耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103081807 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 103081807 B (21)申请号 201310040316.9 (22)申请日 2013.02.01 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院亚热带林业 研究所 地址 311400 浙江省杭州市富阳市大桥路 73 号 (72)发明人 范正琪 李纪元 李辛雷 殷恒福 吴斌 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33213 代理人 吴秉中 CN 101558742 A,2009.10.21,说明书第2页 第 1-8 段 . JP 特开20。

2、06-141252 A,2006.06.08,全文. CN 101558743 A,2009.10.21, 全文 . JP 平 2-92222 A,1990.04.03, 全文 . Ana Maria Vieitez,et alSomatic embryogenesis and plant regeneration from embryonic tissues of camellia japonica LPlant Cell,Tissue and Organ Culture .1990, 第 21 卷第 267-274 页 . 庄承纪等 . 云南山茶花茎尖培养中多芽体的 形成和生根的研究 .实。

3、验生物学报 .1997, 第 30 卷 ( 第 1 期 ), 第 1-11 页 . Kwang Soo Kim, et alAdventitious bud induction and Plant Regeneration from Cotyledon Explants of Camellia japonica LKorean J.Medicinal Crop Sci. .2005, 第 13 卷 ( 第 3 期 ), 第 105-108 页 . M.C.San-Jose, et alRegeneration of Camellia plantlets from leaf explant cu。

4、ltures by embryogenesis and caulogenesis. Scientia Horticulturae .1993, 第 54 卷第 303-315 页 . 董慧慧等 . 耐冬山茶愈伤组织诱导研究 . 福 建林业科技 .2007, 第 34 卷 ( 第 3 期 ), 第 135-154 页 . (54) 发明名称 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法 (57) 摘要 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 属于生 物技术领域。其特征在于包括以下步骤 ： 采集 9 月初的耐冬山茶果实， 消毒、 清洗 ； 剥去种子的内 外种皮， 接种于愈伤诱导培养基 ； 第 25-28 天将 材料转。

5、移至愈伤组织过渡培养基上 ； 待愈伤组织 由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至 愈伤组织分化不定芽培养基内 ； 材料成型并长至 3-4cm 的芽条， 其基部用 IBA 浸没处理， 然后转到 MV 液体培养基的纸桥上诱导生根， 20-22 天开始 启动， 透明略带红色的幼根长出， 再培养一段时间 之后， 幼根伸长并逐渐木质化。 上述耐冬山茶愈伤 组织再生植株的方法， 为耐冬山茶大规模无性繁 殖提供一种周期较短， 繁殖系数较高的方法， 也为 山茶分子育种奠定基础。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王涛 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局。

6、 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 103081807 B CN 103081807 B 1/2 页 2 1. 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1） 采集 9 月初的耐冬山茶果实， 剥去果皮， 用洗涤剂搓洗种子， 再用自来水搓洗至无泡 沫， 置于培养瓶中， 加入 75% 酒精进行第一次消毒清洗 8-12 秒， 然后纯净水清洗 2-3 遍， 沥 干水分， 盖上瓶盖， 置于无菌超净台备用 ； 2） 再次使用75酒精对种子表面消毒25-35秒， 接着使用0.1HgCl2浸泡6-10分钟， 然后用无菌水冲洗 5-6 遍， 清洗完毕后将。

7、种子铺在放有滤纸的平皿里吹干水分， 备用 ； 3） 剥去种子的内外种皮， 接种于愈伤诱导培养基上， 培养温度为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤诱导培养基为 MS 基本培养基中加入 0.4-0.6 mgL-12,4-D 和 1.8-2.2 mgL-1 6-BA， 愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2-4%， 琼 脂 0.6-0.8%， 灭菌前将 pH 调至 5.7-5.9， 120-125下灭菌 20-25 分钟 ； 4） 材料接入愈伤诱导培养基后 15-18 天后开始启动， 待第 25-28 天的时候诱导出的 细密的愈伤组织已经在材料与培。

8、养基接触的外围长满了厚实的一圈， 淡黄色， 泛着些许绿 色、 晶莹、 剔透， 这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上， 培养温度为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤组织过渡培养基 为 MS 基本培养基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg L-16-BA ； 5）材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养， 待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一 点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内， 培养温度为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤。

9、组织分化不定芽培养基为 MS 基本培养 基中加入 0.4-0.6 mg L-1NAA + 9-11 mg L-1 6-BA 或者 MS 基本培养基中加入 0.4-0.6 mg L-1IBA + 9-11 mg L-16-BA ； 6） 材料成型并长至3-4cm的芽条， 其基部用500-550mgL-1的IBA浸没处理20-25min， 然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 molm-2s-1的光照强度下诱导生根 ； 诱 导生根阶段， 采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 gL-1， 20-22天开始启动， 透明略带红色 的幼根长出， 再培养一段时间之后， 幼根伸长并逐渐木质化 ； 所。

10、述的 MV 液体培养基由以下成分构成 ： KNO3 80mg/L、 Ca(NO3)24H2O 150mg/L、 KCl 65mg/L、 MgSO47H2O 350mg/L、 NaH2PO4H2O 100 mg/L、 Na2SO4200mg/L、 MnSO4H2O22.3mg/ L、 ZnSO47H2O8.6mg/L、 CoCl26H2O0.025mg/L、 CuSO45H2O0.025mg/L、 H3BO36.2mg/L、 Na2MO42H2O0.25mg/L、 KI0.83mg/L、 FeSO47H2O 28.7mg/L、 Na2-EDTA 37.3mg/L、 烟酸 0.5mg/ L、 盐酸。

11、吡多醇 0.5mg/L、 盐酸硫胺素 0.1mg/L、 肌醇 100mg/L、 甘氨酸 2.0mg/L。 2. 如权利要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 1） 中 ： 第 一次消毒清洗时间 9-10 秒。 3. 如权利要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 2） 中 ： 再 次使用 75酒精对种子表面消毒 28-30 秒， 接着使用 0.1 HgCl2浸泡 8-9 分钟。 4. 如权利要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 3） 中 ： 光 照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的。

12、愈伤诱导培养基为 MS 基本培养基中 加入0.5 mgL-12,4-D 和1.9-2.0 mgL-1 6-BA， 愈伤诱导培养基中蔗糖含量为3%， 琼脂 0.7%， 灭菌前将 pH 调至 5.8， 122下灭菌 22 分钟。 5. 如权利要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 光 照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的愈伤组织过渡培养基为 MS 基本培养 权 利 要 求 书 CN 103081807 B 2 2/2 页 3 基中加入 0.11-0.13 mg L-1NAA + 2.1 mg L-16-BA。 6. 如权利。

13、要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 5） 中 ： 光照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的愈伤组织分化不定芽培养基为 MS 基本培养基中加入 0.5 mg L-1NAA + 10 mg L-1 6-BA 或者 MS 基本培养基中加入 0.5mg L-1IBA + 10 mg L-16-BA。 7. 如权利要求 1 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 6） 中 ： 材料基部用 520-530mg L-1的 IBA 浸没处理 21-23min ； MV 液体培养基的纸桥上在 120-150mol m-2 s-1的光。

14、照强度下诱导生根 ； MV 液体培养基加入蔗糖 16-18 g L-1。 权 利 要 求 书 CN 103081807 B 3 1/5 页 4 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体为耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法。 背景技术 0002 耐冬山茶为第三纪的残遗植物种类， 因地壳运动， 使得青岛耐冬与外界山茶基因 交流甚少， 从而保留了古老而独具特色的遗传特性。从观赏角度而言， 耐冬山茶花色艳丽， 花型优美， 为青岛市花 ； 同时， 其叶茎花亦可入药， 用于预防和治疗多种疾病， 极具医疗应用 前景 ； 不仅如此， 耐冬山茶还具有很强的 CO2吸收能力，。

15、 且对 H2S 等有害气体具有较强的抗 性， 故亦具有净化空气等环保作用， 可谓全身是宝。 0003 目前生产上使用的种苗仍是以传统方式培育为主。 然而， 山茶的生长速度慢， 繁殖 系数低， 靠嫁接、 扦插等传统方式培育， 完全不能满足市场的需求。而关于山茶属植物的组 织培养， 国内从 20 世纪 80 年代开始就有诸多研究工作， 并取得了可喜的进展。采用山茶种 子的子叶、 幼龄山茶花的茎尖与带芽茎节、 成年山茶花的茎尖与带芽茎节等， 作为外植体均 可获得再生植物。现阶段通过 “芽生芽” 这种茎段培养的方式得到耐冬山茶的例子已有， 而 对于耐冬山茶由愈伤组织诱导到不定芽分化的例子却鲜有报道， 。

16、也未见专利申请。 发明内容 0004 针对现有技术中存在的上述问题， 本发明的目的在于设计提供一种耐冬山茶愈伤 组织再生植株的方法的技术方案， 采用该方法繁殖系数较高， 周期较短， 同时也为山茶分子 育种奠定基础。 0005 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0006 1） 采集 9 月初的耐冬山茶果实， 剥去果皮， 用洗涤剂搓洗种子， 再用自来水搓洗至 无泡沫， 置于培养瓶中， 加入 75% 酒精进行第一次消毒清洗 8-12 秒， 然后纯净水清洗 2-3 遍， 沥干水分， 盖上瓶盖， 置于无菌超净台备用 ； 0007 2） 再次使用 75酒精对种子表面消毒 。

17、25-35 秒， 接着使用 0.1 HgCl2浸泡 6-10 分钟， 然后用无菌水冲洗 5-6 遍， 清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分， 备 用 ； 0008 3） 剥去种子的内外种皮， 接种于愈伤诱导培养基上， 培养温度为 252， 光照光 强为25003000 Lx， 光照时间为10-12h/d ； 所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加 入0.4-0.6 mgL-12,4-D 和 1.8-2.2 mgL-1 6-BA， 愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2-4%， 琼脂 0.6-0.8%， 灭菌前将 PH 调至 5.7-5.9， 120-125下灭菌 20-25 分钟 ； 000。

18、9 4） 材料接入愈伤诱导培养基后 15-18 天后开始启动， 待第 25-28 天的时候诱导出 的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈， 淡黄色， 泛着些许 绿色、 晶莹、 剔透， 这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上， 培养温度 为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤组织过渡培养 基为 MS 基本培养基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg L-16-BA ； 说 明 书 CN 103081807 B 4 2/5 页 5 0010 5） 材料在愈伤组织过渡培养基。

19、内进行培养， 待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一 点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内， 培养温度为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤组织分化不定芽培养基为 MS 基本培养 基中加入 0.4-0.6 mg L-1NAA + 9-11 mg L-1 6-BA 或者 MS 基本培养基中加入 0.4-0.6 mg L-1IBA + 9-11 mg L-16-BA ； 0011 6）材料成型并长至 3-4cm 的芽条， 其基部用 500-550mg L-1的 IBA 浸没处理 20-25min， 然后转到 MV 液体培养基的纸桥上在。

20、 100-200 mol m-2 s-1下诱导生根 ； 诱 导生根阶段， 采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 gL-1， 20-22天开始启动， 透明略带红色 的幼根长出， 再培养一段时间之后， 幼根伸长并逐渐木质化。 0012 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 1） 中 ： 第一次消毒清 洗时间 9-10 秒。 0013 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 2） 中 ： 再次使用 75 酒精对种子表面消毒 28-30 秒， 接着使用 0.1 HgCl2浸泡 8-9 分钟。 0014 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 3） 中 。

21、： 光照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的愈伤诱导培养基为 MS 基本培养基中加入 0.5 mg L-12,4-D 和 1.9-2.0 mg L-1 6-BA， 愈伤诱导培养基中蔗糖含量为 3%， 琼脂 0.7%， 灭 菌前将 PH 调至 5.8， 122下灭菌 22 分钟。 0015 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 4） 中 ： 光照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的愈伤组织过渡培养基为 MS 基本培养基中加入 0.11-0.13 mg L-1NAA + 2.1 mg L-16-BA。 0016 。

22、所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 5） 中 ： 光照光强为 2600 2800 Lx， 光照时间为 11h/d ； 所述的愈伤组织分化不定芽培养基为 MS 基本培养基 中加入 0.5 mg L-1NAA + 10 mg L-1 6-BA 或者 MS 基本培养基中加入 0.5mg L-1IBA + 10 mg L-16-BA。 0017 所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于步骤 6）中 ： 材料 基 部 用 520-530mg L-1的 IBA 浸 没 处 理 21-23min ； MV 液 体 培 养 基 的 纸 桥 上 在 120-150mol m-2 s。

23、-1下诱导生根 ； MV 液体培养基加入蔗糖 16-18 g L-1。 0018 所述的 2,4-D， 别 名 ： (2,4- 二氯苯氧基 ) 乙酸， 2,4-D 酸， 2,4-D 属于苯氧类物 质， 是一种人工合成的植物激素具有与生长素 （IAA） 相似的生理效应， 2,4-D 主要用于蔬菜 开花期沾花， 2,4-D 因用量和浓度不同， 对同一作物组织有不同的效果， 浓度低时可促进坐 果和无籽果实的发育， 浓度稍高就会引起生长上的畸形 ； 更高浓度可以杀死植物， 作除草剂 用， 能够除去多种双子叶杂草。 0019 所述的 6-BA， 化学名称 ： 6- 苄氨基腺嘌呤， 别 名 ： 6- 苄氨。

24、基嘌呤、 细胞分裂素， 6-BA具有高效、 稳定、 廉价和易于使用等特点,因而被广泛采用,并且是组织培养者最喜爱 的细胞分裂素。BA 的主要作用是促进芽的形成 , 也可以诱导愈伤组织发生， 可用于提高茶 叶、 烟草的质量及产量 ； 蔬菜、 水果的保鲜和无根豆芽的培育， 明显提高果品及叶片的品质。 0020 所述的 NAA， 也称 a- 萘乙酸， 是广谱型植物生长调节剂， 能促进细胞分裂与扩大， 诱导形成不定根增加坐果， 防止落果， 改变雌、 雄花比率等。可经叶片、 树枝的嫩表皮， 种子 进入到植株内， 随营养流输导到全株。 适用于谷类作物， 增加分蘖， 提高成穗率和千粒重 ； 棉 说 明 书 。

25、CN 103081807 B 5 3/5 页 6 花减少蕾铃脱落， 增桃增重， 提高质量。果树促开花， 防落果、 催熟增产。瓜果类蔬菜防止落 花， 形成小籽果实 ； 促进扦插枝条生根等。萘乙酸在植物组培中很是常用， 但组培需要无菌 环境， 这就需要对萘乙酸所配的溶液进行灭菌， 选用的灭菌方法很重要， 因为萘乙酸属于激 素， 若经过高温蒸汽灭菌会失活， 所以通常采用过滤除菌。 0021 所述的 IBA， 也叫吲哚丁酸 , 促进植物主根生长， 提高发芽率， 成活率， 用于促使插 条生根。 0022 上述耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法， 为耐冬山茶大规模无性繁殖提供一种周 期较短， 繁殖系数较高的方。

26、法， 也为山茶分子育种奠定基础。 具体实施方式 0023 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。 0024 1） 采集 9 月初的耐冬山茶果实， 剥去果皮， 用洗洁精搓洗种子， 再用自来水搓洗至 无泡沫， 置于培养瓶中， 加入 75% 酒精进行第一次消毒清洗 8-12 秒， 然后纯净水清洗 2-3 遍， 沥干水分， 盖上瓶盖， 置于无菌超净台备用 ； 0025 2） 再次使用 75酒精对种子表面消毒 25-35 秒， 接着使用 0.1 HgCl2浸泡 6-10 分钟， 然后用无菌水冲洗 5-6 遍， 清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分， 备 用 ； 0026 3） 剥去种子的内外。

27、种皮， 接种于愈伤诱导培养基上， 培养温度为 252， 光照光 强为25003000 Lx， 光照时间为10-12h/d ； 所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加 入0.4-0.6 mgL-12,4-D 和 1.8-2.2 mgL-1 6-BA， 愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2-4%， 琼脂 0.6-0.8%， 灭菌前将 PH 调至 5.7-5.9， 120-125下灭菌 20-25 分钟 ； 0027 4） 材料接入愈伤诱导培养基后 15-18 天后开始启动， 待第 25-28 天的时候诱导出 的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈， 淡黄色， 泛着些许 绿色、 晶莹。

28、、 剔透， 这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上， 培养温度 为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的愈伤组织过渡培养 基为 MS 基本培养基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg L-16-BA， 主要作用为 中和愈伤诱导阶段 2,4-D 的后续效应 ； 0028 5） 材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养， 待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一 点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内， 培养温度为 252， 光照光强为 2500 3000 Lx， 光照时间为 10-12h/d ； 所述的。

29、愈伤组织分化不定芽培养基为 MS 基本培养 基中加入 0.4-0.6 mg L-1NAA + 9-11 mg L-1 6-BA 或者 MS 基本培养基中加入 0.4-0.6 mg L-1IBA + 9-11 mg L-16-BA ； 0029 6）材料成型并长至 3-4cm 的芽条， 其基部用 500-550mg L-1的 IBA 浸没处理 20-25min， 然后转到 MV 液体培养基的纸桥上在 100-200 mol m-2 s-1下诱导生根 ； 诱 导生根阶段， 采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 gL-1， 20-22天开始启动， 透明略带红色 的幼根长出， 再培养一段时间之后， 幼根伸长并逐渐木质化。 0030 本发明的主要利用耐冬子叶诱导愈伤组织， 在对愈伤组织进行状态调整的基础 上， 利用特定激素配比的 MS 培养基进行不定芽分化， 最后利用 “滤纸桥生根法” 解决山茶难 以生根的技术难题， 从而实现耐冬愈伤组织诱导及植株的再生。 说 明 书 CN 103081807 B 6 4/5 页 7 0031 本发明所述的两类培养及具体配方如下 ： 0032 0033 说 明 书 CN 103081807 B 7 5/5 页 8 说 明 书 CN 103081807 B 8 。