牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103355165 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103355165 A *CN103355165A* (21)申请号 201210101820.0 (22)申请日 2012.04.09 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 上海植物园 地址 200231 上海市徐汇区龙吴路 1111 号 申请人 上海市农业科学院 (72)发明人 胡永红 殷丽青 周音 刘炤 高清华 张建军 孙翊 王新其 (74)专利代理机构 上海开祺知识产权代理有限 公司 31114 代理人 费开逵 (54) 发明名称 牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基 (5。

2、7) 摘要 本发明公开了一种牡丹胚性愈伤组织的培养 方法及其培养基。通过采用改良后含有特殊成分 ( 如 6-BA、 KT 细胞分裂素、 TDZ 植物生长调节剂、 PIC 除草剂及水解酪蛋白等物质 ) 的 MS 培养基进 行牡丹胚性愈伤组织的诱导， 针对牡丹种胚外植 体， 采用本发明特有的培养方法， 可使牡丹愈伤组 织的诱导率达 100， 其中胚性愈伤组织的诱导 率达 86以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103355165 。

3、A CN 103355165 A *CN103355165A* 1/2 页 2 1. 一种用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基， 包含以下物质 ： 其中， mg/L 表示每升培养基中含各成分的毫克数， 培养基的 pH 5.8-6.0。 2. 一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法， 包括以下步骤 ： 1) 采集授粉后 80-115 天的半成熟牡丹种子， 筛选其中颗粒饱满的种子， 用流水冲洗， 再用 70 ( 体积比 ) 酒精消毒， 然后用 10-15 ( 体积比 ) 的次氯酸钠溶液消毒， 最后用无 菌水冲洗 ； 2) 在超净台上， 用解剖刀切开消毒后的牡丹种子， 剥取种胚 ； 3) 将种胚接种到权利要求 。

4、1 所述的培养基中， 进行暗培养 ； 4) 暗培养 25-35 天后， 得胚性愈伤组织 ； 权 利 要 求 书 CN 103355165 A 2 2/2 页 3 5) 将暗培养获得的胚性愈伤组织在新鲜的权利要求 1 所述的培养基上继代 1-2 次后， 部分胚性愈伤组织逐渐产生胚状体 ； 6) 将胚性愈伤组织和胚状体培养于去除 PIC 成分的权利要求 1 所述的培养基上， 置于 光照条件下培养， 20-30 天后胚性愈伤组织逐渐分化不定芽， 胚状体萌发形成小植株 ； 7) 将不定芽直接切割成单芽， 转入生根培养基诱导生根， 形成牡丹完整植株。 3. 根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于。

5、， 所述的半成熟牡丹种子的形状大小 如成熟牡丹种子， 颜色为乳白色至淡褐色， 种壳不硬。 4. 根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述的暗培养温度为 24-26。 5. 根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 步骤 6) 光照条件下培养温度为 24-26， 光照强度为 1500-2500 勒克斯。 6. 根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 步骤 7) 的生根培养基配方为 ： 1/2MS+IBA 5mg/L+ 蔗糖 15g/L。 权 利 要 求 书 CN 103355165 A 3 1/7 页 4 牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基 技术领域 0001 。

6、本发明属植物组织培养技术领域， 涉及一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培 养基。 背景技术 0002 牡丹(Paeonia Suffruticosa)系芍药科、 芍药属多年生灌木， 是我国传统名花， 已 成为世界流行花木之一， 市场前景非常广阔。 但由于传统的牡丹繁殖方法存在繁殖率低、 繁 殖周期长等缺陷， 严重制约了牡丹的繁殖和育种进程以及商品化发展。利用组织培养方法 进行牡丹繁殖， 以解决常规繁殖方法存在的不足， 是牡丹商品化及产业化发展的必然趋势， 同时也是加快牡丹育种和繁殖步伐的重要基础。 0003 目前， 牡丹组织培养通常采用如下两种途径 ： 直接诱导不定芽， 然后在生根培养 基上诱。

7、导生根 ； 先诱导出愈伤组织， 再分化形成不定芽， 最后在生根培养基上诱导生根。 其中， 第种方法主要集中在鳞芽、 胚等少数外植体的培养， 但繁殖系数较小 ； 第种方法 研究的范围较广， 如土芽、 叶柄、 叶片、 幼芽、 心皮、 雄蕊等， 但存在愈伤组织诱导率低， 且获 得愈伤组织后能成功分化小苗的报道很少 ( 其主要原因在于获得的愈伤组织质量差， 缺少 胚性愈伤组织 )。 0004 胚性愈伤组织可作为牡丹转基因研究的良好受体材料， 胚性愈伤组织的制备可为 牡丹的基因工程育种奠定基础。陈怡平等先后用紫斑牡丹的土芽、 叶柄、 叶片、 幼芽、 心皮、 雄蕊及经组织培养获得的试管苗等作为外值体， 来。

8、考察不同激素种类和浓度以及不同类型 的外植体对愈伤组织诱导的影响。 结果表明 ： 在愈伤组织诱导时， 组织脱分化对NAA浓度的 变化比对 BA 浓度的变化敏感， NAA 浓度稍高于 BA 浓度是比较理想的配方， 而最为理想的配 方为 MS+BA 1.5mg/L+NAA 2.0mg/L ； 不同外植体中， 试管苗的幼芽和土芽诱导率最高， 叶柄 和叶片次之 ； 而生殖器官雄蕊和心皮未能诱导成功 【陈怡平等， 用紫斑牡丹不同外植体诱导 愈伤组织的研究， 西北师范大学学报 ( 自然科学版 )， 2001 年第 3 期， p66-69】 。陈笑蕾分别 采用叶柄、 叶片进行愈伤组织诱导、 增殖及分化培养，。

9、 结果发现 ： 各个因素对诱导愈伤组织 的影响程度依次为 6-BA 2， 4-D 材料类型 NAA IAA ； 用近枝干叶柄为材料， 并培养 于 1/2MS+2， 4-D 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L 培养基中， 愈伤组织诱导率最高 ； 在愈伤组织增殖 培养过程中， 6-BA 和 NAA 是主要影响因素 【陈笑蕾， 牡丹组织培养的初步研究， 2005 年中国 优秀硕士学位论文全文数据库， P24-28】 。 刘会超等报道了牡丹愈伤组织诱导和继代培养体 系的建立， 研究了不同外植体、 激素对愈伤组织诱导和继代增殖的影响， 但无牡丹愈伤组织 分化的结果。 牡丹愈伤组织诱导率低、 质量差等。

10、问题影响了牡丹基因工程育种的进程 【刘会 超等， 牡丹愈伤组织诱导和继代培养体系的建立， 福建林业科技， 2009 年 6 月， p73-78】 。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培 养基。本发明通过采用改良后含有特殊成分的 MS 培养基进行愈伤组织的诱导 ( 特殊成分 说 明 书 CN 103355165 A 4 2/7 页 5 如 6-BA、 KT 细胞分裂素、 TDZ 植物生长调节剂、 PIC 除草剂及水解酪蛋白等物质 )， 针对牡丹 种胚外植体， 通过本发明特定的培养方法， 使牡丹愈伤组织的诱导率达 100， 其中胚性愈 伤组织的。

11、诱导率达 86以上。 0006 为了达到上述目的， 本发明采用以下技术方案来实现。 0007 所述的牡丹胚性愈伤组织的培养方法， 包括以下步骤 ： 0008 1)采集授粉后80-115天的半成熟牡丹种子(形状大小如成熟牡丹种子， 颜色为乳 白色至淡褐色， 种壳不硬 )， 筛选其中颗粒饱满的种子， 用流水冲洗， 再用 70 ( 体积比 ) 酒 精消毒， 然后用 10-15 ( 体积比 ) 的次氯酸钠溶液消毒， 最后用无菌水冲洗 ； 0009 2) 在超净台上， 用解剖刀切开消毒后的牡丹种子， 剥取种胚 ； 0010 3) 将胚接种到含有特殊成分的 MS 培养基中， 进行暗培养 ； 0011 4)。

12、 暗培养 25-35 天后， 得胚性愈伤组织 ； 0012 5) 将暗培养获得的胚性愈伤组织在新鲜的含有特殊成分的 MS 培养基上继代 1-2 次后， 胚性愈伤组织逐渐产生胚状体 ； 0013 6) 将步骤 5) 中的胚性愈伤组织和胚状体培养于去除 PIC 成分的含有特殊成分的 MS 培养基上， 置于光照条件下培养， 20-30 天后胚性愈伤组织逐渐分化不定芽 ； 胚状体萌发 形成小植株 ； 0014 7) 将不定芽直接切割成单芽， 转入生根培养基诱导生根， 形成牡丹完整植株。 0015 所述的含有特殊成分的 MS 培养基 ( 即用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基 )， 包 含如下表 1 所示物。

13、质 ： 0016 表 1 说 明 书 CN 103355165 A 5 3/7 页 6 0017 0018 其中， mg/L 表示每升培养基中含各成分的毫克数， 培养基的 pH 5.8-6.0。 0019 所述的半成熟牡丹种子， 其形状大小如成熟牡丹种子， 颜色为乳白色至淡褐色， 种 壳不硬。 0020 所述的暗培养温度为 24-26。 0021 所述步骤 6) 光照条件下培养温度为 24-26， 光照强度为 1500-2500 勒克斯。 0022 所述的生根培养基的配方为 ： 1/2MS(1/2 含义是指 MS 培养基中的无机盐成分减 半 )+IBA( 吲哚丁酸 )5mg/L+ 蔗糖 15g。

14、/L。 0023 有益效果 ： 0024 1) 本发明将牡丹种子带种皮先后用 70 ( 体积比 ) 酒精和 10-15 ( 体积比 ) 的 说 明 书 CN 103355165 A 6 4/7 页 7 次氯酸钠溶液消毒后， 切取其种胚作外植体， 简化了消毒方法， 并大大降低了消毒液对外植 体的影响， 且所用消毒剂对人体健康和环境安全危害小。 0025 2) 本发明以牡丹半成熟胚做外植体进行初始培养， 外植体可在蒴果内置冰箱 (4-6 ) 冷藏 25 天左右而不影响培养效果 ； 避免了土芽、 叶柄、 叶片、 幼芽、 心皮、 雄蕊等其 它外植体受季节影响大的缺点。 并且由于牡丹种胚体积小， 生命活。

15、力强， 大大控制了培养物 的褐化现象。 0026 3) 统计结果显示， 采用本发明方法， 暗培养后获得的愈伤组织的诱导率达 100， 其中 86以上为胚性愈伤组织， 容易形成胚状体或分化不定芽， 克服了现有技术中牡丹外 植体诱导愈伤组织困难、 诱导率低、 质量差而难形成体细胞胚或分化不定芽的问题。 0027 4) 采用本发明方法进行牡丹愈伤组织诱导培养， 外植体几乎不发生污染 ； 大大提 高了工作效率并节省了研究成本。 0028 5) 本发明可为牡丹的转基因研究提供大量胚性愈伤组织作基础材料， 对牡丹离体 组织培养研究进程及牡丹的基因工程育种具有促进作用。 附图说明 0029 图 1 为牡丹胚。

16、性愈伤组织图。 0030 图 2 牡丹胚状体。 0031 图 3 牡丹不定芽图。 0032 图 4、 图 5 分别为牡丹种胚在不适宜培养基上的培养结果， 其中图 4 为未获得牡丹 愈伤组织， 图 5 为愈伤组织结构松散无胚性。 具体实施方式 0033 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案， 但所述实施例不限制本 发明的保护范围。 0034 实施例 1 0035 利用江南牡丹品种 ( 风丹 ) 未成熟胚诱导培养牡丹胚性愈伤组织 0036 1) 配制本发明的用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基， 配方如下表 2 所示。 0037 表 2 说 明 书 CN 103355165 A 7 5/7。

17、 页 8 0038 0039 0040 培养基配制后， 调整 pH 5.8-6.0， 1212 度、 15-20 磅下灭菌 20 分钟。 0041 2) 采集授粉 90 天左右的牡丹半成熟种子， 用流水冲洗， 再用 70 ( 体积比 ) 酒精 消毒 1 分钟， 然后用 15 ( 体积比 ) 的次氯酸钠溶液 ( 活性氯含量 5.2 ) 消毒 25 分钟， 再用无菌水冲洗。 0042 3) 在超净台上， 用解剖刀切开牡丹种子剥取种胚。 0043 4) 将种胚接种于步骤 1) 配制的培养基中进行暗培养， 两周后愈伤组织开始产生， 一个月左右逐渐形成胚性愈伤组织 ( 参看图 1)， 其中， 愈伤组织诱。

18、导率达 100 ( 诱导获得 的愈伤组织数占接种的外植体数之百分比 )， 胚性愈伤组织占 86 ( 培养获得的胚性愈伤 说 明 书 CN 103355165 A 8 6/7 页 9 组织占总愈伤组织数的百分比 )。 0044 5) 将胚性愈伤组织在新鲜的步骤 1) 配制的培养基上继代 1 次 (20-30 天 ) 后， 有 72的胚性愈伤组织逐渐产生胚状体 ( 参看图 2)。 0045 6) 将上述步骤 5) 获得的胚状体和胚性愈伤组织培养于不含 PIC 成分的步骤 1 所 述的培养基上， 置于光照条件下培养 ( 光照下培养温度 24-26， 光照强度 1500-2500 勒克 斯 )， 20。

19、-30 天胚性愈伤组织逐渐分化不定芽 ( 参看图 3) ； 胚状体直接萌发形成牡丹小植 株。 0046 7) 将不定芽直接切割成单芽， 转入生根培养基 ( 配方 ： 1/2MS+IBA 5mg/L+ 蔗糖 15g/L) 中诱导生根， 形成牡丹完整植株。 0047 比较例 2 和 3 0048 利用江南牡丹品种 ( 风丹 ) 未成熟胚诱导培养牡丹胚性愈伤组织 0049 分别配制培养基2和培养基3， 其无机盐和有机物成分同实施例1步骤1)所述， 特 殊成分变化如下表 3 所示。 0050 表 3 0051 0052 诱导方法如实施例 1 所述， 结果发现， 牡丹种胚在培养基 2 和培养基 3 上，。

20、 不能诱 导获得牡丹胚性愈伤组织。在培养基 2 上， 外植体只是基部膨大， 培养 40 天也未见形成愈 伤组织 ( 图 4) ； 在培养基 3 上， 外植体能形成愈伤组织， 但结构松散无胚性， 培养 40 天未见 形成胚性愈伤组织 ( 参看图 5)。 0053 从上述对比试验可以看出 ： 培养基中的特殊成分是成功诱导培养牡丹胚性愈伤组 织的关键技术之一， 对特殊成分中部分因素作变化， 则不能成功获得牡丹胚性愈伤组织。 0054 最后应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参 说 明 书 CN 103355165 A 9 7/7 页 10 照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。 说 明 书 CN 103355165 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4图 5 说 明 书 附 图 CN 103355165 A 11 。