一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用.pdf

《一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用.pdf（11页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310525672.X (22)申请日 2013.10.31 A61K 36/28(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 31/22(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (73)专利权人 青岛市市立医院 地址 266000 山东省青岛市市北区胶州路 1 号 (72)发明人 吴艳群 刘剑 赵宏 (74)专利代理机构 青岛申达知识产权代理有限 公司 37243 代理人 蒋遥明 CN 103340932 A,2013.10.09, CN 103316085 A,2013.09.25, (。

2、54) 发明名称 一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应 用 (57) 摘要 本发明涉及一种阿氏蒿提取物的新用途， 该 新用途是阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应 用。所述阿氏蒿提取物是按如下方法制备的 ： 以 阿氏蒿为原料， 先提取挥发油， 再用 50%-95% 乙醇 提取， 通过大孔吸附树脂纯化得到。本发明所提 供的阿氏蒿提取物对制备抗病毒药物具有重要意 义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵保忠 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 CN 103585225 B 2016.03.16 CN 103585225 B 1/1 。

3、页 2 1.一种阿氏蒿提取物在制备抗 HSV-II 病毒药物中的应用， 所述阿氏蒿提取物的制备 方法为 : （1） 阿氏蒿， 加水浸泡4-12小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间1-4小时， 提 取次数 1-3 次， 水用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏 蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 50%-95% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 1-3 次， 每次提取时间为 1-3 小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干燥， 。

4、即得阿氏蒿提取物 B ； （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.10-1.20， 通过大孔吸附树脂柱， 先用水洗脱， 再用浓度 50%-90% 的乙醇溶液洗脱， 收集不同浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即 得阿氏蒿提取物 C ； （4） 上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得阿氏蒿提取物。 2.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述阿氏蒿提取物的制备方法所采用的大 孔吸附树脂为 D101 大孔吸附树脂、 DM130 大孔吸附树脂、 ADS-3 大孔吸附树脂。 3.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述的阿氏蒿提取物。

5、与化学药或中药或天 然药物组成的抗 HSV-II 病毒药物。 4.根据权利要求1所述的阿氏蒿提取物A、 阿氏蒿提取物B， 在制备抗HSV-II病毒药物 中的应用。 5.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述的阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B 与 化学药或中药或天然药物组成的抗 HSV-II 病毒药物。 6.根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述的阿氏蒿提取物通过加入药剂学允许 的各种辅料制成药剂学上口服的片剂、 颗粒剂、 胶囊。 权 利 要 求 书 CN 103585225 B 2 1/9 页 3 一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物。

6、医药领域， 涉及一种中药材提取物在制备抗病毒药物中的应用， 具体是涉及一种阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用。 背景技术 0002 目前大量使用抗生素引起的细菌耐药性不断上升已成为全世界共同关注的难题 之一。尤其是金黄色葡萄球菌的耐药率已达 90以上。单纯疱疹病毒 II 型主要引起生殖 器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、 口腔、 生殖器粘膜以及破损皮肤进入体， 潜居于人体 正常粘膜、 血液、 唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时， 如发热、 胃肠功能紊乱、 月经、 妊娠、 病灶感染和情绪改变时， 体内潜伏的HSV-II 被激活而发病。 合成药物在单纯疱 疹性的治疗中较肯定的抗病毒药物是。

7、阿昔洛韦 （ACV） ， 但近年来临床不断发现 ACV 的耐药 株， 且耐药性随药物疗程的延长有增长趋势。 0003 因此， 开发新的高效低毒的抗菌、 抗病毒药物具有广阔的前景， 传统中药的多靶点 作用机制、 低毒副作用、 易于代谢、 无耐药性等优点使它成为筛选高效低毒的抗菌、 抗病毒 药物的热点。 0004 阿氏蒿为菊科植物阿氏蒿 Artemisia adamsii Besser 的干燥地上部分。夏季花 期采收， 除去杂质， 洗净， 晾干水气， 切段， 揉搓出香气， 阴干， 干燥。 收载于 中华人民共和国 卫生部药品标准 藏药 （第一册） ， 标准编号 ： WS3-BC-0050-95。性寒。

8、， 味苦。具有清热解毒 之功效。用于肺炎， 胃炎， 喉炎， 扁桃体炎， 结膜炎等。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药 物。但有关阿氏蒿的基础研究尚十分有限， 使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研 究关于阿氏蒿的化学成分及药理作用鲜有报道。 0005 上述文献及专利等， 尚未见阿氏蒿或阿氏蒿提取物抗菌、 抗病毒作用研究的报道。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种阿氏蒿提取物的在制备抗病毒药物中的应用。 0007 本发明是通过如下技术方案实现的 ： 0008 本发明所用阿氏蒿为菊科植物阿氏蒿 Artemisia adamsii Besser 的干燥地上部 分。 0009 本发明一种阿氏。

9、蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用， 所述阿氏蒿提取物的制备 方法为 : 0010 （1） 阿氏蒿， 加水浸泡 4-12 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 1-4 小 时， 提取次数 1-3 次， 水用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将 阿氏蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0011 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 50%-95% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 1-3 次， 每次提取时间为 1-3 小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 滤过， 提取液回收乙 醇， 浓缩， 干燥， 即得阿。

10、氏蒿提取物 B ； 说 明 书 CN 103585225 B 3 2/9 页 4 0012 （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.10-1.20， 通过大孔吸附树脂 柱， 先用水洗脱， 再用浓度 50%-90% 的乙醇溶液洗脱， 收集不同浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即得阿氏蒿提取物 C ； 0013 （4） 上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C， 其中一种或两种或三 种按一定比例混匀， 即得本发明的阿氏蒿提取物。 0014 阿氏蒿提取物的制备方法为 ： 0015 （1） 阿氏蒿， 加水浸泡 4-12 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 。

11、提取时间 1-4 小 时， 提取次数 1-3 次， 水用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将 阿氏蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0016 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 50%-95% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 1-3 次， 每次提取时间为 1-3 小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的 8-15 倍， 滤过， 提取液回收乙 醇， 浓缩， 干燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0017 （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.10-1.20， 通过大孔吸附树脂 柱， 先用水洗脱， 再用。

12、浓度 50%-90% 的乙醇溶液洗脱， 收集不同浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即得阿氏蒿提取物 C ； 0018 （4） 上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得本发明的阿 氏蒿提取物。 0019 优选的本发明阿氏蒿提取物的制备方法为 : 0020 （1） 阿氏蒿， 加水浸泡 8 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 2 小时， 提 取次数 2 次， 水用量为阿氏蒿重量的 13 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏蒿水 提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0021 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 70% 乙醇为。

13、溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 2 次， 每 次提取时间为2小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的12倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干 燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0022 （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.13， 通过 ADS-3 大孔吸附树 脂柱， 先用水洗脱， 再用浓度 70% 的乙醇溶液洗脱， 收集 70% 浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即 得阿氏蒿提取物 C ； 0023 （4） 将上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得本发明的 阿氏蒿提取物。 0024 本发明的阿氏蒿提取物的制备方法， 其特征在于 。

14、： 所采用的大孔吸附树脂为 D101 大孔吸附树脂、 DM130 大孔吸附树脂、 ADS-3 大孔吸附树脂。 0025 本发明的阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C， 在制备抗病毒药物中 的应用。 0026 本发明的阿氏蒿提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗病毒药物。 0027 本发明的阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 与化学药或中药或天 然药物组成的抗病毒药物。 0028 本发明的阿氏蒿提取物， 通过加入药剂学允许的各种辅料， 制成药剂学上的片剂、 颗粒剂、 胶囊等口服剂型。 0029 本发明的阿氏蒿提取物通过多种组分， 多环节、 多途径地发挥协。

15、同作用而表现出 说 明 书 CN 103585225 B 4 3/9 页 5 抗病毒功效， 对 HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是阿氏蒿体外抗病毒的主要 作用途径。HSV-II 是有包膜的病毒， 最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成， 其中任何一种成 分改变， 即可使包膜变性， 从而灭活病毒。实验结果表明阿氏蒿各提取物对 HSV-II 的直接 灭活作用较强， 尤其是阿氏蒿提取物和阿氏蒿提取物 A 直接灭活 HSV-II 的作用比 ACV 更 加显著。故推测这些化学成分能使病毒包膜变性以灭活病毒。HSV-II 侵入细胞的阻断作 用研究表明， 阿氏蒿提取物不仅有抗病毒活性， 还具有一定程度。

16、保护细胞防止病毒侵入的 作用。利用 HSV-II 脑炎模型研究阿氏蒿提取物对 HSV-II 感染小鼠的保护作用， 结果表明 阿氏蒿提取物表现出一定的抗病毒活性。 具体实施方式 0030 下面通过具体实验例和实施例对阿氏蒿提取物在制备抗病毒药物中的应用做进 一步说明， 但不限于本发明。 0031 实施例 1 ： 阿氏蒿提取物的制备 0032 （1） 阿氏蒿 13kg， 加水浸泡 8 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 2 小 时， 提取次数 2 次， 水用量为阿氏蒿重量的 13 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏 蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ；。

17、 0033 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 70% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 2 次， 每 次提取时间为2小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的12倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干 燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0034 （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.13， 通过 ADS-3 大孔吸附树 脂柱， 先用水洗脱， 再用浓度 70% 的乙醇溶液洗脱， 收集 70% 浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即 得阿氏蒿提取物 C ； 0035 （4） 将上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得本发明的 阿氏。

18、蒿提取物。 0036 实施例 2 ： 阿氏蒿提取物的制备 0037 （1） 阿氏蒿 20kg， 加水浸泡 12 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 1 小 时， 提取次数 3 次， 水用量为阿氏蒿重量的 8 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏 蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0038 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 95% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 1 次， 每 次提取时间为3小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的15倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干 燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0039 （3） 将步骤 （。

19、1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.10， 通过 DM130 大孔吸附树 脂柱， 先用水洗脱， 再用浓度 90% 的乙醇溶液洗脱， 收集 90% 浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即 得阿氏蒿提取物 C ； 0040 （4） 上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得本发明的阿 氏蒿提取物。 0041 实施例 3 ： 阿氏蒿提取物的制备 0042 （1） 阿氏蒿 18kg， 加水浸泡 4 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 4 小 时， 提取次数 1 次， 水用量为阿氏蒿重量的 15 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏 说。

20、 明 书 CN 103585225 B 5 4/9 页 6 蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0043 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 50% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 3 次， 每 次提取时间为 1 小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿重量的 8 倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干 燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0044 （3） 将步骤 （1） 得到的提取液 A， 浓缩至相对密度 d=1.20， 通过 D101 大孔吸附树脂 柱， 先用水洗脱， 再用浓度 50% 的乙醇溶液洗脱， 收集 50% 浓度乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 即得 阿氏蒿提取物 。

21、C ； 0045 （4） 上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B、 阿氏蒿提取物 C 混匀， 即得本发明的阿 氏蒿提取物。 0046 实施例 4 ： 阿氏蒿提取物的制备 0047 （1） 阿氏蒿 25kg， 加水浸泡 6 小时， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取时间 3 小 时， 提取次数 2 次， 水用量为阿氏蒿重量的 15 倍， 收集挥发油， 即得阿氏蒿提取物 A ； 将阿氏 蒿水提取液滤过， 分别得到提取液 A 和药渣 A ； 0048 （2） 将步骤 （1） 得到药渣 A 用 70% 乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 2 次， 每 次提取时间为2小时， 每次溶剂用量为阿氏蒿。

22、重量的12倍， 滤过， 提取液回收乙醇， 浓缩， 干 燥， 即得阿氏蒿提取物 B ； 0049 （3） 将上述阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B 混匀， 即得本发明的阿氏蒿提取物。 0050 实施例 5: 阿氏蒿提取物片的制备 0051 取实施例 1 阿氏蒿提取物 325g， 加入淀粉 115g， 混匀， 制粒， 干燥， 加微晶纤维素 30.5g， 硬脂酸镁 5g， 混匀， 压制成 1000 片 , 即得阿氏蒿提取物片。 0052 实施例 6 ： 阿氏蒿提取物颗粒的制备 0053 取实施例2阿氏蒿提取物205g， 加入糊精135g， 混匀， 制粒， 整粒， 即得阿氏蒿提取 物颗粒。 0054。

23、 实施例 7 ： 阿氏蒿提取物胶囊的制备 0055 取实施例3阿氏蒿提取物305g， 加入淀粉85g， 混匀， 制粒， 干燥， 整粒， 装胶囊1000 粒， 即得阿氏蒿提取物胶囊。 0056 实验例 1 ： 阿氏蒿各提取物抗菌作用 0057 1. 菌种和培养基 0058 实验菌种由山东省疾病控制中心和山东省临床检验中心提供。列表如下 ： 0059 0060 实验用培养基 ： 细菌 MH 培养基， 真菌 PDA 培养基均购自中国药品生物制品检定 所。 说 明 书 CN 103585225 B 6 5/9 页 7 0061 2. 抑菌效果检测方法 ： 0062 2.1 抑菌效果用杯碟法测定抑菌圈大。

24、小 0063 活化菌液用无菌生理盐水稀释至 105 10 6cfu/ml 备用。加 0.2ml 菌液至干燥的 MH 培养基平板， 涂匀。 放置5min， 使培养基充分吸收菌液。 每个平板放置已灭菌的牛津杯6 个， 放置 5min， 使牛津杯紧密吸附于培养基表面。牛津杯中加入 0.1g/ml 各药物 100ul。阳 性对照用左氧氟沙星和氟康唑。 阳性对照细菌用浓度均为40g/ml 左氧氟沙星， 白色念珠 菌用浓度均为 200g/ml 氟康唑， 均加 100ul。阴性对照加无菌水。然后将平板置于 37 恒温培养箱培养 24h( 白色念珠球菌 48h)， 出用卡尺量取抑菌圈直径， 计算平均值， 用抑。

25、菌 圈直径 D 表示抑菌活性。抑菌效果判断标准为 ： D 8mm 为不敏感， 8mm D 13mm 为低 度敏感， 13mm D 19mm 为中度敏感， D 19mm 为高度敏感。 0064 2.2 最小抑菌浓度 MIC 的测定采用微量稀释板法 0065 试验菌液浓度为 106cfu/ml。吸取稀释好的菌液加于 96 孔细胞培养板中， 每孔 100ul， 每种药物100ul， 依次对比稀释10 孔， 最后一孔不加药物( 仅加培养基和细菌) 加 入稀释菌液 100ul， 为细菌生长对照孔。留一列孔不加细菌 ( 仅加培养基和药物 ) 作药物 对照孔， 阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑， 按说明做倍比稀。

26、释。置于振荡器上振荡 1min， 使 孔内溶液充分混匀后， 微孔板加盖并放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中， 于 37温箱中孵育 24h( 白色念珠球菌 48h)， 眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。 0066 3. 抑菌效果 0067 表 1 不同阿氏蒿提取物抑菌圈 (mm) 0068 0069 注 ： a、 阿氏蒿提取物、 阿氏蒿提取物 C、 阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B 加入量 为 1mg/ 杯， b、 阳性对照细菌用浓度均为 40g/ml 左氧氟沙星， 白色念珠菌用浓度均为 200g/ml 氟康唑， 均加 100ul。5 DMSO 为阴性对照。 0070 表 2 不同。

27、阿氏蒿提取物最小抑菌浓度 (MIC)( 单位 mg/ml) 0071 说 明 书 CN 103585225 B 7 6/9 页 8 0072 注 ： 阳性对照细菌用左氧氟沙星， 白色念珠菌用氟康唑， 均加 100ul ； 5 DMSO 为 阴性对照。 0073 结果表明 ： 阿氏蒿提取物具有广谱抗菌和杀菌作用。对革兰氏阳性菌 ： 金黄色葡 萄球菌、 耐药性表皮葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 枯草杆菌 ； 革兰氏阴性细菌 ： 大肠杆菌、 粪肠 球菌 ； 深部感染真菌白色念珠菌都有杀灭和抑制生长的作用， 具有重要的实践意义和应用 价值， 可在制备有抑菌和 / 或杀菌作用的食品、 保健品、 化妆品和药品。

28、中应用。 0074 实验例 2 ： 阿氏蒿各提取物抗病毒作用。 0075 1、 实验材料 0076 病毒 ： HSV-II 型 (3 代 )20110913， 兰州生物制品研究所疫苗研究室提供 (herpessimplex virus， HSV-II) 0077 细胞 ： 非洲绿猴肾细胞 (Vero 细胞 ) 兰州生物制品研究所提供。培养用 DMEM 培 养基 +7牛血清。 0078 动物 ： 清洁级昆明小鼠， 雌雄各半， 体重 18-22g， 购于兰州生物制品研究所动物 房。 0079 药物及试剂 ： 噻唑蓝 (MTT， Fluka Biochemika 公司 )， 二甲基亚砜 (dimet。

29、hylsulf oxide， DMSO， Sigma 公司生产 )， DMEM(GIBCO 公司 )， 标准新生牛血清 ( 中美合资兰州民 海生物工程有限公司 )， 注射用阿昔洛韦 (ACV， 9-(2- 羟乙氧甲基 -) 鸟嘌呤， 武汉普生制 药有限公司， 生产批号 110811 国药准字 H42020129)。阿氏蒿提取物、 阿氏蒿提取物 C、 阿 氏蒿提取物 A、 阿氏蒿提取物 B （实施例 1 方法制备得到， 批号分别为 ： 20110908、 20110909、 20110910、 20110911） 0080 2、 实验方法 0081 2.1 体外实验。 0082 2.1.1 药物。

30、细胞毒性测定 (MTT 法 ) 0083 将细胞悬液以 8105/ml 密度接种于 96 孔细胞培养板中， 每孔 200l， 37， 5 CO2， 100相对湿度培养 24h。阿氏蒿提取物、 阿氏蒿提取物 C、 阿氏蒿提取物 A、 阿氏蒿 提取物B均倍比稀释至以下6个浓度 ： 16， 8， 4， 2， 1， 0.5mg/ml， 加入细胞悬液孔中， 每一药物 浓度重复 4 孔， 另设正常细胞对照。相同条件下继续培养 33h， 观察细胞病变 (CPE) 情况， 并以 MTT 法检测细胞存活率。 0084 2.1.2 病毒毒力测定 ( 蚀斑法 ) 0085 将细胞悬液以 8105/ml 密度接种于 。

31、24 孔细胞培养板中， 每孔 1mL， 37， 5 CO2， 100相对湿度培养 24h。病毒稀释至以下 6 个浓度 ： 10-3， 10-4， 10-5， 10-6， 10-7， 10-8， 加 说 明 书 CN 103585225 B 8 7/9 页 9 入细胞悬液孔中， 每一药物浓度重复 4 孔， 另设正常细胞对照， 甲基纤维素覆盖物覆盖， 相 同条件下继续培养 72h， 结晶紫染色， 计数。 0086 感染性病毒量 (PFU/ml) ( 每孔内斑数 / 每孔接种病毒量 ml) 病毒稀释倍数。 0087 2.1.3 药物对 HSV-II 侵入细胞的阻断作用 ( 蚀斑法 ) 0088 将供。

32、试品液与 HSV-II 等体积混合， 以此病毒药物混合液感染 Vero 细胞。37， 5CO2 吸附90min， 洗涤， 加细胞维持液置37， 5CO2 培养。 每日观察CPE， 72h 后以蚀 斑法检测病毒抑制率。采用治疗指数 (TI) 作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。 治疗指数(TI) 半数毒性浓度(TC50)/ 半数抑制浓(IC50)。 每一药物浓度重复4 孔， 同时 设置正常细胞对照、 药物对照及病毒对照。 0089 2.1.4 药物对 HSV-II 的直接灭活作用 ( 蚀斑法 ) 0090 将供试品液与 HSV-II 等体积混合， 37作用 90min 后， 以此病毒药物混合。

33、液感 染 Vero 细胞。37， 5 CO2 吸附 90min， 洗涤， 同上法培养与检查。 0091 2.1.5 药物对病毒颗粒增殖的抑制作用 ( 蚀斑法 ) 0092 将病毒感染细胞， 吸附 90min 后洗涤， 加入不同浓度的供试品液， 同上法培养与检 查。病毒抑制率 ( ) ( 病毒对照组平均出斑数 - 给药试验组平均出斑数 )/ 病毒对照组 平均出斑数 0093 2.2 体内实验。 0094 2.2.1 药物对小鼠的急性毒性测定 0095 清洁级昆明种小鼠随机分组， 每组 6 只， 雌雄各半。根据体外实验结果， 选择抑制 HSV-II 生物合成活性较好的总提取物， 以 400， 50。

34、0， 625， 800， 1000， 1250mg/kg 剂量灌胃给 药， 另设阴性对照组， 给予等体积的生理盐水。正常进食进水， 连续观察 10d， 记录小鼠死亡 情况并计算 LD50。 0096 2.2.2 病毒脑腔模型毒力测定 0097 清洁级昆明种小鼠随机分组每组 10 只， 雌雄各半。感染部位常规消毒后， 经右 0098 脑室注射病毒， 病毒稀释至以下 6 个浓度 ： 10-1， 10-2， 10-3， 10-4， 10-6， 10-7， 感染剂量 为每只0.05mL。 正常进食进水， 连续观察10d， 记录小鼠死亡情况并用Reed-Muench 法计算 LD50。 0099 2.2。

35、.3 药物对脑腔感染 HSV-II 小鼠的保护作用 0100 清洁级昆明种小鼠随机分组每组 10 只， 雌雄各半。感染部位常规消毒后， 经右脑 室注射病毒， 病毒感染后24h， 给药治疗。 按药物LD50 的1/21/4 作为药物体内实验的高 实验剂量， LD50的 1/12 1/16 作为低实验剂量， 每药物设高低 2 个剂量组。不用药物的对 照组 ( 病毒对照组、 正常对照组 )， 连续灌胃给药 5d， 观察动物发病和死亡情况， 连续 30d。 0101 3、 实验结果 0102 3.1 体外实验。 0103 3.1.1 药物细胞毒性测定 0104 表 3 阿氏蒿提取物对 Vero 细胞的。

36、毒性 ( 单位 ： mg/ml) 0105 说 明 书 CN 103585225 B 9 8/9 页 10 0106 供试品液对 Vero 细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、 颗粒较多、 折光性差、 形 态改变、 部分细胞破碎脱落。由于细胞代谢活性降低或死亡， MTT 法检测到的活细胞数减 少。 0107 3.1.2 病毒毒力测定 ( 蚀斑法 ) 0108 Vero 细胞对 HSV-II 较敏感， HSV-II 感染所致的 Vero 细胞细胞病变效应 CPE 特征为圆缩肿胀、 相互融合形成葡萄串状或星状， 甚至部分细胞脱落， 形成病灶。蚀斑计数 得 HSV-II 型 (3 代 )2011091。

37、3 感染性病毒量 (PFU/ml) 为 107.57PFU/ml， 该 HSV-II 病毒采 用 10-5时每孔出斑数约为 40 个， 容易计数， 故采用 10 -5 作为后续实验的病毒稀释度。 0109 3.1.3 阿氏蒿提取物对 HSV-II 侵入细胞的阻断作用 0110 表 4 阿氏蒿提取物对 HSV-II 侵入 Vero 细胞的阻断作用。 0111 0112 3.1.4 阿氏蒿提取物对 HSV-II 的直接杀伤作用 0113 表 5 阿氏蒿提取物对 HSV-II 的直接灭活作用。 0114 0115 3.1.5 药物对 HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用 ( 蚀斑法 ) 0116 表。

38、 6 阿氏蒿提取物对 HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用。 0117 说 明 书 CN 103585225 B 10 9/9 页 11 0118 阿氏蒿提取物通过多种组分， 多环节、 多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功 效， 对 HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是阿氏蒿体外抗病毒的主要作用途径。 HSV-II 是有包膜的病毒， 最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成， 其中任何一种成分改变， 即 可使包膜变性， 从而灭活病毒。实验结果表明阿氏蒿各提取物对 HSV-II 的直接灭活作用 较强， 尤其是阿氏蒿提取物和阿氏蒿提取物 A 直接灭活 HSV-II 的作用比 ACV 更加显著。 故推测这些化学成分能使病毒包膜变性以灭活病毒。HSV-II 侵入细胞的阻断作用研究表 明， 阿氏蒿提取物不仅有抗病毒活性， 还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。 利用 HSV-II 脑炎模型研究阿氏蒿提取物对 HSV-II 感染小鼠的保护作用， 结果表明阿氏蒿提取 物表现出一定的抗病毒活性。 说 明 书 CN 103585225 B 11 。