技术领域
本发明属于种植技术领域，具体涉及一种菌根化石斛苗茶树仿野生栽培方法。
背景技术
石斛为我国传统名贵中药材，我国历版药典均有记载。中药石斛的原植物为兰科 (Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)多年生草本植物。多年以来，商品石斛主要依靠野 生药用石斛资源，随着药用石斛开发利用的不断深入和国内外需求量的逐年增加，我国野 生药用石斛资源遭到了严重破坏，有些地区甚至面临枯竭。近年来，人们逐渐开始对石斛的 野生植物进行家种栽培、高产栽培技术等加以实践。
当前的人工栽培中，繁殖主要依靠分株繁殖和扦插繁殖，但该方法繁殖系数低，既 不经济，又限制了石斛的产量潜力，不便栽植管理推广，因而扩大种植面积受到抑制。许多 地方采用了组培繁殖方法以快速获得大量幼苗；由于石斛在组培繁殖时是在人工环境中进 行的，其药用价值远不及野生的铁皮石斛，因此很有必要采用野生的方法种植铁皮石斛。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对纯人工种植石斛所具有的药用价值的不足， 提供一种仿野生种植方法，以提高石斛的药用价值，提高经济效益。
本发明通过下述技术方案实现的。
一种菌根化石斛苗茶树仿野生栽培方法，其特征包括以下步骤：
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，将根段浸入1％次氯酸钙溶液中1-10min进行表面 灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，20-30 ℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后，挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接 于固体发酵培养基中，于2-30℃恒温培养5-50天后在菌落边缘打孔成菌片，直接使用或作 为菌根真菌种子菌种进一步接入液体或固体发酵培养基进行放大培养；
所述的分离培养基为：葡萄糖1-30g／L、蛋白胨1-10g／L、链霉素0.001-1g／L、研磨 过的缺齿蓑藓1-30g/L、干酪素水解物0.01-10g／L、琼脂1-30gg/L，pH值4-9；
所述的发酵培养基为：马铃薯20-300g／L、葡萄糖2-300g／L、缺齿蓑藓研磨物20- 300g／L、蛋白胨1-30g／L、硫酸铵0.1-20g／L、磷酸二氢钾0.1-20g/L、硫酸镁0.1-20g/L、氯化 锰0.1-20g/L，琼脂1-30g／L，pH值4-9；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用三角瓶或其他容器振荡或发酵罐通气暗 培养，培养结束后直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；发酵条件为：接种量6％-18％， 温度20-30℃，培养时间5-90h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量6％-18％，温度20-30℃下 发酵培养2-50天，待菌丝50％～100％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：采集野生石斛属带腋芽的幼茎，用75％的酒精浸 泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的氯化汞溶液浸泡1-10分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1- 3cm茎段接种到1／2MS+6-BA0.01-10mg／L+NAA0.01-10mg／L+研磨过的缺齿蓑藓1-200g／L+马 铃薯汁1-200g／L+蔗糖2-20g/L的琼脂培养基上；pH为4-9，在20-30℃，光照强度为1500- 2500Lx，光照12h／d，培养10-90天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝可切割重复培养，直至 长成完整试管苗供移栽；或将诱导出的原球茎接种到继代增殖液体培养基和继代增殖固体 培养基上交替培养，增殖培养10-60天为一个继代周期，培养温度20-30℃，光强度1500- 4000Lx，光照10-14小时／天；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯煮 汁2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g/L+活性炭0.1-10g／L+蔗糖2-50g／L，pH4-9；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯汁 2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g／L+活性炭0.1-10g/L+蔗糖2-50g/L+琼脂1-30g／L，pH4- 9；
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAA0.1-10mg／L+研磨过的缺齿蓑藓1-200g／L+香蕉匀浆20-200g／L+蔗糖 5-50g／L+活性炭0.1-10g/L+琼脂3-30g／L；培养温度20-30℃，pH4-9，培养3-90天，此时光照 加强至2500-4000Lx，光照10-14小时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养1-90天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼1-15天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡3-10分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的泥炭藓和／或缺齿蓑藓为栽培基质，以(1／3-1／10) knop5-30g／L+蔗糖1-30g／L+酒石酸铵0.01-30g／L+菌根真菌发酵液5-100mL／L为共生栽培 营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采 用温棚，温度控制在10-38℃，空气湿度为40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx， 浇水采取喷淋法，炼苗时间1-12个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：选择位于自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在 1000-5000Lx环境下的茶树树干；
B.石斛伴苔藓贴树种植：在茶树近根部树干和茶树根周围直径1-20cm处涂一层苔 藓混合物，厚度为0.1-10cm，培养5-20天后将小塑料盆中的石斛苗和苔藓基质一起移出绑 牢在向阳面茶树枝干苔藓部位，使种苗根系贴紧树干苔藓，基质下部紧贴树干周围苔藓混 合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；石斛捆绑在茶树上后，连续7天用共生营养液 对植株喷洒一次，润湿植株根系及附近苔藓；
所述的苔藓混合物(w／w)由(1／3-1／10)knop5-30、糯米5-20、发酵动物粪便10-70、 苔藓1-30、蔗糖1-10、酒石酸铵0.01-10、菌根真菌粉1-30；
C.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，采收时根部留2-3cm长根头，剪老留嫩。
所述步骤1中的A为：
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中1-10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根 段切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，20-30℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌 落后，挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于2-30℃恒温 培养5-50天后在菌落边缘打孔成菌片，直接使用或作为菌根真菌种子菌种进一步接入液体 或固体发酵培养基进行放大培养；
所述的分离培养基为：葡萄糖1-30g／L、蛋白胨1-10g／L、链霉素0.001-1g／L、研磨 过的缺齿蓑藓1-30g/L、干酪素水解物0.01-10g／L、琼脂1-30gg／L，pH值4-9；
所述的发酵培养基为：马铃薯20-300g／L、葡萄糖2-300g／L、缺齿蓑藓研磨物20- 300g/L、蛋白胨1-30g／L、硫酸铵0.1-20g／L、磷酸二氢钾0.1-20g／L、硫酸镁0.1-20g／L、氯化 锰0.1-20g/L，琼脂1-30g／L，pH值4-9；
所述步骤2中的A为：
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗5-15分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的 氯化汞溶液浸泡1-10分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA0.01- 10mg／L+NAA0.01-10mg／L+研磨过的缺齿蓑藓1-200g/L+马铃薯汁1-200g／L+蔗糖2-20g／L的 琼脂培养基上；pH为4-9，在20-30℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养10-90天，腋 芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝可切割重复培养，直至长成完整试管苗供移栽；或将诱导出 的原球茎接种到液体和固体增殖培养基上交替培养，增殖培养10-60天为一个继代周期，培 养温度20-30℃，光强度1500-4000Lx，光照10-14小时／天；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯煮 汁2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g/L+活性炭0.1-10g／L+蔗糖2-50g／L，pH4-9；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯汁 2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g/L+活性炭0.1-10g／L+蔗糖2-50g／L+琼脂1-30g／L，pH4- 9；
所述步骤5为：
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx；
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为每年3月10日-4月10日，或9月份次之；在茶树 近根部树干和茶树根周围直径1-20cm处涂一层苔藓混合物，厚度为0.1-10cm，培养5-20d后 将小塑料盆中的石斛苗和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓较多的部位，使种 苗根系贴紧树干苔藓，基质下部紧贴树干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘 米以上；石斛捆绑在茶树上后，连续7天在早上8点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植 株根系及附近苔藓，确保苔藓不能积水；
所述的苔藓混合物(w／w)由(1／3-1／10)knop5-30、糯米5-20、发酵动物粪便10-70、 苔藓1-30、蔗糖1-10、酒石酸铵0.01-10、菌根真菌粉1-30；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液1-12次；每天喷雾1-2次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝 条，以保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，收获适宜期为立冬后至清明之前，采收时 根部留2-3cm长根头，剪老留嫩，可以继续收获8年以上。
所述的苔藓包括泥炭藓、缺齿蓑藓、长叶纽藓、拟阔叶小石藓的一种或几种。
所述的捆绑材料为无纺布、遮阴网、鱼线、草绳、藤条的一种或几种。
实施例
实施例1
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中3min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段 切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，27℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后， 挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于5℃恒温培养40天 后在菌落边缘打孔成菌片，直接使用；
所述的分离培养基为：葡萄糖20g／L、蛋白胨8g／L、链霉素0.5g／L、研磨过的缺齿蓑 藓25g／L、干酪素水解物3g／L、琼脂19g／L，pH值4；
所述的发酵培养基为：马铃薯120g／L、葡萄糖180g／L、缺齿蓑藓研磨物100g／L、蛋 白胨8g／L、硫酸铵5g／L、磷酸二氢钾8g／L、硫酸镁12g／L、氯化锰02g／L，琼脂10g／L，pH值9；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用三角瓶培养，用匀浆机打碎培养产物备 用；发酵条件为：接种量12％，温度25℃，培养时间30h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量15％，温度25℃下发酵培 养40天，待菌丝90％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗5-15分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的 氯化汞溶液浸泡7分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA4mg／L+ NAA0.5mg／L+研磨过的缺齿蓑藓50g／L+马铃薯汁105g／L+蔗糖9g／L的琼脂培养基上；pH为6， 在22℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养70天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝 可切割重复培养，直至长成完整试管苗供移栽；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA3mg／L+NAA5mg／L+马铃薯煮汁80g／L+缺 齿蓑藓研磨物110g／L+活性炭6g／L+蔗糖37g／L，pH6；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA3mg／L+NAA7mg／L+马铃薯汁110g／L+缺齿 蓑藓研磨物90g／L+活性炭3g／L+蔗糖29g／L+琼脂20g／L，pH7；
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAA3mg／L+研磨过的缺齿蓑藓150g／L+香蕉匀浆120g／L+蔗糖30g／L+活性 炭5g／L+琼脂20g／L；培养温度25℃，pH5，培养10天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照10- 14小时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养30天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼1-15天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡8分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的缺齿蓑藓为栽培基质，以1／7knop20g／L+蔗糖28g／L+ 酒石酸铵22g／L+菌根真菌发酵液27mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼 苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在10-38℃，空气湿度 为40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时间1-12个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx；
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为每年3月10日-4月10日，在茶树近根部树干和 茶树根周围直径10cm处涂一层苔藓混合物，厚度为3cm，培养10天后将小塑料盆中的石斛苗 和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓较多的部位，使种苗根系贴紧树干苔藓， 基质下部紧贴树干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；用无纺布将石 斛捆绑在茶树上后，连续7天在早上8点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系及 附近苔藓，确保苔藓不能积水；
所述的苔藓混合物由1／9knop10g、糯米14g、发酵动物粪便40g、泥炭藓25g、蔗糖 3g、酒石酸铵2g、菌根真菌粉25g；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液5次；每天喷雾1-2次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝条， 以保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，收获适宜期为立冬后至清明之前，采收时 根部留2-3cm长根头，剪老留嫩，可以继续收获8年以上。
实施例2
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中7min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段 切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，26℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后， 挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于8℃恒温培养40天 后在菌落边缘打孔成菌片，作为菌根真菌种子菌种进一步接入液体发酵培养基进行放大培 养；
所述的分离培养基为：葡萄糖15g／L、蛋白胨13g／L、链霉素0.3g／L、研磨过的缺齿 蓑藓10g／L、干酪素水解物3g／L、琼脂23g／L，pH值4.5；
所述的发酵培养基为：马铃薯250g／L、葡萄糖100g／L、缺齿蓑藓研磨物220g／L、蛋 白胨21g／L、硫酸铵11g／L、磷酸二氢钾14g／L、硫酸镁10g／L、氯化锰10g／L，琼脂18g／L，pH值 7；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用发酵罐通气暗培养，培养结束后直接使 用；发酵条件为：接种量10％，温度25℃，培养时间70h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量10％，温度28℃下发酵培 养30天，待菌丝80％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗5-15分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的 氯化汞溶液浸泡3分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA2mg／L+ NAA5mg／L+研磨过的缺齿蓑藓110g／L+马铃薯汁160g／L+蔗糖14g／L的琼脂培养基上；pH为6， 在27℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养50天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝 可切割重复培养，直至长成完整试管苗供移栽；增殖培养20天为一个继代周期，培养温度23 ℃，光强度1500-4000Lx，光照10-14小时／天；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA3mg／L+NAA7mg／L+马铃薯煮汁160g／L+缺 齿蓑藓研磨物180g／L+活性炭5g／L+蔗糖32g／L，pH5；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯汁 2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g／L+活性炭0.1-10g／L+蔗糖2-50g／L+琼脂1-30g／L，pH4-9
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAA7mg／L+研磨过的缺齿蓑藓130g／L+香蕉匀浆170g／L+蔗糖19g／L+活性 炭3g／L+琼脂17g／L；培养温度25℃，pH8，培养40天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照10- 14小时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养50天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼8天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡3-10分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的泥炭藓和缺齿蓑藓为栽培基质，以1／8knop20g／L+ 蔗糖21g／L+酒石酸铵3g／L+菌根真菌发酵液70mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培 容器分级炼苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在10-38 ℃，空气湿度为40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时 间1-12个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx；
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为9月份；在茶树近根部树干和茶树根周围直径 18cm处涂一层苔藓混合物，厚度为6cm，培养16天后将小塑料盆中的石斛苗和苔藓基质一起 移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓较多的部位，使种苗根系贴紧树干苔藓，基质下部紧贴树 干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；用遮阴网将石斛捆绑在茶树上 后，连续7天在早上8点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系及附近苔藓，确保苔 藓不能积水；
所述的苔藓混合物由1／4knop18g、糯米13g、发酵动物粪便50g、缺齿蓑藓8g、蔗糖 5g、酒石酸铵3g、菌根真菌粉7g；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液7次；每天喷雾1-2次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝条， 以保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，收获适宜期为立冬后至清明之前，采收时 根部留2-3cm长根头，剪老留嫩，可以继续收获8年以上。
实施例3
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中1-10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根 段切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，20-30℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌 落后，挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于23℃恒温培 养30天后在菌落边缘打孔成菌片，作为菌根真菌种子菌种进一步接入液体；
所述的分离培养基为：葡萄糖8g／L、蛋白胨4g／L、链霉素0.02g／L、研磨过的缺齿蓑 藓18g／L、干酪素水解物3g／L、琼脂7g／L，pH值4；
所述的发酵培养基为：马铃薯100g／L、葡萄糖120g／L、缺齿蓑藓研磨物100g／L、蛋 白胨1-30g／L、硫酸铵5g／L、磷酸二氢钾2g／L、硫酸镁7g／L、氯化锰5g／L，琼脂10g／L，pH值4；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用三角瓶，用匀浆机打碎培养产物备用；发 酵条件为：接种量8％，温度28℃，培养时间59h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量8％，温度23℃下发酵培养 20天，待菌丝60％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗12分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的氯 化汞溶液浸泡8分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA8mg／L+ NAA4mg／L+研磨过的缺齿蓑藓50g／L+马铃薯汁100g／L+蔗糖8g／L的琼脂培养基上；pH为8，在 20-30℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养20天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新 枝可切割重复培养，直至长成完整试管苗供移栽；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA3mg／L+NAA4mg／L+马铃薯煮汁80g／L+缺 齿蓑藓研磨物60g／L+活性炭9g／L+蔗糖30g／L，pH7；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA3mg／L+NAA2mg／L+马铃薯汁10g／L+缺齿 蓑藓研磨物50g／L+活性炭3g／L+蔗糖20g／L+琼脂15g／L，pH6；
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAAlmg／L+研磨过的缺齿蓑藓10g／L+香蕉匀浆120g／L+蔗糖10g／L+活性炭 2g／L+琼脂5g／L；培养温度25℃，pH5，培养30天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照10-14小 时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养10天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼10天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡5分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的缺齿蓑藓为栽培基质，以1／8knop10g／L+蔗糖5g／L+酒 石酸铵1g／L+菌根真菌发酵液50mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼苗， 取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在10-38℃，空气湿度为 40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时间8个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx：
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为9月份；在茶树根周围直径10cm处涂一层苔藓 混合物，厚度为1cm，培养10天后将小塑料盆中的石斛苗和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面 茶树枝干苔藓较多的部位，使种苗根系贴紧树干苔藓，基质下部紧贴树干周围苔藓混合物 涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；用鱼线将石斛捆绑在茶树上后，连续7天在早上8 点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系及附近苔藓，确保苔藓不能积水；
所述的苔藓混合物由1／5knop15g、糯米8g、发酵动物粪便60g、长叶纽藓13g、蔗糖 3g、酒石酸铵1d、菌根真菌粉13g；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液10次；每天喷雾1-2次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝 条，以保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，收获适宜期为立冬后至清明之前，采收时 根部留2-3cm长根头，剪老留嫩。
实施例4
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段 切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，20℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后， 挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于2℃恒温培养50天 后在菌落边缘打孔成菌片，作为菌根真菌种子菌种进一步接入固体发酵培养基进行放大培 养；
所述的分离培养基为：葡萄糖30g／L、蛋白胨1g／L、链霉素1g／L、研磨过的缺齿蓑藓 10g／L、干酪素水解物0.01g／L、琼脂1g／L，pH值4；
所述的发酵培养基为：马铃薯20g／L、葡萄糖20g／L、缺齿蓑藓研磨物20g／L、蛋白胨 10g／L、硫酸铵0.2g／L、磷酸二氢钾0.2g／L、硫酸镁0.1g／L、氯化锰20g／L，琼脂30g／L，pH值4；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用发酵罐通气暗培养，培养结束后直接使 用；发酵条件为：接种量6％％，温度20℃，培养时间90h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量18％，温度20-30℃下发酵 培养50天，待菌丝50％％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗5-15分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的 氯化汞溶液浸泡1分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA10mg／L+ NAA0.01mg／L+研磨过的缺齿蓑藓10g／L+马铃薯汁10g／L+蔗糖2g／L的琼脂培养基上；pH为4， 在20-30℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养10天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状， 将诱导出的原球茎接种到液体和固体增殖培养基上交替培养，增殖培养10天为一个继代周 期，培养温度20-30℃，光强度1500-4000Lx，光照10-14小时／天；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA10mg／L+NAA0.1mg／L+马铃薯煮汁20g／L+ 缺齿蓑藓研磨物10g／L+活性炭1g／L+蔗糖25g／L，pH4.9；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1mg／L+NAA0.1mg／L+马铃薯汁200g／L+ 缺齿蓑藓研磨物1g／L+活性炭10g／L+蔗糖2g／L+琼脂1g／L，pH4；
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAA0.1mg／L+研磨过的缺齿蓑藓200g／L+香蕉匀浆20g／L+蔗糖50g／L+活性 炭0.1g／L+琼脂30g／L；培养温度20-30℃，pH4，培养3天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照 10-14小时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养1天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼1-15天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡3分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的泥炭藓为栽培基质，以1／10knop30g／L+蔗糖30g／L+酒 石酸铵0.01g／L+菌根真菌发酵液5mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼 苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在10-38℃，空气湿度 为40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时间1个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx；
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为每年3月10日-4月10日；在茶树近根部树干和 茶树根周围直径1cm处涂一层苔藓混合物，厚度为10cm，培养5天后将小塑料盆中的石斛苗 和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓较多的部位，使种苗根系贴紧树干苔藓， 基质下部紧贴树干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；用草绳将石斛 捆绑在茶树上后，连续7天在早上8点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系及附 近苔藓，确保苔藓不能积水；
所述的苔藓混合物由1／10knop30g、糯米5g、发酵动物粪便70g、拟阔叶小石藓30g、 蔗糖10g、酒石酸铵10g、菌根真菌粉1g；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液1次；每天喷雾1次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝条，以 保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后2年清明之前采收，采收时根部留2-3cm长根头，剪老留嫩。
实施例5
步骤1：菌根真菌的发酵培养
A.选取野生石斛的新鲜营养根，用流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物；在超净工作 台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段 切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，30℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后， 挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于30℃恒温培养5天 后在菌落边缘打孔成菌片，直接使用；
所述的分离培养基为：葡萄糖30g／L、蛋白胨1g／L、链霉素0.001g／L、研磨过的缺齿 蓑藓1g／L、干酪素水解物10g／L、琼脂30g／L，pH值9；
所述的发酵培养基为：马铃薯300g／L、葡萄糖2g／L、缺齿蓑藓研磨物20g／L、蛋白胨 1g／L、硫酸铵0.1g／L、磷酸二氢钾20g／L、硫酸镁0.1g／L、氯化锰0.1g／L，琼脂30g／L，pH值4- 9；
B.液体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用三角瓶振荡培养，培养结束后直接使用； 发酵条件为：接种量6％，温度20℃，培养时间90h；
C.固体发酵培养
将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量6％％，温度20℃下发酵培 养50天，待菌丝100％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块；
步骤2：石斛组培苗的培养
A.原球茎诱导及继代增殖培养：在3-4月上旬，采集野生的石斛属带腋芽的幼茎， 用流水冲洗5-15分钟后在超净工作台上用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的 氯化汞溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA10mg／L+ NAA0.01mg／L+研磨过的缺齿蓑藓200g／L+马铃薯汁1g／L+蔗糖2g／L的琼脂培养基上；pH为9， 在30℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养90天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝 可切割重复培养，将诱导出的原球茎接种到液体和固体增殖培养基上交替培养，增殖培养 60天为一个继代周期，培养温度20-30℃，光强度1500-4000Lx，光照10-14小时／天；
所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA10mg／L+NAA0.1mg／L+马铃薯煮汁200g／L +缺齿蓑藓研磨物1／L+活性炭0.1g／L+蔗糖2g／L，pH4；
所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1mg／L+NAA10mg／L+马铃薯汁200g／L+ 缺齿蓑藓研磨物200g／L+活性炭10g／L+蔗糖2g／L+琼脂30g／L，pH9；
B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根 培养基为：1／2MS+NAA10mg／L+研磨过的缺齿蓑藓200g／L+香蕉匀浆20g／L+蔗糖5g／L+活性炭 0.1g／L+琼脂30g／L；培养温度30℃，pH4，培养90天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照10- 14小时／天；
步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗 接入菌根真菌固体菌块中共生培养90天，在自然条件下培养；
步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法
A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼15天；
B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸 泡3-10分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的泥炭藓为栽培基质，以1／3knop5g／L+蔗糖1g／L+酒 石酸铵0.01g／L+菌根真菌发酵液5mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼 苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在38℃，空气湿度为 85％，遮阴度70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时间12个月；
步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法
A.茶树的选择：茶地附近需有符合国家二级标准的水源，常年平均气温在10℃至 20℃，空气相对温度在45％至85％之间，年均降雨量为800毫米至1800毫米；茶园向阳坡面 的坡度大于5-20度，生长10年以上的茶园；定植前先要进行适当修枝打叶，使栽培石斛的树 干处自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx；
B.石斛伴苔藓贴树种植：栽种时间为每年3月10日-4月10日；在茶树近根部树干和 茶树根周围直径20cm处涂一层苔藓混合物，厚度为0.1cm，培养20天后将小塑料盆中的石斛 苗和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓较多的部位，使种苗根系贴紧树干苔 藓，基质下部紧贴树干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；用藤条将 石斛捆绑在茶树上后，连续7天在早上8点前用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系 及附近苔藓，确保苔藓不能积水；
所述的苔藓混合物由1／3knop5g、糯米20g、发酵动物粪便10g、拟阔叶小石藓1g、缺 齿蓑藓4g、蔗糖1g、酒石酸铵0.01g、菌根真菌粉30g；
C.仿生石斛茶地种植管理：每年应除草2-3次，除去杂草和枯枝落叶；每年喷共生 营养液12次；每天喷雾1次水，湿度控制在60-80％，冬春季适时剪去附主植株过密的枝条， 以保证遮光度在70-80％，病虫害高发时每旬可喷施一次植物源生物杀虫剂；
D.石斛的采收：栽种后1年立冬时采收，采收时根部留2-3cm长根头，剪老留嫩。
试验例：对足趾角叉菜胶所致急性炎症的抑制作用
水溶性提取物的制备方法：采用实施例1～5所得的石斛及市售人工培养石斛进行 榨汁。
实验方法：大鼠随机分组，每组10只，于致炎前1小时灌胃给药(2g生药／kg)，无菌 操作，给大鼠右后足趾腱膜下注射10％角叉菜胶0.1m1致炎，用排水法测定致炎前及致炎后 不同时间的右后足趾容积，以致炎前后的足容积差值为肿胀值，根据肿胀值计算肿胀率及 抑制率。实验结果见下表1：
肿胀率％=En-E0／En×100
En=致炎后不同时间的肿胀值
E0=致炎前的肿胀值
抑制率％=C-T／C×100
C=对照组的肿胀率
T=治疗组的肿胀率
表1不同石斛水溶性提取物对大鼠足趾角叉菜胶所致急性炎症的抑制作用
*：p<0.05；**：p<0.01
以上实验结果显示：采用本发明所得石斛制得的水溶性提取物相对市售品具有更 好地急性炎症作用。