富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103495164 A (43)申请公布日 2014.01.08 CN 103495164 A (21)申请号 201310357325.0 (22)申请日 2010.12.24 201010621120.5 2010.12.24 A61K 39/39(2006.01) (71)申请人 国家纳米科学中心 地址 100190 北京市海淀区中关村北一条 11 号 申请人 中国疾病预防控制中心性病艾滋病 预防控制中心 (72)发明人 陈春英 邵一鸣 许利耕 郝彦玲 刘颖 刘野 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 郭广迅 (54) 发。

2、明名称 富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制 剂 (57) 摘要 本发明提供一种富勒烯衍生物， 所述富勒烯 衍生物是以通式C60OxHy(10yx50)表示的 富勒醇或以通式C60(C(COOH)2)n(n为1-4的整数) 表示的富勒烯羧基衍生物， 该富勒烯衍生物在溶 剂中的纳米颗粒物的直径范围为 1-400nm。本发 明还提供了所述富勒烯衍生物疫苗佐剂在疫苗领 域的应用， 其安全性好且能通过不同的免疫途径 显著提高疫苗的免疫原性， 具有极大的应用前景。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。

3、12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103495164 A CN 103495164 A 1/1 页 2 1. 一种富勒烯衍生物在制备用于提高疫苗的免疫原性的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述富勒烯衍生物是由以下分子式1表示 的富勒醇或以式 2 表示的富勒烯羧基衍生物 ： 式 1 ： C60OxHy， 其中， 10 y x 50 ； 优选地， x=y=10-50 ； 更优选地， x=y=15-25 ； 式 2 ： C60(C(COOH)2)n， 其中， n 为 1-4 的整数 ； 优选地， n=1-3 ； 更优选地。

4、， n=2。 3. 一种富勒烯衍生物在制备疫苗佐剂中的应用， 其特征在于， 所述富勒烯衍生物为以 下分子式 1 表示的富勒醇或以式 2 表示的富勒烯羧基衍生物 ： 式 1 ： C60OxHy， 其中， 10 y x 50 ； 优选地， x=y=10-50 ； 更优选地， x=y=15-25 ； 式 2 ： C60(C(COOH)2)n， 其中， n 为 1-4 的整数 ； 优选地， n=1-3 ； 更优选地， n=2。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述佐剂为富勒烯衍生物纳米颗粒溶液 制剂， 其中， 所述富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为 1-400nm。 5.。

5、根据权利要求3或4所述的应用， 其特征在于， 所述佐剂以以下方式对受试者进行免 疫 ： 1) 与疫苗同时混合后对受试者进行免疫 ； 2) 先为受试者注射该佐剂， 之后对受试者进行疫苗免疫 ； 或 3) 对受试者进行疫苗免疫后再注射该佐剂。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 所述佐剂与疫苗同时混合后对受试者进 行免疫。 7. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 所述佐剂与疫苗对受试者免疫的部位相 同或不同。 权 利 要 求 书 CN 103495164 A 2 1/7 页 3 富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂 0001 本申请是申请日为2010年12月24日、。

6、 申请号为201010621120.5、 发明名称为 “富 勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂” 的发明专利申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及一种富勒烯衍生物， 具体地说， 涉及富勒醇颗粒 C60OxHy(10 y x 50) 和富勒烯羧基衍生物 C60(C(COOH)2)n(n 为 1-4 的整数 ) 以及该富勒烯衍生物的疫苗 佐剂、 疫苗制剂和其在疫苗领域的应用， 属于生物技术和疫苗领域。 背景技术 0003 在预防和治疗重大疾病尤其是传染病方面， 疫苗发挥了极其重要的作用。在疫苗 的研究和开发过程中， 主要通过抗原和疫苗载体或佐剂的设计优化来获得安全有效的疫 苗。目前，。

7、 临床上唯一批准使用的佐剂为铝佐剂， 其能较好地促进机体的体液免疫水平， 在 疾病的预防过程中发挥了重要作用。然而， 铝佐剂在一定程度上抑制了机体的细胞免疫水 平， 同时其在注射部位能引起一定的炎症和过敏反应， 这些都在一定程度上限制了铝佐剂 在临床中的广泛应用。 目前研究开发的传统意义上的疫苗佐剂则由于安全性或有效性方面 的缺陷难以投入临床。 0004 在免疫反应的发生过程中， 抗原呈递细胞尤其是树突状细胞 (Dendritic cells,DC) 发挥着关键作用， 通过抗原呈递细胞的活化， 机体的细胞免疫和体液免疫反应得 以快速有效地发生。因此， DC 疫苗佐剂的研发成为目前人们关注的重点。

8、。 0005 近年来， 纳米技术的快速发展已渗透至各个领域。 纳米材料由于其粒径小、 比表面 积大而呈现出块体材料所不具备的新颖特性。同时纳米材料易进行表面修饰加工， 从而实 现不同的目的。这将为疫苗载体或佐剂的研发注入新的活力。 0006 富勒烯 C60是一种由碳原子构成的纳米尺度的球状分子， 具有独特的物理化学性 质， 在生物医学和材料科学领域具有极大的应用前景。 由于富勒烯本身属疏水性物质， 这极 大地限制了其在生物医学领域的应用。 近年来水溶性富勒烯及其衍生物的成功合成为其应 用提供了保证。 同时富勒烯衍生物在水环境体系中可通过与自身或其他物质的相互作用而 团聚成纳米颗粒物， 且其安全。

9、性问题得到了解决。 在众多的纳米材料中， 富勒烯衍生物尤其 是金属富勒醇 (GdC82(OH)22) 和富勒醇 (C60OxHy) 显示出良好的抗肿瘤活性 ( 专利申请号 ： 200610152170.7， 200710175456.1)。 同时研究发现金属富勒醇和富勒醇主要通过增强小鼠 机体的细胞免疫反应发挥其抑瘤作用， 且金属富勒醇可诱导树突状细胞的成熟， 且富勒烯 衍生物具有良好的生物安全性 (Ying Liu,Fang Jiao,Yang Qiu,et al.Biomaterials,200 9,30:3934-3945.Ying Liu,Fang Jiao,Yang Qiu,et a。

10、l.Nanotechnology,2009,20:415102 .De Yang,Yuliang Zhao,Hua Guo,et al.ACS Nano,2010,4:1178-1186.)。 发明内容 0007 本发明人在对富勒烯衍生物的研究过程中发现， 其可作为佐剂， 显著提高小鼠机 说 明 书 CN 103495164 A 3 2/7 页 4 体的细胞免疫和体液免疫水平。因此本发明的目的在于提供一种富勒烯衍生物， 在其表面 引入亲水基团， 如羟基 (-OH)、 羧基 (-COOH) 等， 能够解决富勒烯水溶性差的问题， 为其应用 奠定基础。本发明的另一个目的是提供所述富勒烯衍生物疫苗佐剂。

11、和疫苗制剂， 以及该富 勒烯衍生物在疫苗领域的应用， 其可以增强疫苗的免疫原性， 能够解决传统佐剂在安全性 和 / 或有效性方面的缺陷。 0008 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 0009 一方面， 本发明提供的一种富勒烯衍生物在制备用于基因传递的载体和 / 或用于 提高疫苗的免疫原性的药物中的应用。 0010 进一步， 所述富勒烯衍生物是由以下分子式 1 表示的富勒醇或以式 2 表示的富勒 烯羧基衍生物 ： 0011 式 1 ： C60OxHy， 其中， 10 y x 50 ； 优选地， x=y=10-50 ； 更优选地 x=y=15-25 ； 0012 式 2 ： C60(C(C。

12、OOH)2)n， 其中， n 为 1-4 的整数 ； 优选地， n=1-3 ； 更优选地， n=2。 0013 另一方面， 本发明提供的一种疫苗佐剂， 所述佐剂包含富勒烯衍生物， 该佐剂可以 与疫苗同时混合后对受试者进行免疫， 还可以先为受试者注射该佐剂， 之后对受试者进行 疫苗免疫， 或者可以对受试者进行疫苗免疫后再注 射该佐剂， 优选该佐剂与疫苗同时混合 后对受试者进行免疫。所述佐剂与疫苗对受试者免疫的部位相同或不同。 0014 进一步， 所述富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为 1-400nm。 0015 又一方面， 本发明提供的一种疫苗制剂， 所述制剂包含所述的疫苗佐剂。 00。

13、16 进一步， 所述疫苗包括， 但不限于 ： 艾滋病病毒疫苗、 乙型肝炎病毒疫苗和人乳头 状瘤病毒疫苗等重大传染病疫苗。本发明人以编码艾滋病病毒包膜蛋白基因的 (HIV-1 Env) 表达质粒 (DNA) 为研究对象， 比较了富勒烯衍生物作为佐剂对 HIV DNA 疫苗免疫原性 的影响， 发现该佐剂与 DNA 疫苗混合免疫小鼠后， 可显著增强 DNA 的免疫原性， 且在相同的 免疫次数情况下， 低剂量 DNA+ 佐剂和单独高剂量 DNA 引发的免疫反应水平无显著差异。同 时， 相同剂量的 DNA+ 佐剂在少免疫一次的情况下， 所引发的免疫反应水平和单独免疫 DNA 疫苗无显著差异。 0017 。

14、进一步， 所述疫苗制剂的免疫途径选自 ： 皮下注射、 滴鼻免疫、 腹腔注射、 肌肉注射 和皮内注射， 上述免疫途径均可发挥富勒烯衍生物的免疫佐剂作用。 0018 本发明提供的一种富勒烯衍生物疫苗佐剂与传统佐剂相比， 其有益效果如下 ： 0019 1本发明提供的疫苗佐剂安全性好， 对注射部位无明显的刺激作用 ； 0020 2 本发明提供的疫苗佐剂可显著提高机体的细胞免疫和体液免疫水平， 同时可减 少抗原的使用剂量或减少免疫次数 ； 0021 3 本发明提供的疫苗佐剂具有抗氧化和清除自由基的功能， 在充当免疫佐剂的同 时， 还可能提高机体抗氧化的防御能力， 使机体维持稳态。 附图说明 0022 以。

15、下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中 ： 0023 图 1 为本发明富勒醇的原子力显微镜表征图片 ； 0024 图 2 为本发明富勒醇的扫描电子显微镜表征图片 ； 0025 图 3 为本发明富勒醇的动态光散射仪检测结果 ； 说 明 书 CN 103495164 A 4 3/7 页 5 0026 图 4 为本发明富勒醇对 HEK(Human embryonic kidney)293 细胞活力的影响 ； 0027 图 5 为本发明富勒醇对 HEK293 细胞形态的影响 ； 0028 图 6 为本发明富勒醇对 NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell 。

16、line) 细胞 活力的影响 ； 0029 图 7 为本发明富勒醇对 NIH3T3 细胞形态的影响 ； 0030 图 8 为本发明富勒醇对 HEK293 细胞的转染效果， 其中荧光显微镜的放大倍数为 1620 ； 0031 图 9 为本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响 ； 0032 图 10 为本发明富勒醇对特异性抗体滴度的影响。 0033 图 11 为采用不同免疫途径时本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响。 具体实施方式 0034 下面结合具体的实施例， 并参照数据进一步详细描述本发明。 应理解， 这些实施例 只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0035 在以下的实。

17、施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相 同试剂如无特殊说明， 均以首次标明的内容相同。 0036 实施例 1 富勒醇 C60(OH)20的合成 0037 首先， 将1ml的40%四丁基氢氧化铵溶液(TBAH)和2ml氢氧化钠溶液(2.22g/ml) 加至 30ml 的 C60(Sigma 公司 ) 甲苯溶液 (1.5mg/ml) 中， 剧烈搅拌下反应 24h ； 弃去有机相， 并用真空旋转蒸发仪 (RV06-ML 1-B， 德国 ) 除去水相 ； 用 50ml 甲醇洗涤样品， 甲醇通。

18、过真 空蒸发除去， 如此反复洗涤 3-5 次 ； 之后， 将 10ml 去离子水加至样品中， 持续搅拌至溶液呈 透明的红棕色， 继续加入 20ml 去离子水， 并用 Sephadex G-25 色谱柱 (Amersham 公司， 英 国 ) 纯化样品， 最后真空干燥， 即可获得富勒醇纳米颗粒。通过调节氢氧化钠的加入量可获 得含不同数量羟基的富勒醇。 0038 利用原子力显微镜 (Atomic force microscopy， AFM)(BMT AFM3000, 德国 ) 和扫 描电子显微镜 (Scanning electron microscope， SEM)(S-4800， 日本日立公司 。

19、) 对所得富 勒醇进行表征， 结果如图 1 和图 2 所示， 富勒醇的平均粒径约为 120nm。 0039 利用动态光散射粒度分析仪 (DLS)(Zetasizer Nano， 英国马尔文公司 ) 检测所得 富勒醇的电位， 结果如图 3 所示， 富勒醇表面带负电荷， 平均电势约为 -51.6mv。 0040 利用 X 射线光电子能谱仪 (XPS, 日本电子株式会社 ) 对富勒醇所含的羟基数量进 行检测， 结果见表 1， 由表 1 可知羟基 (-OH) 数量为 ： (18.78/55.73)60=20。 0041 表 1 不同碳原子的 XPS 检测结果 0042 名称结合能峰位 (ev)面积百分。

20、数 (%) 无氧 C284.8055.73 C-O286.5918.78 C=O288.1912.78 O-C=O289.688.94 O-(C=O)-O291.693.77 0043 实施例 2 富勒醇对 HEK293 细胞 (ATCC) 活力的影响 说 明 书 CN 103495164 A 5 4/7 页 6 0044 1含富勒醇的完全培养基的配制 ： 0045 首先取实施例1中所得的富勒醇适量， 用无菌去离子水配制成2mM的水溶液 ； 之后 以完全 DMEM(Dulbecco s modification of Eagle s medium) 培养基 ( 含 10% 胎牛血 清， Gib。

21、co 公司 ) 将富勒醇水溶液稀释至 500M， 并以完全培养基进行梯度稀释， 从而获得 浓度为 500、 100、 20、 4、 0.8、 0.16M 的系列溶液， 备用。 0046 2富勒醇对 HEK293 细胞活力的影响 ： 0047 首先以 0.25% 胰酶消化 HEK293 细胞， 终止消化后， 以 1000rpm 进行离心 5min。用 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液， 并以5104/ml浓度接种于96孔板 中， 每孔 100l， 之后置于培养箱 (37、 5%CO2) 中培养 24h。分设空白对照组、 阴性对照组 和富勒醇试验组， 每组设三个平行孔。 弃。

22、去培养基， 之后分别将完全培养基和含富勒醇的完 全培养基加至孔中， 每孔 100l， 置于培养箱 (37、 5%CO2) 中培养 48h， 之后弃去培养基， 以磷酸盐 (PBS) 缓冲液洗涤 2 次， 最后加入含 10% 的 CCK-8(Cell counting kit-8， 日本岛 津公司)的含血清培养基， 每孔100l， 继续培养2h， 之后利用酶标仪(检测波长为450nm) 进行检测， 确定富勒醇对 HEK293 细胞活力的影响情况。 0048 3结果 ： 富勒醇对 HEK293 细胞活力的影响见图 4， 结果显示， 与阴性对照组相比， 富勒醇纳米颗粒处理细胞 48h 后， 细胞活力未。

23、发生明显变化， 即使在最高剂量组， 细胞活力 仍高于 90%。图 5 表示富勒醇对 HEK293 细胞形态的影响， 图 5A 为正常对照组， 图 5B 表示富 勒醇工作浓度为500M时处理细胞48h后的细胞图片， 可见试验组细胞形态与正常对照组 一样， 呈长 梭形。这些都说明， 实施例 1 所得的富勒醇具有良好的生物相容性。 0049 实施例 3 富勒醇对 NIH3T3 细胞 (ATCC) 活力的影响 0050 参照实施例 2 中所述的方法， 考察富勒醇纳米颗粒对 NIH3T3 细胞活力的影响情 况， 结果见图 6， 与实施例 2 中的结果类似， 与阴性对照组相比， 富勒醇纳米颗粒处理细胞 4。

24、8h 后， 细胞活力未发生明显变化， 即使在最高剂量组， 细胞活力仍高于 90%。图 7 表示富勒 醇对 NIH3T3 细胞形态的影响， 图 7A 为正常对照组， 图 7B 表示富勒醇工作浓度为 500M 时 处理细胞 48h 后的细胞图片， 可见试验组细胞形态与正常对照组一样， 呈长梭形。这些都说 明富勒醇具有良好的生物相容性。 0051 实施例 4 富勒醇对 HEK293 细胞的转染 0052 1富勒醇 -EGFP 质粒 ( 绿色荧光蛋白编码基因， Clontech 公司 ) 混合物的配制 ： 0053 首先取实施例1中所得富勒醇适量， 用无菌去离子水配制成2mM的水溶液 ； 用无血 清培。

25、养基分别将 6l 富勒醇水溶液 (2mM) 和 7.5L 的 EGFP 水溶液 (0.325g/l) 稀释 至 150l， 之后将稀释后的富勒醇溶液加至 EGFP 溶液中， 混合均匀， 室温下孵育 30min， 备 用。 0054 2聚乙二胺 (PEI)-EGFP 混合物的制备 ： 0055 用无血清培养基分别将 31.2l 的 PEI 水溶液 (100g/ml) 和 7.5L 的 EGFP 水 溶液 (0.325g/l) 稀释至 150l， 之后将 PEI 溶液加至 EGFP 溶液中， 混合均匀， 室温下 孵育 30min， 备用。 0056 3富勒醇转染 HEK293 细胞 ： 0057 。

26、首先以0.25%胰酶消化HEK293细胞， 终止消化后， 以1000rpm进行离心5min ； 用含 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液， 并以5104/ml浓度接种于24孔板中， 说 明 书 CN 103495164 A 6 5/7 页 7 每孔500l， 置于培养箱(37、 5%CO2)中培养24h ； 之后吸出原培养基， 每孔加入400l含 血清的培养基。 分设空白对照组、 裸EGFP质粒对照组、 富勒醇-EGFP混合物试验组和PEI阳 性对照组， 每组设 3 个平行孔。空白对照组加入含血清培养基 100l/ 孔， 裸 EGFP 质粒对 照组加入含有 EGFP 质粒 。

27、( 绿色荧光蛋白的质粒 DNA， Biovector-08， Clontech 公司 ) 的含 血清 DMEM 培养基 (EGFP 质粒的浓度为 8g/mL)100l/ 孔， 富勒醇 -EGFP 混合物试验组加 入上述配制的富勒醇 -EGFP 混合物 100l/ 孔， 阳性对照组加入 PEI-EGFP 混合物 100l/ 孔， 轻轻摇匀， 置于培养箱 (37、 5%CO2) 中继续培养， 并于 48h 后利用荧光显微镜观察转染 效果。 0058 4结果 ： 富勒醇对 HEK293 细胞的转染效果如图 8 所示， 图 8A 为裸 EGFP 对照组， 图 8B 为富勒醇 -EGFP 试验组， 图 。

28、8C 为 PEI 阳性对照组。由图可见， 裸 EGFP 质粒基本无转 染效果， 富勒醇则对细胞有一定的转染效果， 而阳性对照组则有较好的转染效果。 由于富勒 醇表面带负电荷， 而 DNA 表面亦呈负电， 因此其很难通过静电吸附作用结合在一起， 从而将 DNA 携带至细胞中。然而由于富勒烯本身尺寸很小 ( 小于 1nm)， 在不同的溶剂体系中， 其可 与自身或其他物质相互作用从而团聚形成较大粒径的颗粒物， 因此可通过控制溶剂体系的 不同得到不同尺寸的富勒烯或其衍生物， 而富勒烯衍生物在团聚过程中很可能将 DNA 包裹 起来， 从而使 DNA 免受降解， 同时可以轻松的进入细胞内部， 最终为翻译表。

29、达蛋白发挥其生 物学作用。 0059 实施例 5 富勒醇对小鼠机体免疫反应的影响 0060 本发明以编码艾滋病病毒包膜蛋白基因的(HIV-1 Env)表达质粒(DNA)为研究对 象， 比较了富勒烯衍生物作为佐剂对 HIV DNA 疫苗免疫原性的影响。 0061 1富勒醇 -HIV Env 质粒 DNA 混合物的制备方法 ： 0062 取实施例 1 中所得富勒醇适量， 用无菌注射水分别配制成 80M、 400M 和 2mM 的 溶液 ； 用无菌注射水将HIV Env质粒DNA(中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心病毒与免 疫研究室提供)稀释至800g/ml。 之后分别将不同浓度的富勒醇溶液200l。

30、与同体积的 HIV Env 质粒 DNA 溶液混合均匀， 室温下孵育 30min， 备用。 0063 2富勒醇对小鼠机体免疫反应的影响 ： 0064 将 40 只雌性 Balb/c 小鼠 (6-8 周龄， 北京维通利华动物实验技术有限公司 ) 随 机分为 5 组， 每组 8 只， 分为空白对照组、 裸 HIV Env 质粒 DNA 对照组、 富勒醇 -HIV Env 质 粒 DNA 试验组 ( 低、 中和高剂量组 ) ； 每只小鼠皮内注射 20g 的 HIV Env 质粒 DNA， 富勒醇 的剂量分别为 0.1、 0.5 和 2.5mol/kg ； 每隔两周免疫一次， 免疫体积为 50l， 免。

31、疫三次， 并于第三次免疫结束后 2 周摘眼球处死小鼠， 分离小鼠血清， 利用 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 方法检测富勒醇对抗体滴度的影响 ； 同时无菌采集小鼠脾脏， 分离 脾淋巴细胞， 利用酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 检测脾淋巴细胞分泌 IFN(Interferon)- 的情况， 确定富勒醇对小鼠机体细胞免疫水平的影响。 0065 3ELISPOT 方法检测免疫后小鼠的细胞免疫反应 ： 0066 (1) 小鼠脾淋巴细胞的制备 0067 . 摘眼球处死小鼠， 之后用 75% 酒精浸泡片刻， 置于无菌超净工作台中 ； 0068 . 无。

32、菌采集小鼠脾脏， 将脾脏置于折叠的无菌纱布 (2 层 ) 中， 并在含 5mL 的 RPMI1640 完全培养基 (Gibco 公司 )( 含 10% 胎牛血清， FBS) 的平皿中研磨脾脏， 之后吸取 说 明 书 CN 103495164 A 7 6/7 页 8 液体于 15ml 离心管中， 以 1000rpm 离心 5min ； 0069 . 弃去上清， 敲击沉淀物 ( 细胞 ) 使其均匀悬浮。加入 2ml 红细胞裂解液， 裂解 4-5min， 之后加入 6ml 含血清 1640 培养基终止裂解， 混匀后， 以 1000rpm 离心 5min ； 0070 .弃去上清， 再次敲击沉淀物使其。

33、均匀悬浮， 之后取适量悬浮液稀释10倍， 进行 细胞计数， 调整细胞浓度至 1107/ml。 0071 (2)ELISPOT 检测小鼠脾淋巴细胞分泌 IFN- 水平 ： 0072 .ELISPOT 板子的包被与封闭 ： 用无菌 PBS 以 1:200 比例稀释抗 IFN- 的抗体， 每孔100L， 置于CO2培养箱(5%， 37)中孵育2h， 之后弃去包被抗体， 用PBST(Phosphate buffered saline Tween-20) 洗涤 6 次， 最后， 每孔加入 200l 含 1%BSA(Bovine serum albumin) 的 PBS， 置于培养箱中 (5%CO2， 3。

34、7 ) 封闭 1h ； 0073 . 弃 去 封 闭 液，每 孔 加 入 100l 多 肽 ( 三 条 CN54Env 蛋 白 -CD8+T 细 胞 优 势 表 位 肽，氨 基 酸 序 列 为 ： CKEVHNVWATHACVPTDPNP ； SELYKYKVVEIKPLGIAPTA ； QQSNLLRAIEAQQHLLQLTV， 由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心提供， 每条多 肽浓度为10g/ml)和100l淋巴细胞悬液(1107/ml) ； 阴性对照组仅加入RPMI1640完 全培养基， 阳性对照组不加多肽， 加入 2.5l 的 PMA(Phorbol-12-myristate。

35、-13-acetate) (25ng/ml) 和 1l 的 Ionomycin( 离子霉素， Sigma 公司 )(1g/ml)， 试验组设 2 个复孔 ； 之后置于培养箱中 (5%CO2， 37 ) 培养 30h ； 0074 . 弃去细胞， 用 PBST 洗涤 8 次， 每次 2min， 之后每孔加入 100l 生物素化的抗 IFN- 的抗体， 封膜， 室温下避光孵育 2h ； 0075 . 弃 去 液 体，用 PBST 洗 涤 8 次，每 次 2min，每 孔 加 入 50l 的 GABA(-Aminobutyric acid) 溶液， 封膜， 室温下避光放置 1h ； 0076 . 弃。

36、去 GABA 溶液， 用 PBST 洗涤 6 次， 每次 2min。PBS 洗涤 2 次， 每次 2min， 之后 在吸水纸上将 ELISPOT 板子拍干 ； 0077 . 每孔加入 100l 显色液 ( 每 20l 显色剂与 1ml 显色底物混合 )， 室温下避 光反应 15-40min， 之后用蒸馏水冲洗， 终止反应 ； 0078 . 室温下晾干， 之后用 ELISPOT 读板仪 (Bioreader5000， 德国 Bio-Sys GmbH 公 司 ) 检测， 评价小鼠的细胞免疫水平。 0079 (3)ELISA 检测免疫后小鼠的体液免疫反应 ： 0080 . 用 HIV-1 B/C 重。

37、组毒株 CN54 重组 gp120 抗原蛋白 ( 纯度大于 95%) 包被酶标 板 (0.1g/ml)， 每孔加 0.1ml， 4过夜， 次日用 PBST 洗涤 3 次， 甩尽残余液体， 以抗体稀释 液封闭 60min， 之后 PBST 洗涤 3 次， 晾干后 4保存 ； 0081 . 将待检样品 ( 小鼠血清 ) 用 PBS 缓冲液进行倍比稀释 (1:250、 1:500、 1:1000 至 1:32000)， 之后每孔加入 100l， 同时设立空白对照组和阴性对照组， 37条件下孵育 1h ； 0082 . 弃去血清， 用 PBST 洗涤 8 次， 拍干， 用 PBS 将酶标二抗进行 1:。

38、5000 稀释， 每孔 加入 100l， 37条件下孵育 1h ； 0083 . 弃去二抗， 之后 PBST 洗涤 8 次， 拍干， 于各反应孔中加入临时配制的 TMB( 四 甲基联苯胺 ) 底物溶液 0.1ml， 37避光反应 10min， 待显色完全后加入 50l 的 2M 硫酸终 止反应。 说 明 书 CN 103495164 A 8 7/7 页 9 0084 . 利用酶标仪于 450nm 处 (630nm 为参考波长 )， 以空白对照孔调零后检测各孔 OD 值， 若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍， 即判定为阳性。 0085 4结果 ： 0086 图 9 和 10 分别为细胞。

39、免疫和体液免疫的检测结果。由图 9 可见， 与 HIVEnv 质粒 DNA 对照组相比， 富勒醇低剂量和中剂量试验组 IFN- 的分泌水平显著增强， 高剂量组水 平有所下降， 说明富勒醇对机体免疫反应的影响具有剂量依赖性， 低剂量即 0.1mol/kg 为最佳剂量， 且当富勒醇剂量为 0.1mol/kg， HIV Env 质粒 DNA 剂量为 4g/ 只时， 小鼠机 体细胞免疫水平与注射高剂量的 HIV Env 质粒 DNA(20g/ 只 ) 时的细胞免疫水平相当， 可 见富勒醇颗粒可以减少抗原的使用剂量， 这将极大的降低未来疫苗的成本， 具有重要的实 际意义。由图 10 可见， 与 HIV 。

40、Env 质粒 DNA 对照组相比， 富勒醇试验组 ( 低剂量组 ) 的抗 体滴度明显升高。这些都说明富勒醇作为一种新型免疫佐剂， 能更好地促进机体的细胞免 疫水平， 同时能提高机体产生的抗体滴度。 0087 此外， 富勒醇通过皮下注射、 腹腔注射、 肌肉注射和滴鼻免疫途径亦可以实现与皮 内注射途径类似的效果(图11)。 同时， 富勒烯羧基衍生物也具有与富勒醇颗粒同样的免疫 佐剂效果。 说 明 书 CN 103495164 A 9 1/5 页 10 图 1图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103495164 A 10 2/5 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103495164 A 11 3/5 页 12 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103495164 A 12 4/5 页 13 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103495164 A 13 5/5 页 14 图 11 说 明 书 附 图 CN 103495164 A 14 。