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1、(10)申请公布号 CN 103563660 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103563660 A (21)申请号 201310522624.5 (22)申请日 2013.10.29 A01G 7/00(2006.01) (71)申请人 安徽省农业科学院水稻研究所 地址 230031 安徽省合肥市农科南路 40 号 (72)发明人 张瑛 罗志祥 施伏芝 阮新民 滕斌 吴敬德 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权代理 有限公司 34112 代理人 余成俊 (54) 发明名称 一种利用水稻次生根差异筛选耐旱品种的方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用水稻次生根差异。
2、筛选 耐旱品种的方法， 该方法是将要筛选的水稻品种 催芽后移栽， 生长 2 至 3 个月至抽穗前期， 人为设 置干旱的环境条件， 观察其次生根的根系特征， 确 定其耐旱性能。本发明与生理生化指标鉴定方法 相比， 次生根根系特征鉴定方法具有表型简单， 结 果准确， 易于筛选区分等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103563660 A CN 103563660 A 1/1 页 2 1. 一种利用水稻次生根差异筛选耐旱品种的方法。
3、， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 水稻种子的消毒处理 分别取耐旱性能待检测的新收获、 饱满、 完整无虫蚀的不同材料水稻种子各 100 粒分 别装入不同的网袋中， 再用 0.5-1.5mol/L HNO3浸泡 25-35min 后， 用蒸馏水洗多次， 然后用 5-15% 的 H2O2处理 12-18min， 再用蒸馏水洗多次后， 待用 ； （2） 水稻种子的滤纸法催芽 将经步骤 （1） 消毒处理过的水稻种子取出， 放入铺有两层发芽纸的湿润的带盖培养皿 中， 再放入 20-30ml 去离子水， 置于 27-30 的恒温箱中浸种催芽， 直到根和芽的长度为粒 长的一半时， 停止催芽， 从恒温箱中。
4、取出供试验所用 ； （3） 用于水稻生长的细沙土壤盆钵的准备 市售黄沙用自来水清洗至澄清后， 放入白瓷托盘中， 置于干燥箱中， 120-130烘 30-40 分钟至干燥， 冷却后过直径4mm和1.5mm20mm筛， 得到干燥均匀、 吸水性好的细沙土， 将细 沙土放入铺2层滤纸的底部带孔的圆形盆钵的三分之二处, 再将该盆钵则放在宽40cm、 长 60cm、 高 30cm 的长方形塑料盆中， 塑料盆中可通过放入一定量的去离子水以控制土壤的含 水量 ； （4） 移栽和苗期管理 取步骤 （2） 中的幼苗 4-6 颗栽入如步骤 （3） 设置的盆钵中， 塑料盆中平均每 3 天 1 次放 入一定量的营养液，。
5、 以保证水稻幼苗的正常生长， 全营养液参照菲律宾国际水稻所配方 ； （5） 抽穗前期耐旱处理 水稻生长至抽穗前期开始进行干旱试验处理， 对照组则改营养液为加自来水， 使其正 常生长， 干旱处理组则停止加入营养液， 处理时间 15-30 天， 必要时， 用喷洒少许自来水以 防止其枯死， 同时每隔 3 天测定其沙土水分含量 ； （6） 沙土水分含量测定 取盆内沙表面以下5cm处样， 共取5个散点， 散点均匀分布， 取好的沙置于小烧杯内， 并 精确快速称取 10.0g， 在 75-85烘至恒温称重， 计算相对含水量， 计算公式如下 ： 相对含水量 （%） =（湿沙土重量 - 干沙土重量） *100/。
6、 干沙土重量 ； （7） 根系测定材料准备 干旱处理时间 15-30 天后， 重复 3-5 次选取对照组和处理组水稻单株根系， 将沙粒洗 净， 待测 ； （8） 用WinRHIZO PRO 2009型根系图像分析系统测定总根长、 侧根长、 根系表面积、 根体 积及侧根数目， 可通过水稻次生根的根长、 根表面积、 根体积、 根尖数分布判定水稻的耐旱 性。 权 利 要 求 书 CN 103563660 A 2 1/4 页 3 一种利用水稻次生根差异筛选耐旱品种的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种耐旱品种的筛选方法， 具体涉及一种利用水稻次生根差异筛选耐 旱品种的方法。 技术背景 0002 我。
7、国是一个水资源非常短缺的国家， 干旱是影响水稻产量的主要障碍因素之一。 其主要表现表现为抽穗敏感期水分亏缺对产量影响最大。邵玺文 （2004） 研究表明， 水稻抽 穗期水分胁迫处理后， 其生理指标游离脯氨酸、 叶绿素含量等变化最为明显。然而， 生理指 标易受水稻生长环境变化及其检测方法影响存在许多不确定因素， 因此难以直接用于水稻 耐旱材料的筛选。植物根系是植物地上部分赖以生存的基础， 因此植物根系的研究对提高 植物抗旱性有重要的意义， 而以反映水稻耐旱性能的次生根系差异筛选耐旱品种的鉴定方 法尚未见报道。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种利用水稻次生根差异筛选耐旱品种的方法。 本发。
8、明的耐 旱品种的筛选方法， 是将要筛选的水稻品种催芽后移栽， 生长 2 至 3 个月至抽穗前期， 人为 设置干旱的环境条件， 观察其次生根的根系特征， 确定其耐旱性能。 0004 为实现上述目的本发明采用如下技术方案步骤 ： 一种利用水稻次生根差异筛选耐旱品种的方法， 包括以下步骤 ： （1） 水稻种子的消毒处理 分别取耐旱性能待检测的新收获、 饱满、 完整无虫蚀的不同材料水稻种子各 100 粒分 别装入不同的网袋中， 再用 0.5-1.5mol/L HNO3浸泡 25-35min 后， 用蒸馏水洗多次， 然后用 5-15% 的 H2O2处理 12-18min， 再用蒸馏水洗多次后， 待用 ；。
9、 （2） 水稻种子的滤纸法催芽 将经步骤 （1） 消毒处理过的水稻种子取出， 放入铺有两层发芽纸的湿润的带盖培养皿 中， 再放入 20-30ml 去离子水， 置于 27-30 的恒温箱中浸种催芽， 直到根和芽的长度为粒 长的一半时， 停止催芽， 从恒温箱中取出供试验所用 ； （3） 用于水稻生长的细沙土壤盆钵的准备 市售黄沙用自来水清洗至澄清后， 放入白瓷托盘中， 置于干燥箱中， 120-130烘 30-40 分钟至干燥， 冷却后过直径4mm和1.5mm20mm筛， 得到干燥均匀、 吸水性好的细沙土， 将细 沙土放入铺2层滤纸的底部带孔的圆形盆钵的三分之二处, 再将该盆钵则放在宽40cm、 长。
10、 60cm、 高 30cm 的长方形塑料盆中， 塑料盆中可通过放入一定量的去离子水以控制土壤的含 水量 ； （4） 移栽和苗期管理 取步骤 （2） 中的幼苗 4-6 颗栽入如步骤 （3） 设置的盆钵中， 塑料盆中平均每 3 天 1 次放 入一定量的营养液， 以保证水稻幼苗的正常生长， 全营养液参照菲律宾国际水稻所配方 ； 说 明 书 CN 103563660 A 3 2/4 页 4 （5） 抽穗前期耐旱处理 水稻生长至抽穗前期开始进行干旱试验处理， 对照组则改营养液为加自来水， 使其正 常生长， 干旱处理组则停止加入营养液， 处理时间 15-30 天， 必要时， 用喷洒少许自来水以 防止其枯死。
11、， 同时每隔 3 天测定其沙土水分含量 ； （6） 沙土水分含量测定 取盆内沙表面以下5cm处样， 共取5个散点， 散点均匀分布， 取好的沙置于小烧杯内， 并 精确快速称取 10.0g， 在 75-85烘至恒温称重， 计算相对含水量， 计算公式如下 ： 相对含水量 （%） =（湿沙土重量 - 干沙土重量） *100/ 干沙土重量 ； （7） 根系测定材料准备 干旱处理时间 15-30 天后， 重复 3-5 次选取对照组和处理组水稻单株根系， 将沙粒洗 净， 待测 ； （8） 用WinRHIZO PRO 2009型根系图像分析系统测定总根长、 侧根长、 根系表面积、 根体 积及侧根数目， 可通过。
12、水稻次生根的根长、 根表面积、 根体积、 根尖数分布判定水稻的耐旱 性。 0005 本发明的有益效果 ： 本发明与生理生化指标鉴定方法相比， 次生根根系特征鉴定方法具有表型简单， 结果 准确， 易于筛选区分等优点。 附图说明 0006 图 1 为干旱胁迫处理组和对照组水稻土壤水分变化。 0007 图 2 为干旱胁迫处理组和对照组水稻根长分布图。 0008 图 3 为干旱胁迫处理组和对照组水稻根表面积分布。 0009 图 4 为干旱胁迫处理组和对照组水稻根体积分布。 0010 图 5 为干旱胁迫处理组和对照组水稻根尖数差异分布。 具体实施方式 0011 1.1 试验材料 本发明以含能显著提高水稻。
13、耐旱性的 CBF3 基因的转基因 3 材料和其对照不含 CBF3 基 因的转基因 5 NT 材料 （为转基因 3 的野生型） 为例进行说明， 该材料均由韩国明知大学生物 科学与生物信息学系提供。 0012 1.2 试验方法 （1） 水稻种子的消毒处理 分别取含CBF3基因的转基因3材料和其对照不含CBF3基因的转基因5 NT材料的新收 获、 饱满、 完整无虫蚀的不同材料水稻种子各 100 粒分别装入不同的网袋中， 再用 1.0mol/ LHNO3浸泡30min后， 用蒸馏水洗3次， 然后用10%的H2O2处理15min， 再用蒸馏水洗3次后， 待用 ； （2） 水稻种子的滤纸法催芽 将经步骤 。
14、（1） 消毒处理过的水稻种子取出， 放入铺有两层发芽纸的湿润的带盖培养皿 中， 再放入 25ml 去离子水， 置于 30左右 的恒温箱中浸种催芽， 直到根和芽的长度约为粒 说 明 书 CN 103563660 A 4 3/4 页 5 长的一半左右时， 停止催芽， 从恒温箱中取出供试验所用 ； （3） 用于水稻生长的细沙土壤盆钵的准备 市售黄沙， 用自来水清洗至澄清后， 放入白瓷托盘中， 置于干燥箱中， 130烘 30 分钟 至干燥， 冷却后过直径 4mm 和 1.5mm20mm 筛， 得到干燥均匀、 吸水性好的细沙土。将细沙 土放入铺 2 层滤纸的底部带孔的圆形盆钵 （市售） 的三分之二处 （。
15、圆形盆钵直径 20cm, 上部 直径 31cm, 盆深 33cm） , 再将该盆钵则放在宽 40cm、 长 60cm、 高 30cm 的长方形塑料盆 （市 售） 中， 塑料盆中可通过放入一定量的去离子水以控制土壤的含水量 ； （4） 移栽和苗期管理 取步骤 （2） 中的幼苗 5 颗均匀分散栽入如步骤 （3） 设置的盆钵中， 塑料盆中平均每 3 天 1 次放入一定量的营养液， 以保证水稻幼苗的正常生长， 全营养液参照菲律宾国际水稻所配 方 ； （5） 抽穗前期耐旱处理 抽穗前期开始进行干旱试验处理， 对照组则改营养液为加自来水， 使其正常生长， 干旱 处理组则停止加入营养液， 处理时间 15-3。
16、0 天 （必要时， 用喷洒少许自来水以防止其枯死） 。 同时每隔 3 天测定其沙土水分含量 ； （6） 沙土水分含量测定 取盆内沙表面以下5cm处样， 共取5个散点， 散点均匀分布， 取好的沙置于小烧杯内， 并 精确快速称取 10.0g， 在 80C烘至恒温称重， 计算相对含水量， 计算公式如下 ： 相对含水量 （%） =（湿沙土重量 - 干沙土重量） *100/ 干沙土重量 ； （7） 根系测定材料准备 干旱处理时间 15-30 天后， 重复 4 次选取对照组和处理组水稻单株根系， 将沙粒洗净， 待测 ； （8） 用WinRHIZO PRO 2009型根系图像分析系统测定总根长、 侧根长、 。
17、根系表面积、 根体 积及侧根数目。 0013 2、 结果与分析 2.1 土壤含水量测定 从图 1 中可以看出， 对照组和处理组的土壤含水量均随处理时间呈下降趋势， 其中对 照组含水量从 20% 下降到 16% 左右 （可能是抽穗期水稻对水的需求量增大的缘故） ， 干旱处 理的水分从 15% 下降 6%。幅度明显高于对照组， 因此， 适于做耐旱试验。 0014 2.2 根系总表面积和总长度 表 1 根系总表面积和总长度差异 从表 1 可以看出， 对照组和处理组， 根系总表面积和总长度差异不明显。 0015 2.3 根长分布 说 明 书 CN 103563660 A 5 4/4 页 6 从图 2 。
18、可以看出， 对照组， 0 L 0.5 和 0.5 L 1.0， 转基因 3 和转基因 5NT 的根 长分布差异不明显， 而对于处理组， 0 L 0.5 和 0.5 L 1.0 的次生根， 转基因 3 的根 长明显大于转基因 5NT。 0016 2.4 根表面积分布 从图 3 可以看出， 对照组， 0 L 0.5 和 0.5 L 1.0， 转基因 3 和转基因 5NT 的根 表面积分布差异不明显， 而对于处理组， 0 L 0.5 和 0.5 L 1.0 的次生根， 转基因 3 的根表面积明显大于转基因 5NT。 0017 2.5 根体积分布 从图 4 可以看出， 对照组， 0 L 0.5 和 0。
19、.5 L 1.0， 转基因 3 和转基因 5NT 的根 体积分布差异不明显， 而对于处理组， 0 L 0.5 和 0.5 L 1.0 的次生根， 转基因 3 的 根体积明显大于转基因 5NT。 0018 2.6 根尖数差异分布 从图5可以看出， 对照组， 0L0.5， 转基因3根体积分布小于转基因5NT， 而对于处 理组， 0 L 0.5 的次生根， 转基因 3 的根尖数明显大于转基因 5NT。 0019 结论 ： 耐旱处理后可通过水稻次生根的根长、 根表面积、 根体积、 根尖数分布判定 水稻的耐旱性。 说 明 书 CN 103563660 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103563660 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103563660 A 8 3/3 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 103563660 A 9 。