一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710090814.2 (22)申请日 2017.02.20 (71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 刘允军 王国英 刘艳 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植 物的方法 (57)摘要 本发明涉及转基因植物的培养， 具体公开了 一种通过弱光。

2、培养体系快速获得转基因玉米的 方法。 具体为： 将农杆菌侵染的玉米幼胚恢复培 养后， 置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选 培养， 将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件 下进行苗再生， 即得转基因玉米； 所述筛选培养 时间为25-30天； 所述弱光条件为光照强度1-20 mol/m2.s； 所述筛选培养基含有1-10mg/L的 CuSO4与0.1-1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。 本发明提 供的转化方法通过筛选培养基添加CuSO4、 6-苄 氨基腺嘌呤、 愈伤筛选阶段进行弱光处理， 愈伤 仅筛选两轮， 即可使得玉米转化效率提高到 10， 从玉米幼胚侵染到得到再生苗周期缩短到 2个月， 大大缩短了。

3、获得转基因玉米再生苗的时 间。 本发明方法简单， 操作方便， 宜于推广使用。 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 106922525 A 2017.07.07 CN 106922525 A 1.一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法， 其特征在于， 将农杆菌侵染的 植物组织恢复培养后， 置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养， 将筛选获得的抗性 愈伤组织在较强光条件下进行苗再生， 即得转基因植物； 所述筛选培养时间为25-30天； 所述弱光条件为光照强度1-20 mol/m2.s； 所述筛选培养基含有1-10mg/L的CuSO4与0.1-1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。 2.根据。

4、权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述弱光条件为光照强度5-10 mol/m2.s。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述筛选培养基含有5mg/L的CuSO4与 0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述较强光条件为光照强度60-150 mol/ m2.s。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述较强光条件为光照强度100 mol/m2.s。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述筛选培养分为两轮进行。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述筛选培养基的配方为： MS培养基4.3g/L， 蔗糖。

5、20g/L， 葡萄糖10g/L， 肌醇0.25g/L， L-脯氨酸0.69g/L， CuSO4 5H2O 5mg/L， 2,4-D 3mg/L， 6-BA 0.5mg/L， 噻孢霉素250mg/L， 双丙氨膦3-5mg/L， pH5.8。 8.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 将农杆菌侵染后的植物组织在黑暗条件下 恢复培养4-7天。 9.根据权利要求1或2及权利要求48任一项所述的方法， 其特征在于， 所述植物组织 为玉米幼胚。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106922525 A 2 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法 技术领域 0001 本发明涉及转基因植物的。

6、培养， 具体地说， 涉及通过弱光培养体系快速获得转基 因植物的方法。 背景技术 0002 自上世纪90年代开始， 科学家就开始转基因玉米相关的研究。 Gordon-Kamm等 (Gordon-Kammet al .Plant Cell ,1990 ,2(7):603-618)和Fromm等(Fromm et al.Biotechnology(NY),1990,8(9):833-839)最先报道通过基因枪轰击法转化玉米悬浮细 胞并获得再生植株。 Grimsley等(Grimsley et al.Nature,1987,325(1):177-179)最早尝 试通过使用根癌农杆菌作为介质将玉米条纹病。

7、毒浸染玉米。 Gould等(Gould et al.Plant Physiol,1991,95(2):426-434)和Shen等(Shen et al.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90 (4):1488-1492)用根癌农杆菌浸染玉米茎尖并获得少量转基因玉米植株。 相对于基因枪 法， 农杆菌转化法的优点是节省成本， 外源基因多以单拷贝或低拷贝整合到植物基因组中， 外源基因不易发生沉默， 能稳定遗传表达。 农杆菌介导的玉米转化里程碑式的工作来自于 Ishida等(Ishida et al.Nat Biotechnol,1996,14(6):745-750)， 他们使。

8、用超双元载体通 过农杆菌浸染玉米自交系A188幼胚， 转化效率达到5-30， 真正使通过农杆菌法获得转基 因玉米成为可能。 Zhao等(Zhao et al.Maize Genet Coop Newslett,1998,72:34-37)使用 普通双元载体通过农杆菌转化法浸染玉米杂交种HiII， 获得了较高的遗传转化效率。 Frame 等(Frame et al.Plant Physiol,2002,129(1):13-22)使用普通双元载体转化玉米HiII幼 胚， 其转化效率稳定在5左右。 0003 但上述转化方法需要对转化愈伤在黑暗条件先进行长时间的筛选， 并使筛选的抗 性愈伤再生成苗， 。

9、一般计算， 从农杆菌侵染玉米幼胚到获得转基因再生苗至少需要3个月以 上的时间。 提高转化效率并缩短获得转基因玉米再生苗的时间， 将大大有助于通过转基因 技术手段快速鉴定基因功能、 更快培育有育种价值转基因玉米材料。 发明内容 0004 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种转化效率高、 转化周 期短的获得转基因植物的方法。 0005 为了实现上述目的， 本发明采取如下技术方案： 0006 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法， 在农杆菌侵染植物组织后， 恢复4-7天(优选7天)， 置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛选培养， 将筛选获得的抗性 愈伤组织在较强光条件下进行苗。

10、再生； 所述筛选培养时间为25-30天； 所述弱光条件为光照 强度1-20 mol/m2.s； 所述筛选培养基含有1-10mg/L的CuSO4与0.1-1mg/L的6-苄氨基腺嘌 呤。 本方法的遗传转化效率能稳定在10左右。 0007 以玉米为例， 在农杆菌侵染玉米幼胚后， 置于筛选培养基中在弱光条件下进行筛 选培养， 将筛选获得的抗性愈伤组织在较强光条件下进行苗再生， 即得转基因玉米。 说 明 书 1/7 页 3 CN 106922525 A 3 0008 本发明通过在筛选培养基中添加CuSO4与6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)， 配合弱光条件 可以诱导绿色愈伤， 使得玉米愈伤可以快速生长为具有。

11、高分化再生能力的绿色愈伤， 提高 阳性愈伤的筛选效率并缩短愈伤再生成苗的周期。 0009 本发明中愈伤筛选阶段的弱光培养可以使玉米愈伤迅速长成具有可再生能力的 愈伤， 提高抗性愈伤的再生能力。 但是光照强度过高， 玉米愈伤会产生芽从而不利于愈伤生 长， 因此经大量实验优化后， 优选弱光光照强度为5-10 mol/m2.s， 最优选弱光光照强度为5 mol/m2.s。 0010 本发明筛选培养基中的CuSO4， 有助于提高抗性愈伤的分化能力。 作为优选， 所述 CuSO4添加量为5mg/L。 0011 本发明筛选培养基中的6-苄氨基腺嘌呤， 有助于提高抗性愈伤的分化、 再生能力。 作为优选， 所。

12、述6-苄氨基腺嘌呤添加量为0.5mg/L。 0012 更为具体地， 本发明提供所述筛选培养基的配方为： 0013 MS培养基4.3g/L， 蔗糖20g/L， 葡萄糖10g/L， 肌醇0.25g/L， L-脯氨酸0.69g/L， CuSO45H2O 5mg/L， 2,4-D 3mg/L， 6-BA 0.5mg/L， 噻孢霉素(Cefotaxime)250mg/L， 双丙氨 膦(Bialaphos)3-5mg/L， 3g/L植物凝胶， pH5.8。 用水定容。 0014 进一步地， 所述筛选培养分为两轮进行， 在本发明的一个具体实施方式中， 每轮筛 选14天。 实际应用中， 每轮筛选的时间可依据情。

13、况进行适当调整。 常规技术中， 筛选培养需 要至少3-4轮才能完成， 筛选得到的愈伤一般为黄色愈伤， 强光下再生成苗比绿色再生愈伤 慢， 而本发明两轮筛选后的愈伤为绿色再生愈伤， 强光下再生成苗快， 显著缩短了筛选培养 的时间和次数。 0015 进一步地， 苗再生时， 所述较强光条件为光照强度60-150 mol/m2.s， 优选为100 mol/m2.s。 0016 本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品， 涉及到的操作如无特殊说明均为 本领域常规操作。 0017 在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可以相互组合， 得到具体实施方 式。 0018 本发明在具体实施方式中以玉米为例。

14、进行说明， 但本发明所述方法并不限于玉 米， 其他可通过本发明所述方法获得绿色愈伤进而获得转基因植株的植物均在本发明的保 护范围之内。 0019 本发明的有益效果在于： 0020 本发明提供的转化方法通过筛选培养基添加CuSO4、 6-苄氨基腺嘌呤、 愈伤筛选阶 段进行弱光处理， 愈伤仅筛选两轮， 每轮两周， 使得玉米转化效率提高到10， 从玉米幼胚 侵染到得到再生苗周期缩短到2个月， 大大缩短了获得转基因玉米再生苗的时间。 本发明方 法简单， 操作方便， 宜于推广使用。 附图说明 0021 图1为本发明实施例5经二轮筛选后的抗性愈伤。 0022 图2为本发明实施例7中T0代转化体Bar蛋白的。

15、检测图； 1， 非转基因玉米； 2-6， 转基 因玉米。 说 明 书 2/7 页 4 CN 106922525 A 4 具体实施方式 0023 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。 需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的， 并不是用于对本发明的范围进行限制。 本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下， 可以对本发明进行各种修改和替换。 0024 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0025 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0026 实施例1玉米受体材料准备 0027 温室或田间种植玉米自。

16、交系综31， 用玉米自交系A188的花粉进行授粉， 取授粉后 9-12天的玉米穗(幼胚约1.0-1.2mm)， 去掉外苞叶， 用镊子穿在穗子顶部在70的乙醇中灭 菌1分钟， 然后放在超净台上吹干， 从穗上剥离1mm左右新鲜的幼胚， 作为受体材料， 备用。 0028 实施例2农杆菌侵染 0029 将植物表达载体pCambia3301通过冻融法转化到农杆菌EHA105中， -70保存菌 株。 将保存菌株在含100 g/mL卡那霉素和250 g/mL塞孢霉素的YEB固体培养基上划线， 28 暗培养， 至长出单菌落。 0030 第一天， 挑取单菌落接种到5-10mL含相应抗生素的YEB液体培养基中， 。

17、于200rpm、 28振荡培养8小时； 再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的 YEB液体培养基中， 于200rpm、 28振荡过夜。 0031 第二天， 将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中， 于5000rpm、 离心5min； 用含 200 M乙酰丁香酮的侵染培养基(配方见表1)重悬， 调整O.D.6000.3， 备用。 0032 将受体材料玉米幼胚放到含1mL侵染培养基溶液的1.5mL离心管中， 一个小时后用 移液器吸去侵染培养基并加入1mL新的侵染培养基， 颠倒混匀1分钟， 充分清洗玉米幼胚表 面的胚乳， 再用移液器吸去侵染培养基溶液， 加入0.2mL新的。

18、侵染培养基溶液。 将装有玉米 幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司,型号CHB-100)上用48热激5分钟； 用移液器吸去侵染培养基溶液， 加入1mL含40mg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液， 并放置5分钟； 取出用灭菌滤纸吸干， 放到添加300mg/L半胱氨酸的共培养培养基(配方见表2)上， 在23 黑暗条件下共培养3天。 0033 表1侵染培养基配方 0034 0035 表2共培养培养基配方 说 明 书 3/7 页 5 CN 106922525 A 5 0036 0037 0038 实施例3幼胚恢复 0039 共培养完后的幼胚转移到恢复培养基中(表3)， 黑暗条件下培养7天。 004。

19、0 表3恢复培养基 0041 0042 实施例4愈伤筛选条件优化 0043 1)光照条件优化 0044 恢复7天后的幼胚转移到筛选培养基(配方见表4)上， 在26弱光条件下培养， 光 照强度为1-10 mol/m2.s。 试验过程中发现过低的光照强度条件下， 幼胚不能形成绿色再生 愈伤； 而过高的光照强度条件下， 幼胚形成愈伤的能力变差。 因此， 弱光培养条件优选光照 强度为5 mol/m2.s(表5)。 0045 表4筛选培养基配方 说 明 书 4/7 页 6 CN 106922525 A 6 0046 0047 表5不同光照条件下绿色愈伤发生率 0048 0049 2)培养基配方优化 00。

20、50 弱光培养条件下， 培养基中的CuSO4和6-BA浓度对绿色愈伤的质量起到至关重要 的作用， 试验了不同浓度的CuSO4和6-BA对转化效率的影响， 优选CuSO4添加量为5mg/L， 6-BA 添加量优选为0.5mg/L(表6)。 0051 表6不同培养基下遗传转化率 0052 说 明 书 5/7 页 7 CN 106922525 A 7 0053 0054 实施例5植株再生 0055 筛选两轮后， 获得抗性愈伤(图1)， 此时获得的抗性愈伤为绿色再生愈伤， 具有高 分化再生能力。 将此愈伤转移到再生培养基(配方见表7)， 强光照下使植株再生。 培养条件 为28， 光照16小时， 很快就。

21、会有再生小苗出现。 0056 表7再生培养基配方 0057 0058 实施例6植株生根移栽 0059 再生的幼苗长到3片叶时， 可将幼苗移植到生根培养基(配方见表8)中， 并在室内 培养。 待幼苗长出新叶及根后， 将幼苗从罐头瓶中取出， 自来水冲净培养基， 移栽于混有营 养土和蛭石(1:3)的小花盆中。 当幼苗又长出2-3片新叶时， 可将其移入大田或大花盆中。 0060 表8生根培养基配方 0061 说 明 书 6/7 页 8 CN 106922525 A 8 0062 实施例7转基因植株检测 0063 取约0.05g左右新鲜幼嫩叶片放在1.5mL的Eppendorf管中， 用研磨棒研磨成液体。

22、 状， 向管中加入200 L水。 取出Bar蛋白检测条(北京乐士宁科技有限公司货号： AQ014BG)， 手 持检测条顶端， 保持检测条垂直， 将标记的末端插入至离心管,插入部分不要超过0.5cm。 在 检测过程中始终保持插入状态。 1-3分钟内出现质控线。 如果样品是阳性的， 检测线将出现。 如果样品是阴性的， 检测线将不出现。 检测结果如图2所示。 其中1为非转基因阴性苗对照； 2 到6为转基因阳性苗。 上条带为质控线， 下条带为检测线， 指示被检测出蛋白。 由图2可知， 转 基因玉米出现检测线， Bar蛋白在转基因玉米中正确表达。 0064 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 106922525 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 10 CN 106922525 A 10 。