技术领域
本发明涉及一种具有免疫增强功能的蛋白核小球藻压片糖果及其制备方法的应用。
背景技术
免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力。人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。现代人生活节奏快，饮食作息不规律，越来越多人出现免疫低下的状况，在人体免疫力不足的情况下，空气中的细菌、真菌都容易成为病原体导致机体发生疾病，故维护体内环境的稳定，提高机体免疫力，保持机体健康是人们当前需要解决的难题。
随着人们生活水平的提高以及技术的发展，人们更加注重日常生活的保健。食疗养生即通过饮食调理身体，是中国人的传统习惯，也是最直接的养生方式。目前市场上增强机体免疫功能的各类食品很多，但大多数存在食用与携带不方便、吸收利用度不高和口感不好等问题。近年来营养性压片糖果因其具有携带方便，口感好且有益于健康的优点而引起人们的关注，既可以充当食品，又含有功能性组分，能起到调节身体、有助健康的作用，广受现代人们的喜爱。
蛋白核小球藻资源丰富，营养价值高，国内外学者研究表明其具有增强机体免疫功能的作用，近年来作为新资源食品而广受消费者的青睐。为了更好地满足消费者需求，本发明提出了一种具有增强免疫力的蛋白核小球藻压片糖果及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有免疫增强功能的蛋白核小球藻压片糖果及其制备方法的应用，该压片糖果主要由下列重量份的原料药制成：
蛋白核小球藻250-350，黑枸杞50-150，复合氨基酸粉30-70，低聚果糖15-25，麦芽糊精20-30，硬脂酸镁3-7。
本发明组合物的原料药的重量份比优选为：
蛋白核小球藻250，黑枸杞150，复合氨基酸粉30，低聚果糖25，麦芽糊精30，硬脂酸镁3。
本发明组合物的原料药的重量份比还优选为：
蛋白核小球藻300，黑枸杞100，复合氨基酸粉50，低聚果糖20，麦芽糊精25，硬脂酸镁5。
本发明组合物的原料药的重量份比还优选为：
蛋白核小球藻350，黑枸杞50，复合氨基酸粉70，低聚果糖15，麦芽糊精20，硬脂酸镁7。
小球藻广泛分布于自然界，易于培养，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长繁殖，生长速度快，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，其蛋白质含量高(50％以上)，被作为优良的蛋白质来源，营养价值很高。我国常见的种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻和普通小球藻等，其中蛋白核小球藻蛋白质含量高，营养价值最高。已有研究表明，蛋白核小球藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物，具有增强免疫力，抗氧化，抗肿瘤等作用，其多糖及糖蛋白已被国外学者证明具有抗肿瘤活性、抗病原菌、抗病毒感染及增强免疫力等药理活性。
黑枸杞，富含蛋白质、氨基酸、枸杞多糖、各种维生素、微量元素、矿物质等多种营养成分，果实里面含丰富的紫红色素，而色素的主要成分为花青苷，研究发现黑枸杞花青苷具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功能。黑枸杞的原花青素(OPC)含量是迄今为止最高的天然野生植物，故也被誉为“软黄金”。藏医用于治疗心脏病、降低胆固醇、兴奋大脑神经、增强免疫功能、防治癌症、抗衰老、美容养颜、月经不调等且药效显著。
复合氨基酸粉是用科学方法从营养丰富的动物蛋白中提取出来的，由天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、撷氨酸、胧氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等十七种氨基酸按一定配比组成。为白色粉末状，具有多种氨基酸混合后的特殊芳香气味，易溶于水，成品中的氨基酸的总含量达80％左右，还含有钙、铁等多种人体必需的元素。可直接内服，更适宜于添加在食品中、饮料中食用，可以补充人体各种氨基酸摄入量的不足，对人体合成蛋白质、补钙、补血效果显著。
低聚果糖口味纯正，香甜可口，具有类似脂肪的香味和爽口的滑腻感，不仅具有一般功能性低聚糖的物理化学性质，还能明显改善肠道内微生物种群比例，是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长，调节肠道内平衡。其不仅能促进微量元素铁、钙的吸收与利用，防止骨质疏松症，还能在肠中生成抗癌的有机酸，减少肝脏毒素，具有显著的防癌功能。
麦芽糊精具有甜度低，溶解性好，不易吸潮，稳定性好，难以变质，易消化等特点。麦芽糊精除含有大量的多糖类外，还含有钙、铁等对人体有益的微量元素及矿物质，能促进人体正常的物质代谢，已被广泛应用于饮料、冷冻食品、糖果、麦片、乳制品、保健品等行业。
本发明压片糖果主要由蛋白核小球藻、黑枸杞、复合氨基酸粉、低聚果糖和麦芽糊精等组成，能补充人体所需营养，具有增强机体免疫功能，减缓衰老的功效，口感好、携带方便、易于食用与人体吸收。
本发明压片糖果主要由以下步骤组成：
(1)按照原料药重量比例称取，净选；
(2)分别将蛋白核小球藻、黑枸杞、复合氨基酸粉、低果聚糖、麦芽糊精进行干燥，粉碎，过80目筛，备用；
(3)将步骤(2)所得细粉于高速混合机中混合10min，往混合均匀的混合粉内加入95％食用酒精，进行湿法制粒，过20目筛，得到湿颗粒；
(4)将颗粒置入沸腾干燥机中，干燥温度为50-60℃，干燥时间40-50min，至颗粒水分＜5％时，取出颗粒冷却至室温，过20目筛整粒；
(5)将整粒后的颗粒与硬脂酸镁(过80目筛)置三偏心混合机中混合20分钟，压片，调节片重为0.5g/片，进行内外包装，检验，即得成品。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。。
以下实施例中所使用的原料均为市售商品，均可从市场购买所得。
实施例1
处方：
蛋白核小球藻250，黑枸杞150，复合氨基酸粉30，低聚果糖25，麦芽糊精30，硬脂酸镁3。
制备方法：
(1)按照原料药重量比例称取，净选；
(2)分别将蛋白核小球藻、黑枸杞、复合氨基酸粉、低果聚糖、麦芽糊精进行干燥，粉碎，过80目筛，备用；
(3)将步骤(2)所得细粉于高速混合机中混合10min，往混合均匀的混合粉内加入95％食用酒精，进行湿法制粒，过20目筛，得到湿颗粒；
(4)将颗粒置入沸腾干燥机中，干燥温度为50-60℃，干燥时间40-50min，至颗粒水分＜5％时，取出颗粒冷却至室温，过20目筛整粒；
(5)将整粒后的颗粒与硬脂酸镁(过80目筛)置三偏心混合机中混合20分钟，压片，调节片重为0.5g/片，进行内外包装，检验，即得成品。
实施例2
处方：
蛋白核小球藻300，黑枸杞100，复合氨基酸粉50，低聚果糖20，麦芽糊精25，硬脂酸镁5。
制备方法：
(1)按照原料药重量比例称取，净选；
(2)分别将蛋白核小球藻、黑枸杞、复合氨基酸粉、低果聚糖、麦芽糊精进行干燥，粉碎，过80目筛，备用；
(3)将步骤(2)所得细粉于高速混合机中混合10min，往混合均匀的混合粉内加入95％食用酒精，进行湿法制粒，过20目筛，得到湿颗粒；
(4)将颗粒置入沸腾干燥机中，干燥温度为50-60℃，干燥时间40-50min，至颗粒水分＜5％时，取出颗粒冷却至室温，过20目筛整粒；
(5)将整粒后的颗粒与硬脂酸镁(过80目筛)置三偏心混合机中混合20分钟，压片，调节片重为0.5g/片，进行内外包装，检验，即得成品。
实施例3
处方：
蛋白核小球藻350，黑枸杞50，复合氨基酸粉70，低聚果糖15，麦芽糊精20，硬脂酸镁7。
制备方法：
(1)按照原料药重量比例称取，净选；
(2)分别将蛋白核小球藻、黑枸杞、复合氨基酸粉、低果聚糖、麦芽糊精进行干燥，粉碎，过80目筛，备用；
(3)将步骤(2)所得细粉于高速混合机中混合10min，往混合均匀的混合粉内加入95％食用酒精，进行湿法制粒，过20目筛，得到湿颗粒；
(4)将颗粒置入沸腾干燥机中，干燥温度为50-60℃，干燥时间40-50min，至颗粒水分＜5％时，取出颗粒冷却至室温，过20目筛整粒；
(5)将整粒后的颗粒与硬脂酸镁(过80目筛)置三偏心混合机中混合20分钟，压片，调节片重为0.5g/片，进行内外包装，检验，即得成品。
为了证实本发明具有增加机体免疫力的作用，用按实施例2方法制成的压片糖果，进行了一下动物实验研究：
1实验材料
按实施例2方法制成的压片糖果配成高、中、低三个剂量组，剂量分别为：100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL。SPF级雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g，由广东省医学实验动物中心提供。二硝基氟苯(DNFB)，丙酮，麻油，硫化钡，绵羊血红细胞(CSRBC)，生理盐水，鸡红细胞，甲醇，Giemsa染液。
2实验方法
2.1剂量分组小鼠环境适应三天后，随机分为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4组，每组10只，各试验组按0.4mL/20g·BW分别每日一次灌胃给予低、中、高不同剂量的实施例2溶液，阴性对照组则灌胃给予相同体积的蒸馏水，连续30天，按照中华人民共和国卫生部颁布的《保健食品功能学评价程序和检验方法》评价蛋白核小球藻压片糖果的免疫功能。
2.2非特异性免疫功能的评价末次给药后24小时，颈椎脱臼处死小鼠，摘取胸腺和脾脏，称重，以胸腺和脾脏的重量指数mg/10g(体重)表示，比较组间差异。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)：取鸡血于有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝固定方向摇动，脱去纤维，用生理盐水洗涤3次，每次于2000r/min，离心分离10min，去除上清，用生理盐水配成20％(v/v)的鸡红细胞悬液，每只小鼠腹腔注射该悬液1mL，间隔30min后，颈椎脱臼处死小鼠，并将其仰位固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃温箱孵育30min。孵毕，置生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率(％)＝[吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数/计数的巨噬细胞数]×100％
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
2.3细胞免疫功能评价先用硫化钡在小鼠腹部皮肤约3cm×3cm范围内脱毛，然后用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5天后，用10μL的DNFB溶液均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，攻击24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，分别称重，以左、右耳片重量之差为肿胀度，按如下公式计算肿胀率：
肿胀率(％)＝[(试验侧一对照侧)/对照侧]×100％
2.4体液免疫功能评价从绵羊颈静脉取血，放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个固定方向摇动，脱去纤维，用生理盐水洗3次，每次于2000r/min离心分离10min，将积压的绵羊血红细胞用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，静置1小时，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，于2000r/min，离心分离10min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，并将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内，每孔100μL，再加入100μL0.5％(v/v)的绵羊血红细胞悬液，充分混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3小时，观察血球凝集程度，并计算抗体积数。
抗体积数计算公式如下：
抗体积数＝(S1+2S2+3S3+......+nSn)
其中1、2、3......n是对倍比稀释的指数，S指凝结程度的级别。
0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。
1级 红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞。
2级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
3级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
4级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
2.4统计分析 试验数据统计采用SPSS 11.0 forwindows软件进行方差分析。
3实验结果
3.1非特异性免疫功能的评价胸腺是T细胞的发源地，是免疫系统的中心器官，脾脏是血液通路中的滤过器官，是机体最大的免疫器官，是B细胞的居留地。脾指数上升，表明对B淋巴细胞的增殖和抗体的产生有促进作用。由表1可见，阴性对照组的小鼠在30天的生长期中，体重均值由原来的19.55克显著升高到了40.92克，低、中、高三个剂量的试验组中试验小鼠体重的增加趋势都与阴性对照组没有显著差异。阴性对照组的小鼠的脾指数均值和胸腺指数均值分别为0.42mg/10g体重和0.18mg/10g体重，三个试验组无论脾指数均值还是胸腺指数均值都与阴性对照组没有显著差异。
表1 蛋白核小球藻压片糖果对小鼠免疫脏器重量的影响(n＝10)
免疫器官产生的淋巴细胞中含有大量的吞噬细胞，在全身免疫和清除自身已衰老的红细胞等方面在重要作用。随着年龄的增长和机体的老龄化，免疫力低下，胸腺和脾脏会逐渐退化和萎缩，免疫刺激剂可使低下的免疫功能和免疫脏器恢复至正常水平。巨噬细胞在免疫应答的初级阶段起着主要的抗原递呈作用，具有多种免疫功能，是非特异性免疫的重要因素。实施例2对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响从表2的数据结果可以见到，阴性对照组的巨噬细胞的吞噬率均值为15.41％，低、中、高三个剂量组对应的巨噬细胞吞噬率均值分别为16.97％，23.06％和26.56％，可见吞噬率随着样品剂量的增加呈现出了不断升高的趋势，且中、高剂量组的增强效果经统计分析有显著性差异；阴性对照组的巨噬细胞的吞噬指数均值为0.2108，三个剂量组对应的巨噬细胞吞噬指数均值分别为0.2386，0.3271和0.3523，可见吞噬指数随着样品剂量的增加呈现出了不断升高的趋势，同样地，中、高剂量组的增强效果经SPSS统计分析有显著性差异。
表2 蛋白核小球藻压片糖果的非特异性免疫效果(吞噬率和吞噬指数)(n＝10)
3.2细胞免疫功能评价实施例2实验组动物对2，4-二硝基氟苯(DNFB)所致的迟发型变态反应增强，是因为体内抗体增加的缘故，当机体受到抗原DNFB刺激后，T细胞致敏并大量繁殖，当再次与抗原接触时，致敏的T细胞就分化为淋巴细胞释放各种淋巴因子，以攻击靶细胞，从而引起以局部淋巴细胞发炎为主的炎症反应。代表水肿程度的耳片重量之差增加，代表实施例2样品能提高机体的细胞免疫功能。由表3可知，随着试验剂量的增加，低、中、高三个剂量组的小鼠耳肿胀率出现了不断增加的趋势，其中中、高剂量组的迟发型变态反应与阴性对照组相比显著增强。
表3 蛋白核小球藻压片糖果对小鼠迟发性变态反应的影响(耳肿胀法)(n＝10)
3.3体液免疫功能评价绵羊红细胞SRBC是一种T细胞依赖性抗原，在T细胞的参与下，刺激被致敏的机体产生相应的抗体(溶血素)。抗体积数增加，反应出B细胞产生抗体的能力增强。低、中、高三个剂量组的实施例2溶液对抗体积数的增加均有显著地促进作用(见表4)，与阴性对照组10.4的抗体积数相均值比，对应的抗体积数均值分别增加到了22.26，32.38和50.22，而且，在不同剂量组之间也存在着显著的差异。
表4 蛋白核小球藻压片糖果对小鼠抗体数的影响(n＝10)
4实验结论
实验结果显示，实施例2低剂量组只在体液免疫的试验中表现出了显著增高的结果，而中、高剂量组在非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫的试验中均表现出了显著增高的结果，充分地说明了蛋白核小球藻压片糖果具有较强的免疫调节功效，能增强机体免疫功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。