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1、(10)授权公告号 CN 102920730 B (45)授权公告日 2014.09.03 CN 102920730 B (21)申请号 201210446427.5 (22)申请日 2012.11.09 A61K 31/716(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 3/10(2006.01) C08B 37/02(2006.01) (73)专利权人 中海科创(北京)生物医药科技有 限公司 地址 100086 北京市海淀区青云里满庭芳园 小区 9 号楼青云当代大厦 1608 (72)发明。
2、人 于惊涛 CN 1349825 A,2002.05.22, 权利要求 1-2. 张蓉娇等 . 姬松茸多糖及其生物活性研究进 展 .贵州农业科学 .2009, 第 37 卷 ( 第 6 期 ), 第 2.1 和 2.2 部分 . 张蓉娇等 . 姬松茸多糖及其生物活性研究进 展 .贵州农业科学 .2009, 第 37 卷 ( 第 6 期 ), 第 2.1 和 2.2 部分 . 曾小龙等 . 姬松茸多糖化学组分及其药理作 用的研究进展 . 中国食用菌 .2007, 第 26 卷 ( 第 1 期 ), 第 2.1 节 . 曾小龙等 . 姬松茸多糖化学组分及其药理作 用的研究进展 . 中国食用菌 .2。
3、007, 第 26 卷 ( 第 1 期 ), 第 2.1 节 . (54) 发明名称 一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中 的用途 (57) 摘要 本发明涉及一种从姬松茸中提取得到的多糖 提取物的制药用途， 其分子量在 50 万至 150 万之 间， 制备方法为， 用浓度为 95乙醇提取后， 弃去 提取液， 残渣加水温浸， 期间超声波辅助提取， 水 提液醇沉， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋白， 然后用 sephadex 凝胶柱层析分离， 其具有显著的 药理活性， 具有显著的降血脂作用， 以及抗肿瘤、 增强免疫力和降血糖作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马彦冬。
4、 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 (10)授权公告号 CN 102920730 B CN 102920730 B 1/1 页 2 1. 一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途， 其特征在于所述姬松茸多糖提 取物是水溶性多糖， 是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到， 分子量在 70 万 110 万之间的多种多糖复合物。 2. 如权利要求 1 所述的姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途， 其特征在于所 述姬松茸多糖提取物是采用如下方法制备得到的 ： 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉 碎， 用。
5、浓度为 95乙醇提取后， 弃去提取液， 残渣加水温浸， 期间超声波辅助提取， 水提液醇 沉， 沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白， 然后用sephadex凝胶柱层析分离， 收集需要分子 量范围内的组分， 即得。 3. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于所述姬松茸多糖提取物是主要以 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键的多糖。 4. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于所述姬松茸多糖提取物是所述部分 -（1-6） 苷键是分布在主链上， 支链上无 -（1-6） 苷键的分布。 权 利 要 求 书 CN 102920730 B 2 1/8 页 3 一种姬松茸。
6、多糖提取物在制备降血脂药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 具体涉及一种姬松茸提取物在制备降血脂药物中的用途， 更具体地本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途。 背景技术 0002 姬 松 茸 又 名 小 松 菇、 巴 西 蘑 菇、 柏 拉 氏 蘑 菇， “Agaricus Blazei Murill” 、 “Agaricus” 、“ABM” 或 “Himematsutake” ， 属担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑菇 （黑伞） 科蘑菇 （黑 伞） 属。该菌原产于巴西， 1965 年日本引入， 成功进行了人工栽培， 并于 1975 年开始商业化 生产。1992 年我国。
7、由福建省农科院首次从日本引进姬松茸并栽培成功， 目前在福建、 江西 等省份有大面积的种植。姬松茸含有丰富的蛋白质和多糖， 具有极高的营养价值和药用价 值 , 在医药领域和保健食品行业中具有很高的开发应用前景。 0003 姬松茸具有浓郁的杏仁香味， 美味可口， 含有丰富的蛋白质和多糖， 营养价值很 高。姬松茸菌盖嫩， 菌柄脆， 口感极好， 味纯鲜香， 食用价值颇高。新鲜子实体含水分 85% 87% ； 可食部分每 100g 干品中含粗蛋白 40 45g、 可溶性糖类 38 45g、 粗纤维 6 8g、 脂 肪 3 4g、 灰分 5 7g ； 已测定的 17 种氨基酸总量为干重的 19.22， 其。
8、中 50.18为人体 必需氨基酸， 高于其它食用菌， 还含有多种维生素和麦角甾醇。姬松茸营养极其丰富， 而且 组配合乎人体健康要求， 尤其引人注目的是医药保健价值。 0004 姬松茸富含多种活性成分， 可作为免疫调节剂、 抗癌剂、 抗突变剂和抗菌物质的来 源， 因而引起全世界的极大关注， 具有广泛的应用价值和前景。 多糖类物质是姬松茸众多药 理作用组分中的重要一种， 作为姬松茸提高免疫力、 抗肿瘤活性的成分， 与姬松茸的药用功 能密切相关。 在实际应用中， 由于姬松茸经过水煮提取的粗多糖中含有游离的杂蛋白质、 色 素以及其他一些低分子物质 （包括寡糖、 一些单糖、 盐分等） ， 其中蛋白质含量。
9、较高， 在药品 开发过程中必须将其有效去除方能保证药品的稳定性并防止出现不良反应。 因此在姬松茸 相关药品开发的实际过程中粗多糖的分离纯化是一个必不可少的步骤。 随着姬松茸多糖功 能的深入探索 , 越来越多人对多糖的提取方法进行了研究。目前对多糖的提取方法主要 有热水浸提法、 溶剂提取法、 酶提取法等。 现有技术中提取得到的姬松茸多糖主要有两个类 型， 即分子量为 50000 的多糖和分子量为 2000000 的多糖。申请人在研究中发现， 上述两种 多糖并不是姬松茸中活性最强的多糖。 0005 目前， 对姬松茸多糖的药理研究主要集中于抗肿瘤活性、 增强机体免疫力、 影响造 血功能、 保护肝脏的。
10、作用及其它的一些功能， 如提供机体消化能力等等。 0006 需要注意的是， 虽然有部分现有技术指出姬松茸整体具有降血脂作用， 但在现有 技术中没有姬松茸多糖具有降血脂作用的记载， 在现有技术 “姬松茸多糖降血糖、 降血脂 作用的研究” （段县平 , 等 . 姬松茸多糖降血糖、 降血脂作用的研究 J. 四川畜牧兽医， 2005,6:34 35） 中明确指出， 姬松茸多糖没有降血脂作用，“模型组的甘油三酯 （TG） 、 胆固 醇 （TC） 含量显著高于对照组 （P0.05） ， 说明高血脂模型造模成功。各多糖组小鼠的 TG、 TC 含量与模型组相比， 差异不显著， 表明姬松茸多糖未显示出降血脂的作。
11、用。 有学者认为姬松 说 明 书 CN 102920730 B 3 2/8 页 4 茸子实体中含有的食物纤维以及以亚油酸为主体的不饱和脂肪酸都具有降低胆固醇、 改善 动脉硬化的作用。再结合本试验结果， 推测姬松茸降血脂作用与其所含的多糖类无关” 。 0007 申请人经过大量的研究， 发现了姬松茸中特定分子量范围的多糖部分， 其具有独 特的药理活性， 药理活性明显强于其他活性部位。尤其是， 其具有非常显著的降血脂作用。 发明内容 0008 本发明涉及一种姬松茸多糖在制备降血脂药物中的用途。 0009 本发明所述的姬松茸多糖提取物是姬松茸水溶性多糖， 是从姬松茸子实体或人工 培养的菌丝体中提取得到。
12、， 分子量在 50 万 150 万之间的多种多糖复合物。 0010 进一步的， 本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在70万110万之间的多种 多糖复合物。 0011 更进一步的， 本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在 90 万的多糖。 0012 更进一步的， 本发明涉及的姬松茸多糖提取物是主要以 -（1-3） -D 葡聚糖为主 链， 并有部分 -（1-6） 苷键的多糖。 0013 更进一步的， 所述部分 -（1-6） 苷键是分布在主链上， 支链上无 -（1-6） 苷键 的分布。 0014 进一步的， 本发明所述的姬松茸多糖提取物的制备方法是， 取姬松茸子实体或人 工培养的菌丝体粉碎， 用浓。
13、度为 95乙醇提取后， 弃去提取液， 残渣加水温浸， 期间超声波 辅助提取， 水提液醇沉， 沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白， 然后用sephadex凝胶柱层析 分离， 收集平均分子量在 50 万和 150 万之间的组分。 0015 更进一步的， 所述姬松茸多糖提取物的制备方法是， 取姬松茸子实体或人工培养 的菌丝体粉碎至 60 120 目， 用 2 7 倍量浓度为 95乙醇提取后， 弃去提取液， 残渣加 3 6 倍量水温浸 3 次， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋白， 然后用 se。
14、phadex 凝胶柱层析分 离， 收集平均分子量在 50 万和 150 万之间的组分。 0016 更进一步的， 所述姬松茸多糖提取物的制备方法是， 取姬松茸子实体或人工培养 的菌丝体粉碎至 100 目， 用 5 倍量浓度为 95乙醇提取后， 弃去提取液， 残渣加 4 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度 为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多 糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶解 60min， 升温至 80灭活酶活 性，。
15、 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗脱， 收集平均分子量在 50 万和 150 万之间的组分。 0017 更进一步的， 本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备抗肿瘤药物中的用途， 其 特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖， 是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中 提取得到， 分子量在 50 万 150 万之间的多种多糖复合物。 0018 更进一步的， 本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备增强免疫药物中的用途， 其特征在于所述姬松茸多糖。
16、提取物是水溶性多糖， 是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体 中提取得到， 分子量在 50 万 150 万之间的多种多糖复合物。 说 明 书 CN 102920730 B 4 3/8 页 5 0019 更进一步的， 本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备降血糖药物中的用途， 其 特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖， 是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中 提取得到， 分子量在 50 万 150 万之间的多种多糖复合物。 0020 本发明中， 采用苯酚硫酸法测定多糖含量， 具体测量方法可参考 “曲秀梅， 樊英 丽 . 姬松茸多糖的含量测定 J. 局解手术学杂志， 2004， 13(2) ： 141。
17、” ， 在此引入作为参考， 经测量， 本发明的姬松茸多糖提取物含量达到 95 100。 0021 本发明中， 姬松茸多糖经 sepharose CL-6B 测定分子量分布和纯度， 使用葡聚糖制 备标准曲线。 取5mg溶于1ml蒸馏水中， 充分混匀， 离心除去杂质， 上sepharose CL-6B凝胶 柱层析 （1.590cm） ， 0.9 NaCl 溶液洗脱， 用苯酚硫酸法测定糖分布， 结果再次显示， 提 取物的分子量分布于 50 万 150 万之间， 或 70 万 110 万之间， 或 90 万。 0022 本发明中采用如下方法分析多糖中的单糖组成， 样品 10mg 经 2mol/L 三氟。
18、乙酸 120封管水解 3h， 蒸干去除三氟乙酸， 加 1mg 肌醇和 0.1mol/L 的 Na2CO3 1ml， 30保温 50min， 加 KBH4 50mg， 室温放置 1.5h， 用 25% 乙酸中和 KBH4， 并用阳离子交换树脂除盐， 加 甲醇干燥， 重复 3 次， 将干燥物 85真空加热 2h， 加 1ml 正丙胺和 1ml 无水吡啶， 55保温 30min， N2吹干， 加 0.5ml 无水吡啶和 0.5ml 乙酸酐， 90保温 1h， N2吹干， 加 1ml 无水二氯 甲烷， 离心， 取上清用气相色谱测定。气相色谱法 (GC) ： 仪器 ： Vavian 3400 气相色谱仪。
19、附 FID 检测器， HP3365 化学工作站 ； 色谱柱 ： SE-30 50mm0.20mm0.25m ； 气化 ： 280 ； 检 测 ： 280 ； 柱温 ： 从 130 (2min)， 升温 10 /min， 至 250 (20min) ； 载气 ： 高纯氮气。 0023 结果显示， 单糖主要为葡萄糖、 半乳糖和甘露糖。 0024 本发明中测定多糖的结构采用如下方法， C13NMR ； 仪器 ： INOVA-500 ； 工作频率 ： 125 MHz ； 测试温度 ： 20 ； 累积时间 ： 16h ； 溶剂 ： 重水。以及红外光谱分析， 样品经溴化钾压片， 4000 400 -1 区。
20、间扫描红外吸收， 用 Nicolet360 型傅立叶变换红外光谱仪记录红外光 谱。结果显示， 本发明的姬松茸多糖提取物主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并 有部分 -（1-6） 苷键。并且进一步的， 部分 -（1-6） 苷键是分布在主链上， 支链上无 -（1-6） 苷键的分布。 0025 本发明经过实验证实， 上述姬松茸多糖具有显著的抗肿瘤、 增强免疫力作用， 其较 现有技术中提取的其他多糖作用有显著增强。更加值得关注的是， 本发明的多糖具有非常 显著的降血脂作用， 而现有技术中的多糖没有降血脂作用。 0026 进一步的， 本发明的提取物还可以作为活性成分与药学上可接受的载体制。
21、备成具 有治疗肿瘤、 糖尿病、 高血脂的药物。该药物可以是各种剂型如片剂、 颗粒剂、 口服液、 胶囊 剂、 丸剂、 注射液等。 0027 实施例 1 0028 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至 100 目， 用 5 倍量浓度为 95乙醇提 取后， 弃去提取液， 残渣加 4 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋 白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶 解 60min， 升温至 80灭。
22、活酶活性， 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗 脱， 收集平均分子量在 50 万和 150 万之间的部分， 浓缩、 干燥， 即得姬松茸多糖提取物。经 说 明 书 CN 102920730 B 5 4/8 页 6 测定， 其多糖含量为 100； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0029 实施例 2 0030 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至 100 目， 用 5 倍量浓度为 95乙。
23、醇提 取后， 弃去提取液， 残渣加 4 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋 白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶 解 60min， 升温至 80灭活酶活性， 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗 脱， 收集平均分子量在 70 。
24、万和 110 万之间的部分， 浓缩、 干燥， 即得姬松茸多糖提取物。经 测定， 其多糖含量为 100； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0031 实施例 3 0032 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至 100 目， 用 5 倍量浓度为 95乙醇提 取后， 弃去提取液， 残渣加 4 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋 白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶， 调节pH 值为5。
25、.0， 40下酶解 60min， 升温至 80灭活酶活性， 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除 去蛋白， 重复2 次） ， 然后用sephadex G200凝胶柱层析分离， 以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱， 收集平均分子量在 90 万的部分， 浓缩、 干燥， 即得姬松茸多糖提取物。经测定， 其多糖含量 为 100 ； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0033 实施例 4 0034 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至 60 目， 用 7 倍量浓度为 95乙醇提 取后， 弃去提取液， 残渣加 3 倍量水。
26、 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 80， 沉淀 15 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋 白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶 解 60min， 升温至 80灭活酶活性， 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗 脱， 收集平均分子量在 50 万和 150 万之间的部分， 浓缩、 干燥， 。
27、即得姬松茸多糖提取物。经 测定， 其多糖含量为 99； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0035 实施例 5 0036 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至120目， 用2倍量浓度为95乙醇提取 后， 弃去提取液， 残渣加 6 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 2 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为60， 沉淀20小时， 沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶解 60min， 升温至 80灭活酶活性， 然。
28、后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗脱， 收集平均 分子量在 50 万和 150 万之间的部分， 浓缩、 干燥， 即得姬松茸多糖提取物。经测定， 其多糖含 说 明 书 CN 102920730 B 6 5/8 页 7 量为 959 ； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0037 实施例 6 0038 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至 70 目， 用 5 倍量浓度为 95乙醇提 取后， 。
29、弃去提取液， 残渣加 5 倍量水 60温浸， 期间每次超声波 30min 辅助提取， 重复提取 3 次， 水提液合并后， 加乙醇至浓度为 75， 沉淀 20 小时， 沉淀用 sevag 法加胰蛋白酶法脱蛋 白 （5% 姬松茸粗提物溶液， 按多糖浓度的 2% 加入中性蛋白酶， 调节 pH 值为 5.0， 40下酶 解 60min， 升温至 80灭活酶活性， 然后以 Sevag 法除去蛋白， 再加中性蛋白酶水解、 Sevag 除去蛋白， 重复 2 次） ， 然后用 sephadex G200 凝胶柱层析分离， 以 0.5mol/L 的 NaCl 溶液洗 脱， 收集平均分子量在 50 万和 150 。
30、万之间的部分， 浓缩、 干燥， 即得姬松茸多糖提取物。经 测定， 其多糖含量为 99； 主链中主要为 -（1-3） -D 葡聚糖为主链， 并有部分 -（1-6） 苷键。 0039 效果试验例 1 本发明提取物对小鼠 NK 细胞杀伤活性的影响。 0040 将细胞浓度为 1107ml-1S180 瘤株， 给 6 周龄 BALB/c 雄性小鼠每只右后侧腋窝 皮下接种 0.2ml(2106cell) 复制动物模型， 从模型复制后第 2 天起， 实施例 1 低剂量组按 50mgkg-1d-1、 中剂量组按 100 mgkg-1d-1 和高剂量组按 200mgkg-1d-1 腹腔注 射给药， 模型对照组和。
31、空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。另外， 按实施例 1 的制备方 法， 分别制备包含从 0 220 万分子量的全多糖、 分子量 5 30 万的低分子量多糖和分子 量从 180 220 万的高分子量多糖， 分别按 100 mgkg-1d-1 给药。给药共 7 天。给药 结束后24h， 脱颈椎处死小鼠。 75酒精浸泡消毒后， 在无菌条件下取出脾脏并制成单个脾 细胞悬液， 0.83Tris-NH4Cl破坏红细胞， 洗涤脾细胞后， 用RPMI-1640完全培养液调脾细 胞浓度为 1106ml-1。将 1106cellml-1 脾细胞加入 96 孔细胞培养板中， 将 Yac-1 细胞 （调细胞浓度为 。
32、1105ml-1） 取 50l 分别加于测试孔内， 使效靶比为 10 1， 加 1640 培养液 100l。另外 3 孔为效应细胞对照孔， 每孔加入脾细胞为 50l， 1640 培养液 150l。同时另设 3 孔为靶细胞对照孔， 浓度为 1105ml-1Yac-1 细胞悬液 50l/ 孔， 完全 RPMI-1640 培养液 150l/ 孔。混匀， 在 5 CO2、 37条件下培养 20h 后， 每孔加入浓 度为 5mgml-1MTT 10l， 在 5、 37中继续培养 4h。培养结束后， 离心， 弃上清， 每孔加 入二甲亚砜 100l， 微型振荡器震荡数分钟， 使颗粒完全溶解。酶联免疫检测仪在。
33、 570nm 波长处检测各孔吸光度。 0041 自然杀伤率 1-( 实验孔 OD570- 效应细胞孔 OD570)/ 靶细胞 OD570100， NK 细胞活性实验数据经 Tamhane 检验结果见表 1。 0042 表 6 对 NK 细胞活性的影响 ( xs) 0043 组别剂量 （mgkg-1d-1）例数 （只）NK 细胞活性 （） 正常对照组01236.55.6 模型对照组01222.12.6 实施例 1 低剂量501232.32.9 实施例 1 中剂量1001236.35.1 实施例 1 高剂量2001237.26.4 姬松茸全多糖1001228.43.8 姬松茸多糖 5 万 30 万。
34、部分1001231.83.9 姬松茸多糖 180 220 万部分1001230.74.1 说 明 书 CN 102920730 B 7 6/8 页 8 0044 结果表明， 与正常对照组相比较， 模型对照组 NK 细胞活性明显降低 （P 0.01） ， 差异具有统计学意义。与模型对照组比较， 实施例 1 低剂量组、 中剂量组和高剂量组 NK 活 性明显升高， 且具有显著性差异 （P 0.01） 。NK 细胞活性和低分子姬松茸多糖呈剂量依赖 性。同时， 在相同剂量下， 实施例 1 的姬松茸多糖提取物明显优于姬松茸多糖 5 万 30 万 部分和 180 220 万部分， 同时也优于全多糖。结果提示。
35、， 低分子姬松茸多糖能增强 NK 细 胞杀伤靶细胞的能力， 进而通过免疫调节作用提高机体的抗肿瘤转移能力。 0045 效果试验例 2 对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用。 0046 （1） 试验目的 0047 测试本发明姬松茸多糖对小鼠 S180 肉瘤生长的抑制作用。 0048 （2） 受试药物 0049 实施例3制备的姬松茸多糖， 以及按实施例3的制备方法分别制备包含从0220 万分子量的姬松茸全多糖、 分子量 5 30 万的低分子量多糖和分子量从 180 220 万的高 分子量多糖 0050 配制 ： 用蒸馏水配成溶液 0051 （3） 对照样品 0052 云芝糖肽胶囊， 上海新康制药厂生产。
36、， 批号 ： 990801， 规格 ： 每粒 0.34g。 0053 （4） 动物 0054 昆明种小鼠， 雄性， 体重 ： 18-22g， 每组 10 只， 由中科院上海实验动物中心提供。 0055 （5） 移植性肿瘤 ： 小鼠 S180 肉瘤， 购自中科院上海细胞所。 0056 （6） 试验方法 0057 取生长良好的小鼠 S180 肉瘤腹水， 用生理盐水以 1 4 稀释， 每只小鼠右腋皮下 接种 0.2ml， 随机分组。实施例 3 姬松茸多糖提取物、 姬松茸全多糖、 低分子量多糖和高分 子量多糖的剂量均为 0. 5g/kg 剂量组， 云芝糖肽对照组 0.5g/Kg， 接种后次日起给药， 。
37、给药 体积为 0.5ml/20g 体重， 连续灌胃 7 天。接种后 10 日脱颈处死动物， 称体重， 解剖取瘤块， 称瘤重。结果判定根据以下公式 ： 肿瘤抑制率 （对照组平均瘤重 - 给药组平均瘤重） / 对照组平均瘤重 100。 0058 （7） 试验结果 0059 实施例 3 姬松茸多糖提取物、 姬松茸全多糖、 低分子量多糖和高分子量多糖， 对小 鼠 S180 肉瘤均有抑制作用， 与对照组比较具有显著性差异。试验结果见表 2。 0060 表 2 对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用。 0061 组别剂量 （g/kg）给药方案动物数 （只）动物体重 （g）抑瘤率 空白对照po71025.11.2。
38、 云芝糖肽0.5po71026.11.552 实施例 30.5po71025.60.967 全多糖0.5po71025.41.756 低分子0.5po71026.32.162 高分子0.5po71024.61.859 0062 （8） 试验结论 0063 实施例 3 姬松茸多糖提取物、 姬松茸全多糖、 低分子量多糖和高分子量多糖对小 鼠S180肉瘤的生长有明显的抑制作用， 其中实施例3姬松茸多糖提取物明显优于姬松茸全 说 明 书 CN 102920730 B 8 7/8 页 9 多糖、 低分子量多糖和高分子量多糖， 具有显著意义。 0064 效果试验例 3 降血脂试验。 0065 （1） 试验。
39、材料 0066 雄性昆明种小鼠， 体重 182g， 购于天津医科大学实验动物中心， 姬松茸多糖 （实 施例 2 制备的姬松茸多糖， 以及按实施例 2 的制备方法分别制备包含从 0 220 万分子量 的姬松茸全多糖、 分子量 5 30 万的低分子量多糖和分子量从 180 220 万的高分子量多 糖） ， 生理盐水分别配 4的灭菌溶液 0067 75蛋黄乳剂 ： 75mL 蛋黄加 25mL 灭菌生理盐水， 用电动混匀器混匀成乳状。 0068 （2） 试验方法 ： 将 60 只健康小鼠随机分为 6 组， 每组 10 只， 健康对照组按常规饲 喂。高血脂模型共 5 组。对照组， 每天皮下注射灭菌生理盐。
40、水 0.15mL/ 只。实施例 2 多糖 组， 每天皮下注射 2多糖灭菌溶液 0.15mL/ 只。全多糖组， 每天皮下注射 2多糖灭菌溶 液 0.15mL/ 只。低分子量多糖组， 每天皮下注射 2多糖灭菌溶液 0.15mL/ 只。高分子量 多糖组， ， 每天皮下注射 2多糖灭菌溶液 0.15mL/ 只。共给药 10 天。于末次给药 2 小时 后， 除健康对照组腹腔注射灭菌生理盐水外 （0.5mL/ 只） ， 其它各组均一次性腹腔注射 75 蛋黄乳剂 0.5mL/ 只， 禁食 （不禁水） 12 小时， 摘眼球取血， 分离血清检测甘油三脂和胆固醇。 结果见表 3。 0069 表 3 降血脂作用。 。
41、0070 组别小鼠数 （只）甘油三脂胆固醇 健康对照组102.380.331.840.24 高血脂模型对照组106.871.9212.852.16 实施例 2 多糖组103.080.313.861.20 全多糖107.532.2314.63.14 低分子量多糖107.913.0214.73.25 高分子量多糖108.443.5614.54.24 0071 （3） 试验结论 0072 实施例 2 姬松茸多糖提取物能发挥降血脂作用， 而姬松茸全多糖、 低分子量多糖 和高分子量多糖均没有降血脂作用。 0073 效果试验例 4 降血糖作用。 0074 （1） 试验材料 0075 雄性昆明种小鼠， 体重。
42、 182g， 购于天津医科大学实验动物中心， 姬松茸多糖 （实 施例 4 制备的姬松茸多糖， 以及按实施例 4 的制备方法分别制备包含从 0 220 万分子量 的姬松茸全多糖、 分子量 5 30 万的低分子量多糖和分子量从 180 220 万的高分子量多 糖） ， 生理盐水分别配 4的灭菌溶液 0076 四氧嘧啶 ： 英 BDH 公司产品。 0077 （2） 试验方法 0078 20 只健康小鼠作为对照组， 取糖尿病模型鼠 （用四氧嘧啶 200mg/kg 体重腹腔注 射， 72 小时后， 取禁食 12 小时的鼠测量空腹血糖， 血糖值大于 10mmol/L 者为模型鼠） 100 只， 随机分为 。
43、5 组， 即病理模型组、 实施例 4 姬松茸多糖组、 全多糖组、 低分子量多糖组和高 分子量多糖组。健康对照组和病理模型组每天均皮下注射灭菌生理盐水 0.15mL/ 只， 其他 组剂量也为 0.15mL/ 只， 共 10 天， 于末次给药后禁食 12 小时 （不禁水） ， 摘眼球取血， 测量血 说 明 书 CN 102920730 B 9 8/8 页 10 糖值， 结果见表 4。 0079 表 4 降血糖作用。 0080 组别小鼠数 （只）血糖浓度 （mmol/L） 健康对照组204.750.14 病理模型组2016.642.31 实施例 4 多糖组204.921.16 全多糖2010.211.10 低分子量多糖209.582.67 高分子量多糖2011.292.28 0081 （3） 试验结论 0082 实施例 4 姬松茸多糖提取物、 姬松茸全多糖、 低分子量多糖和高分子量多糖均能 发挥降血糖作用， 其中姬松茸多糖提取物的作用明显优于姬松茸全多糖、 低分子量多糖和 高分子量多糖， 具有显著意义。 说 明 书 CN 102920730 B 10 。