根据权利要求l所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/g 生药min。 6.根据权利要求l所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取时间为 200min。 7. 根据权利要求 l 所述的青梅。

6、感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取功率为 700W。 8. 根据权利要求 l 所述的青梅感冒片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取每次萃 取时间为 8 分钟。 9.权利要求l所述的青梅感冒片在制备抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞增殖药物中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 103768207 A 2 1/5 页 3 一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制小鼠 肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用。 背景技术 0002 青梅感冒颗粒标准。

7、号 WS-11318(ZD-1318)-2002， 记载于国家中成药标准汇编内科 脾胃分册。由青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗 梅 267g 作为原料药制成， 具有清凉解热的功效。用于风热感冒， 头痛， 咳嗽， 鼻塞。 0003 现有技术中， 尚未有青梅感冒颗粒在提取制备方面采用超临界和微波技术的报 道， 而挥发油提取， 水煎煮的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便服 用， 严重影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 为了解决上述的技术问题， 本发明提供了一种青梅感冒片的制备方。

8、法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种青梅感冒片在制备抑制小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 0007 一种青梅感冒片的制备方法， 由青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗梅 267g 作为原料药制成， 所述的制备方法由下列步骤组成 ： 取 青蒿、 香薷， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药min，。

9、 萃取时间 180-220min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 5L 的 50% 乙醇， 投入微波萃取 装置中进行微波萃取， 萃取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加 到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并 干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制 颗粒， 干燥， 压片， 制成 150 片， 每片重 0.3g。 0008 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的 。

10、体积百 分比为 5%。 0009 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取压力为 25MPa。 0010 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取温度为 60。 0011 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/g 生 药min。 0012 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取时间为 200min。 0013 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述微波萃取功率为 700W。 0014 上述的青梅感冒片的制备方法中， 所述微波萃取每次萃取时间为 8 分钟。 说 明 书 CN 103768207 A。

11、 3 2/5 页 4 0015 上述的青梅感冒片在制备抑制小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖药物中的应用。 0016 现有技术中， 青梅感冒颗粒每次1袋， 每袋15g， 一日2-3次。 青梅感冒颗粒服药量 大， 且颗粒剂制备需要加大量的糖， 糖尿病患者不适宜， 不加糖的话味道不佳， 患者不容易 服下， 依从性差。采用本发明方法制备成的青梅感冒片每片重 0.3g， 每次仅需 2 片， 一日服 用 2-3 次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证 明。且制备成片剂， 患者随水吞下即可， 服药量小且无苦味， 患者易于接受。 0017 试验一、 不同方法制备的青梅感。

12、冒片中甘草酸含量的比较 0018 l、 仪器及试药本发明青梅感冒片 ： 按实施例 1 方法制备， 使用 1510g 原料药， 经提 取制成 150 片， 每片重 0.3g。原青梅感冒颗粒， 按照 WS-11318(ZD-1318)-2002 标准方法制 备。 Agilent1200高效液相色谱仪 ； METTLER AE240电子分析天平 ； 甘草酸对照品 （中国药品 生物制品检定所） 。 0019 2、 方法 0020 照高效液相色谱法 （中国药典 2010 年版一部附录 D） 测定。 0021 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 甲醇 -0.2mol/L 醋酸铵溶液。

13、冰醋酸 （67 33 1） 为流动相 ； 检测波长为 250nm。理论板数按甘草酸峰计 算应不低于 3000。 0022 对照品溶液的制备精密称取甘草酸单铵盐对照品适量， 加 90甲醇制成每 1ml 含 0.4mg 的溶液， 即得。 0023 供试品溶液的制备取本发明的青梅感冒片， 研细， 取 0.08g， 精密称定， 置具塞锥 形瓶中， 精密加入 90甲醇 10ml， 密塞， 称定重量， 超声处理 30 分钟， 放冷， 再称定重量， 用 90甲醇补足减失的重量， 离心， 上清液用微孔滤膜 （0.45m） 滤过， 取续滤液， 即 得。 0024 对照产品供试品溶液的制备取本对照的青梅感冒颗粒，。

14、 研细， 混匀， 取 2g， 精密称 定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 90甲醇 10ml， 密塞， 称定重量， 超声处理 30 分钟， 放冷， 再 称定重量， 用 90甲醇补足减失的重量， 离心， 上清液用微孔滤膜 （0.45m） 滤过， 取续滤 液， 即得。 0025 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。3、 结果 0026 结果表明， 本发明青梅感冒片中甘草酸的含量为 35-70mg/ 片 ； 而原青梅感冒颗粒 中甘草酸的含量为 14.5mg/ 袋， 每次服用量 2 片的甘草酸含量为原颗粒剂含量的 5-10 倍， 在服用量减少的情况下， 。

15、甘草酸含量有很大提高。 0027 上述研究表明， 采用本发明制备方法制备的青梅感冒片， 有效成分含量远远高于 WS-11318(ZD-1318)-2002 标准记载的方法制备的青梅感冒颗粒。 具体实施方式 0028 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0029 实施例 1 0030 取青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗梅 说 明 书 CN 10376820。

16、7 A 4 3/5 页 5 267g， 将青蒿、 香薷加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为 5%， 萃取压力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药 min， 萃取时间 200min， 得 超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入5L的50%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波 萃取， 萃取功率 700W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Dl01 大孔吸附树脂柱 上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备 用 ； 将上述超临界。

17、萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 150 片， 每片重 0.3g。 0031 经检测， 成品中甘草酸的含量为 69.8mg/ 片。 0032 实施例 2 0033 取青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗梅 267g， 将青蒿、 香薷加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂 的 体积百分比为 4%， 萃取压力 30MPa， 温度 50， CO2流量 3ml/g 生药 min， 萃取时间 180min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药，。

18、 粉碎， 加入 5L 的 50% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行 微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 5 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Dl01 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 150 片， 每片重 0.3g。 0034 经检测， 成品中甘草酸的含量为 56.2mg/ 片。 0035 实施例 3 0036 取青蒿 200g、 五指柑 267g、 香薷 134g、 狗肝菜 200g。

19、、 甘草 134g、 积雪草 134g、 岗梅 267g， 将青蒿、 香薷加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为 6%， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2流量 1ml/g 生药min， 萃取时间 220min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入5L的50%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微 波萃取， 萃取功率 800W， 萃取 2 次， 每次 10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Dl01 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 备用。

20、 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 150 片， 每片重 0.3g。 0037 经检测， 成品中甘草酸的含量为 36.9mg/ 片。 0038 实施例 4 ： 青梅感冒片抑制小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 细胞增殖的实验研究资料 0039 1实验材料 0040 1.1 实验用细胞株 0041 小鼠肝癌细胞 Hepa1-6 细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0042 1.2 实验药物 0043 研究药物 ： 本发明青梅感冒片 ： 按实施例 1 方法制备。 0044 药液储液 ： 称取 100mg 青梅。

21、感冒片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldoff 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0045 1.3 实验试剂 0046 DMEM(GIBCO 公 司 Cat.No.12100-061 Lot.No.758137) ；胎 牛 血 清 （浙 江 天 杭 生 物 科 技 有 限 公 司 Lot.No.100419） ； NaHCO3( 上 海 久 亿 化 学 试 剂 有 限 公 司 Cat. 说 明 书 CN 103768207 A 5 4/5 页 6 No.11810-033Lot.No.1088387) ； Trypsin （。

22、AMRESCO 公司） ； EDTA （AMRESCO 公司） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO 公司 1） ； Streptomycin Sulfate(AMRESCO) ； 无水乙醇 （淄博亚杜 兰经贸有限公司） ； MTT(Biosharp 批号 ： 0793) ： PBS（实验室自配） ； 0047 1.4 实验器材 0048 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DMIL） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司型号 ： SPECTRAMAX 190） ； CO2培养箱 （FORMA 型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净。

23、集团安泰公司 制造型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Sprlng 公司型号 ： S/N 020579） ； 精密移液器 （法国吉 尔森公司型号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A) ； 冰箱 ( 西门子公司型号 ： KG18V21TI) ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上 海安亭科学仪器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型。

24、号 ： SLGP033RB） ； 1cm 培养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0049 2实验方法 0050 1)Hepa1-6 细胞用 DMEM+10%FBS 于 37、 5%CO2进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当细胞生长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml 0.25% 胰蛋白 酶-0.04%EDTA， 37消化2min后， 向其中加入5ml完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转 入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104。

25、个 /ml。 0051 2)将细胞种入96孔培养板中， 每孔加入细胞悬液180l， 培养板放入细胞培养箱 中 (37， 5%CO2) 常规培养。 0052 3) 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入青梅感冒片溶液， 继续培养 24h。 0053 4)24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0054 5)4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔如入 200l 二甲基亚砜， 置摇 床上低速振荡10min， 使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 0055 6) 同时设置本底 （不加细胞。

26、， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0056 7) 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 (%)=（对照孔 OD 值 - 给药 孔 OD 值） 、 对照孔 OD 值 100%。实验重复 3 次。 0057 3统计处理 0058 采用 Microsoft Excel 2007 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据以 meanSD表示。 0059 4实验结果 0060 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 Hepa1-6 细 胞增殖。

27、抑制有差异 (P0.05)， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 (P0.01)， 当剂量达到 15-20mg/ml 时有极显著性差异 (P0.001)。 0061 表 1 青梅感冒片对 Hepa1-6 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 0062 组别药物浓度 （mg/ml）抑制率 （%） 对照组00 158.175.33 21015.126.98* 说 明 书 CN 103768207 A 6 5/5 页 7 31532.6510.74* 42043.6913.64* 0063 注 ： 与对照组比较， *PO.01 ； *P0.001。 0064 5实验结论 0065 本发明的青梅感冒片可以抑制 Hepa1-6 细胞增殖， 减少 Hepa1-6 细胞的细胞生长 数目， 该作用呈剂量依赖性。 说 明 书 CN 103768207 A 7 。