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1、(10)授权公告号 CN 101461543 B (45)授权公告日 2012.02.08 CN 101461543 B *CN101461543B* (21)申请号 200710159035.X (22)申请日 2007.12.19 A23L 1/312(2006.01) A23L 1/313(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 专利权人 抚顺市九九鹿业有限责任公司 (72)发明人 邹汉法 靳艳 唐树友 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理。
2、人 马驰 周秀梅 CN 1616655 A,2005.05.18, 全文 . 宜振安 . 猪血的综合利用 .沈阳师范学 院学报 ( 自然科学版 ) .1997, 第 15 卷 ( 第 1 期 ),50-52. 凌敏等 . 猪血超氧化物歧化酶、 血红素和 蛋白胨分离制备的研究 .广西医科大学学 报 .2005, 第 22 卷 ( 第 3 期 ),363-364 页， 1.2 节 . 张兰杰等 . 鹿血红细胞 Cu,Zn-SOD 的纯化及 部分性质研究 . 特产研究 .2005,( 第 1 期 ),5-6 页， 2.1 节 . 陈晓燕 . 鹿血血浆和血球蛋白粉加工工艺研 究 . 西南农业大学学报 。
3、（自然科学版） .2003, 第 25 卷 ( 第 4 期 ),375 页 1.3 节 . (54) 发明名称 一种鹿血深加工方法 (57) 摘要 本发明涉及动物血液处理， 具体地说是一种 鹿血深加工方法， 本发明以传统保健滋补品鹿血 为原料， 结合中医传统中有关鹿血的滋补功效， 建立了具有抗氧化、 抗衰老功能的超氧化歧化酶 (superoxide dismutase， 简称 SOD)、 补血功能的 血红素和降血压、 增强免疫力功能的活性肽的制 备方法， 其以新鲜的鹿血为原料， 首先取 1 2 升 鹿血， 在 4、 3000 15000 转 / 分钟转速下离心 0.1 2 小时， 沉淀血细胞用。
4、于制备 SOD 和血红 素、 上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽 ； 本发 明将几种活性组分提取和制备工艺集成， 保留并 提高了鹿血所有已知和未知的活性组分， 与传统 鹿血全血直接食用相比， 功能明确的鹿血活性组 分更具有应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 田红梅 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101461543 B1/1 页 2 1. 一种鹿血深加工方法， 其特征在于 ： 以新鲜的鹿血为原料， 首先取12升鹿血， 在4、 300015000转/分钟转速下离心 0.1 2 小时， 沉淀血细胞用于制备 S。
5、OD 和血红素、 上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽 ； (1)SOD 和血红素的制备 沉淀的血细胞中加入鹿血等体积的去离子水静置过夜， 再加入 0.5 2 倍去离子水 体积的体积比为12-4的乙醇/氯仿混合液搅拌1050分钟后， 静置并以100010000 转 / 分钟的转速离心 10 分钟， 上清在 50 80加热 10 50 分钟后离心 10 分钟， 上清即 为 SOD 粗品， 沉淀为血红素粗品 ； SOD 粗品加入 2 倍鹿血体积的丙酮并搅拌后静置 5-10 分钟， 过滤， 沉淀加入丙酮等 体积的蒸馏水溶解后， 于 2000 10000 转 / 分钟的转速离心 10 50 分钟， 上清冷。
6、冻干燥 后用 0.05 1M、 pH 6 9 的磷酸缓冲液溶解， 上 SephadexG-75 凝胶柱纯化， 得到精制的 鹿血 SOD 组分 ； 血红素粗品加入与沉淀血细胞等体积的 NaHSO3溶液， NaHSO3溶液的终质量浓度为 0.1 1， 搅拌均匀后加入 1 5 倍 NaHSO3溶液体积的丙酮， 用 0.1-1M 盐酸调 pH 至 1 4， 过滤， 滤液中加入质量浓度 5-50氨水调 pH 至 4.5 8， 沉淀水洗后冷冻干燥为精制鹿 血血红素 ； (2) 活性肽的制备 将鹿血上清经化学或热变性、 冷冻干燥后， 用pH29的磷酸缓冲液溶解配成重量浓度 1 50的溶液加入蛋白水解酶， 干。
7、燥的血浆蛋白与酶的重量比为 10 500 1， 在 20 80温度下酶解 0.5 24 小时， 再冷冻干燥得到粉末状鹿血活性肽 ； 活性肽检测具有血管 紧张素转化酶抑制活性和免疫增强活性。 2. 按照权利要求 1 所述鹿血深加工方法， 其特征在于 ： 所述化学变性过程为 ： 于鹿血上清中加入尿素至终浓度为 8-10mol/L， 搅拌 10-20 分 钟 ； 所述热变性过程为 ： 将鹿血上清加热至 60-100， 10-60 分钟。 3. 按照权利要求 1 所述鹿血深加工方法， 其特征在于 ： 所述蛋白水解酶为胃蛋白酶、 胰 蛋白酶、 风味蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 碱性蛋白酶或中性蛋白酶。 权 利。
8、 要 求 书 CN 101461543 B1/4 页 3 一种鹿血深加工方法 技术领域 0001 本发明涉及动物血液处理， 具体地说是一种鹿血深加工方法。 背景技术 0002 鹿血自古以来一直是珍贵的滋补品， 中国历代的 本草纲目 、本草新编 等本草 书籍都有鹿血药用价值的记载。 鹿血用于健身最早见于宋代 清波杂志 ， 明朝李时珍的 本 草纲目 对鹿血的医疗作用作了详细记载 ：“主阳痿、 补虚、 止腰痛、 跌伤、 狂犬伤， 和酒服制 肺痿吐血， 及崩中带下， 诸气痛欲危者饮之立愈。大补虚损， 益精血、 解痘毒、 药毒。我国古 代早至宋朝起， 皇宫贵族就养鹿取血生饮， 但这种食用方式限制了鹿血的。
9、食用人群， 亟待开 发出食用方便、 功效明确的鹿血保健品， 使鹿血这一皇室滋补品走入寻常百姓家庭。 0003 鹿血的主要成分血浆和血细胞， 血浆中除水外还含有蛋白质、 无机盐、 葡萄糖及激 素等组分。鹿血中含有丰富的蛋白质， 含量达到 13。与人血清数据相比鹿血中锌和铁 的含量显著提高 ( 参考文献 1 ： 宋胜利， 葛志广， 梅花鹿血液微量元素与蛋白组分， 中药材， 1999， 22(8) ： 382-383)， 锌的含量是人血的两倍以上。锌是人体所必需的重要微量元素， 参 与人体免疫功能， 不仅显著影响免疫功能还影响胰岛素、 生长素和性激素等人体重要激素 的分泌， 鹿血的益精血等活性与其高。
10、含量的锌密切相关。 锌还是超氧化歧化酶(superoxide dismutase， 简称 SOD) 的金属配基， 鹿血中含量丰富的锌元素预示着其 SOD 含量也很丰富。 SOD 是目前应用较广泛的一种生物酶， 它的主要功能是特异性地清除体内生成过多的强氧 化性物质和致衰老因子 - 超氧自由基， 调节体内的氧化代谢和抗衰老功能。此外超氧化歧 化酶具有抗辐射污染和消炎作用， 且极易透过皮肤被吸收， 它对酪氨酸酶诱发的黑色素有 重要的抑制作用， 对老年斑、 雀斑、 面部黄褐斑等皮肤色素沉积症有显著疗效， 因此超氧化 歧化酶是目前化妆品行业中研究最多、 应用最广的一种生物酶。SOD 作为一种药用酶， 。
11、在医 药界、 生物界和食品界和化妆品行业中具有广阔的应用前景， 临床上的应用主要集中在抗 辐射、 抗肿瘤、 抗衰老及自身免疫性疾病等方面。 0004 鹿血中铁含量是人血的十倍。鹿血中的铁以有机铁的形式存在， 易于为人体所吸 收， 鹿血的补血活性与其高含量的有机铁相关， 鹿血血红素将是很好的补血良药血红素也 叫铁卟啉、 血红素铁或氯化血红素， 动物血来源的血红素是用于防治缺铁性贫血的， 具有吸 收好副作用小的优点， 是纯天然的生物铁剂， 广泛应用于药品及保健品。 0005 鹿血中蛋白质含量占 13以上， 是鹿血中的主要成分。蛋白质是由肽组成的， 具 有生理作用的肽类化合物称为功能肽或生物活性肽，。
12、 活性肽具有抗氧化、 降血压、 提高免疫 力、 抗肿瘤、 促进矿物质吸收等活性， 用不同来源的蛋白质制备具有各种功能的活性肽已成 为该领域的研究热点。具有保健功能的鹿血中丰富的蛋白质是非常理想的制备活性肽原 料。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种鹿血深加工方法， 本发明是一个多技术的集成， SOD、 血 说 明 书 CN 101461543 B2/4 页 4 红素和活性肽的提取制备相互不影响， 可同时获得三种活性组分， 所获得的三种活性组分 又与中草药书中有关鹿血的功效相对应。 0007 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0008 本发明通过离心的方法首先将具有免疫功能。
13、的血浆蛋白分离， 这样既可利用血浆 蛋白制备活性肽， 又使后续 SOD、 血红素的分离纯化更方便、 更容易， 所得到的产品纯度更 高。 0009 一种鹿血深加工方法， 具体过程为 ： 0010 以新鲜的鹿血为原料， 首先取 1 2 升鹿血， 在 4、 3000 15000 转 / 分钟转速 下离心 0.1 2 小时， 沉淀血细胞用于制备 SOD 和血红素、 上清为鹿血血浆蛋白用于制备活 性肽 ； 0011 (1)SOD 和血红素的制备 0012 沉淀的血细胞中加入鹿血等体积的去离子水静置过夜， 再加入 0.5 2 倍去离 子水体积的体积比为 1 2-4 的乙醇 / 氯仿混合液搅拌 10 50 。
14、分钟后静置， 并以 1000 10000 转 / 分钟的转速离心 10 分钟， 上清在 50 80加热 10 50 分钟后离心 10 分钟， 上清即为 SOD 粗品， 沉淀为血红素粗品 ； 0013 SOD 粗品加入 2 倍鹿血体积的丙酮并搅拌后静置 5-10 分钟过滤， 沉淀加入丙酮 等体积的蒸馏水溶解后， 于 2000 10000 转 / 分钟的转速离心 10 50 分钟， 上清冷冻干 燥后用 0.05 1M、 pH 6 9 的磷酸缓冲液溶解， 上 Sephadex G-75( 进口， 北京金欧亚科 技发展有限公司分装 ) 凝胶柱纯化， 得到精制的鹿血 SOD 组分 ； 0014 血红素粗。
15、品加入与沉淀血细胞等体积的 NaHSO3溶液， NaHSO3溶液的终质量浓度 为0.11， 搅拌均匀后加入15倍NaHSO3溶液体积的丙酮用0.1-1M盐酸调pH至1 4， 过滤， 滤液中加入质量浓度 5-50氨水调 pH 至 4.5 8， 沉淀水洗后冷冻干燥为精制鹿 血血红素 ； 0015 (2) 活性肽的制备 0016 将鹿血血浆蛋白经化学或热变性、 冷冻干燥后， 用pH29的磷酸缓冲液溶解配成 重量浓度150的溶液加入蛋白水解酶， 干燥的血浆蛋白与酶的重量比为105001， 在 20 80温度下酶解 0.5 24 小时， 再冷冻干燥得到粉末状鹿血活性肽 ； 活性肽检测 具有血管紧张素转化。
16、酶抑制活性和免疫增强活性。 0017 所述化学变性过程为 ： 于鹿血血浆蛋白中加入尿素至终浓度为 8-10mol/L， 搅拌 10-20 分钟 ； 0018 所述热变性过程为 ： 将鹿血血浆蛋白加热至 60-100 10-60 分钟。 0019 所述蛋白水解酶为胃蛋白酶、 胰蛋白酶、 风味蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 碱性蛋白酶或 中性蛋白酶。 0020 本发明具有如下优点 ： 0021 1. 溶血前将血浆蛋白分离。本发明将新鲜鹿血通过离心将血细胞和血将进行分 离， 血浆蛋白是制备活性肽良好的蛋白质源 ； 除去血浆蛋白的血细胞用于制备 SOD 和血红 素， 使 SOD、 血红素的分离分离纯化更容易，。
17、 所得产品纯度更高。 0022 2. 多组分提取制备技术集成。本发明将鹿血 SOD、 血红素和活性肽的几个组分的 提取制备工艺集成， 通过该工艺可同时获得具有抗氧化、 抗衰老的 SOD、 补血的血红素和降 说 明 书 CN 101461543 B3/4 页 5 血压、 增强免疫力的活性肽物质。 0023 3.反应条件温和、 方法简便可行。 本发明通过活性肽的制备是通过酶解的方法， 反 应条件温和， 既可制备活性肽又可保留鹿血中原有的活性组分， 反应方法简单可行。 0024 4. 具有良好的应用前景。本发明按照传统滋补保健品鹿血的功效， 将鹿血按照功 能活性进行了组分精制， 与直接食用鹿血相比，。
18、 通过本工艺制得的活性成分更容易被人体 吸收、 食用更方便， 因此作为保健食品具有广泛的应用前景。 具体实施方式 0025 本发明将鹿血直接进行分离， 制备成具有不同功能的活性组分 ： (1) 抗氧化、 抗衰 老组分的鹿血SOD ； (2)具有补血功能的鹿血血红素 ； (3)具有降血压、 增强免疫力功能的鹿 血活性肽。该工艺保留并提高了鹿血中固有的活性功能， 按照功能活性进行分离纯化使各 组分的应用对象更为明确， 并将几种提取方法的优化集成。 0026 实施例 1 0027 以新鲜鹿血为原料， 按照以下工艺制备鹿血多肽 ： 0028 取 1 升新鲜鹿血， 在 4、 3000 转 / 分钟转速下。
19、离心 2 小时， 沉淀血细胞用于制备 SOD 和血红素、 上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽。 0029 (1)SOD 和血红素的制备 0030 血细胞中加入1升去离子水静置过夜， 再加入0.5升去离子体积的体积比为13 的乙醇 / 氯仿混合液搅拌 10 分钟后静置， 并以 1000 转 / 分钟的转速离心 10 分钟， 上清在 80加热 10 分钟后离心 10 分钟， 上清为 SOD 粗品， 沉淀为血红素粗品。 0031 SOD 粗品加入 2 升丙酮并搅拌后静置 5 分钟过滤， 沉淀加入 2 升蒸馏水溶解后以 2000 转 / 分钟的转速离心 50 分钟， 上清冷冻干燥后用 0.05M、 pH。
20、 6 的磷酸缓冲液溶解， 上 Sephadex G-75 凝胶柱纯化， 得到精制的鹿血 SOD 组分， SOD 活性为 1 万单位 / 毫克。 0032 血红素粗品加入 1 升的质量浓度 0.1的 NaHSO3溶液搅拌均匀后加入 1 升丙酮用 1M 盐酸调 pH 至 1， 过滤， 滤液加入质量浓度 10氨水调 pH 至 4.5， 沉淀水洗后冷冻干燥为 精制鹿血血红素。 0033 (2) 活性肽的制备 0034 将鹿血血浆蛋白加热至 60-100 10-60 分钟热变性、 并冷冻干燥后， 用 pH 8 的 磷酸缓冲液溶解配成重量浓度 8的水溶液加入胃蛋白酶， 干燥的鹿血上清与酶的重量比 为 30。
21、 1， 60酶解 24 小时， 再冷冻干燥得到粉末状鹿血活性肽 ； 活性肽检测具有血管紧 张素转化酶抑制活性和免疫增强活性。 0035 实施例 2 0036 取 1 升新鲜鹿血， 在 4、 15000 转 / 分钟转速下离心 0.1 小时， 沉淀血细胞用于制 备 SOD 和血红素、 上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽。 0037 (1)SOD 和血红素的制备 0038 血细胞中加入 1 升去离子水静置过夜， 再加入 0.5 升的体积比为 1 4 的乙醇 / 氯仿混合液搅拌50分钟后静置， 并以10000转/ 分钟的转速离心10分钟， 上清在50加热 50 分钟后离心 10 分钟， 上清为 SOD。
22、 粗品， 沉淀为血红素粗品。 0039 SOD 粗品加入 2 升丙酮并搅拌后静置 5 分钟过滤， 沉淀加入 2 升蒸馏水溶解后 说 明 书 CN 101461543 B4/4 页 6 10000转/分钟离心10分钟， 上清冷冻干燥后用1M、 pH9的磷酸缓冲液溶解， 上Sephadex G-75 凝胶柱纯化， 得到精制的鹿血 SOD 组分， SOD 活性为 5 万单位 / 毫克。 0040 血红素粗品加入 1 升的质量浓度 0.1的 NaHSO3溶液搅拌均匀后加入 5 升丙酮用 1M 盐酸调 pH 至 1， 过滤， 滤液加入质量浓度 10氨水调 pH 至 8， 沉淀水洗后冷冻干燥为精 制鹿血血。
23、红素， 血红素纯度为 80。 0041 (2) 活性肽的制备 0042 将鹿血血浆蛋白中加入尿素至终浓度为 8-10mol/L， 搅拌 10-20 分钟化学变性、 并 冷冻干燥后， 用 pH 3 的磷酸缓冲液溶解配成重量浓度 40的水溶液加入风味蛋白酶， 干 燥的鹿血血浆蛋白与酶的重量比为 500 1， 30酶解 0.5 小时， 再冷冻干燥得到粉末状鹿 血活性肽 ； 活性肽检测具有血管紧张素转化酶抑制活性和免疫增强活性。 0043 本发明以传统保健滋补品鹿血为原料， 结合中医传统中有关鹿血的滋补功效， 建 立了具有抗氧化、 抗衰老功能的超氧化歧化酶 (superoxidedismutase， 简称 SOD)、 补血功 能的血红素和降血压、 增强免疫力功能的活性肽的制备方法， 本发明将几种活性组分提取 和制备工艺集成， 保留并提高了鹿血所有已知和未知的活性组分， 与传统鹿血全血直接食 用相比， 功能明确的鹿血活性组分更具有应用前景。 说 明 书 。