一种抗肿瘤药物组合物.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610079038.1 (22)申请日 2016.02.04 (71)申请人 华中科技大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037号 (72)发明人 胡豫 张波 姜婷 梅恒 石威 唐亮 邓君 (74)专利代理机构 华中科技大学专利中心 42201 代理人 曹葆青 (51)Int.Cl. A61K 45/06(2006.01) A61K 38/49(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 9/10(2006.01) A61P 35/0。

2、0(2006.01) A61K 31/337(2006.01) (54)发明名称 一种抗肿瘤药物组合物 (57)摘要 本发明公开了一种抗肿瘤药物组合物， 包括 两周给药剂量的纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制 剂。 本发明采用纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制剂 结合， 并控制纤维蛋白调控药物的用量， 从而提 高肿瘤抑制剂的递送效果， 在维持血管正常功能 的前提下， 尽可能的靶向给药， 从而达到良好的 抗肿瘤效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105709227 A 2016.06.29 CN 105709227 A 1.一种抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 包括两周给药剂量的纤维蛋白调控药物。

3、和肿 瘤抑制剂。 2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述纤维蛋白调控药物为溶栓 药物和/或抗凝药物。 3.如权利要求2所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述溶栓药物为链激酶、 尿激 酶、 组织型纤溶酶原激活剂、 重组组织型纤溶酶原激活剂、 单链尿激酶型纤维蛋白溶酶厥徽 活剂、 或乙酰化纤溶酶厥-链激酶激活剂复合物。 4.如权利要求2所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述抗凝药物为注射用抗凝药 物、 口服抗凝药物或凝血酶抑制剂； 所述注射用抗凝药物优选肝素、 小分子肝素； 所述口服 抗凝药物优选华法林、 双香豆素， 硝酸香豆素； 所述凝血酶抑制剂优选水蛭素或阿加。

4、曲班。 5.如权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述肿瘤抑制剂为游离肿瘤抑 制剂和/或肿瘤抑制剂纳米制剂。 6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述肿瘤抑制剂为紫杉醇、 阿 霉素、 多柔比星或基因药物。 7.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述纳米制剂为聚乙二醇-高 分子材料纳米乳。 8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 所述高分子材料为聚乳酸、 聚 乳酸-聚羟基乙酸、 聚己内酯或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105709227 A 2 一种抗肿瘤药物组合物 技术领域 0001 本发明。

5、属于生物医药领域， 更具体地， 涉及一种抗肿瘤药物组合物。 背景技术 0002 肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下， 局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。 新生物一旦形成， 不因病因消除而停止 生长， 他的生长不受正常机体生理调节， 而是破坏正常组织与器官， 这一点在恶性肿瘤尤其 明显。 与良性肿瘤相比， 恶性肿瘤生长速度快， 呈浸润性生长， 易发生出血、 坏死、 溃疡等， 并 常有远处转移， 造成人体消瘦、 无力、 贫血、 食欲不振、 发热以及严重的脏器功能受损等， 最 终造成患者死亡。 0003 目前抗肿瘤药物是研究热点， 更有效的抗肿瘤药物， 。

6、仍有待研发。 发明内容 0004 针对现有技术的以上缺陷或改进需求， 本发明提供了一种抗肿瘤药物组合物， 其 目的在于通过纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制剂的有机结合， 由此提供一种具有优良抗癌效 果和较佳靶向的抗肿瘤组合物。 0005 为实现上述目的， 按照本发明的一个方面， 提供了一种抗肿瘤药物组合物， 包括两 周给药剂量的纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制剂。 0006 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其纤维蛋白调控药物为溶栓药物和/或抗凝药 物。 0007 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其溶栓药物为链激酶、 尿激酶、 组织型纤溶酶原 激活剂、 重组组织型纤溶酶原激活剂、 单链尿激酶型纤维蛋白溶。

7、酶厥徽活剂、 或乙酰化纤溶 酶厥-链激酶激活剂复合物。 0008 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其抗凝药物为注射用抗凝药物、 口服抗凝药物或 凝血酶抑制剂； 所述注射用抗凝药物优选肝素、 小分子肝素； 所述口服抗凝药物优选华法 林、 双香豆素， 硝酸香豆素； 所述凝血酶抑制剂优选水蛭素或阿加曲班。 0009 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其肿瘤抑制剂为游离肿瘤抑制剂和/或肿瘤抑制 剂纳米制剂。 0010 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其瘤抑制剂为紫杉醇、 阿霉素、 多柔比星或基因 药物。 0011 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其纳米制剂为聚乙二醇-高分子材料纳米乳。 0012。

8、 优选地， 所述抗肿瘤药物组合物， 其高分子材料为聚乳酸、 聚乳酸-聚羟基乙酸、 聚 己内酯或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。 0013 总体而言， 通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比， 能够取得下列有 益效果： 0014 本发明采用纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制剂结合， 并控制纤维蛋白调控药物的用 说 明 书 1/5 页 3 CN 105709227 A 3 量， 从而提高肿瘤抑制剂的递送效果， 通过增加具有正常功能的血管数量， 来增加抗肿瘤药 物的递送， 从而达到良好的抗肿瘤效果。 附图说明 0015 图1是实施例1建立荷A549肺癌的皮下肿瘤模型， 检测rtPA给药对肿瘤内纤维蛋白 表达影响。

9、的实验结果； 其中图1A为免疫荧光实验结果， 图1B为Elisa结果。 0016 图2是实施例2中rtPA对肿瘤内血流灌注的影响， 并与生理盐水组比较； 其中图2A 为免疫荧光实验结果， 图2B为Image J统计的半定量结果。 0017 图3是实施例2纳米粒的表征结果， 图A为电镜结果， 图B为粒径仪测试结果。 0018 图4是实施例3建立荷A549肺癌的皮下肿瘤模型， 用近红外染料DiR标记纳米粒， 观 察纳米粒在rtPA处理组及生理盐水组肿瘤内的分布差异。 0019 图5是实施例4建立荷A549肺癌的皮下肿瘤模型， 用香豆素-6标记纳米粒， 观察纳 米粒在rtPA处理组及生理盐水组肿瘤切。

10、片内的分布差异。 0020 图6是实施例5及实施例6建立荷A549肺癌皮下肿瘤动物模型， 评价rtPA联合纳米 药物对胰腺癌的治疗情况。 共分为四组： 生理盐水组， rtPA组， 生理盐水+NP-PTX组和rtPA+ NP-PTX组； 图6A为肿瘤的体积变化， 图6B为动物体重变化， 图6C为处死动物后剥离的肿瘤， 图6D为剥离肿瘤的重量， 图6E为上述剥离的肿瘤行石蜡包埋切片后的TUNEI凋亡染色(放大 倍数分别为100倍)。 具体实施方式 0021 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例。

11、仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 此外， 下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 0022 本发明提供的抗肿瘤药物组合物， 包括两周给药剂量的纤维蛋白调控药物和肿瘤 抑制剂。 0023 所述纤维蛋白调控药物为溶栓药物和/或抗凝药物。 所述溶栓药物为链激酶、 尿激 酶、 组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、 重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)、 单链尿激酶型纤维 蛋白溶酶厥徽活剂(SCUPA)、 或乙酰化纤溶酶厥-链激酶激活剂复合物(APSAC)。 所述抗凝药 物为注射用抗凝药物、 口服抗凝药物或凝血酶抑制剂； 所述注射用抗凝药物优选。

12、肝素、 小分 子肝素； 所述口服抗凝药物优选华法林、 双香豆素， 硝酸香豆素； 所述凝血酶抑制剂优选水 蛭素或阿加曲班。 0024 所述肿瘤抑制剂为游离肿瘤抑制剂和/或肿瘤抑制剂纳米制剂。 所述肿瘤抑制剂 为紫杉醇、 阿霉素、 多柔比星或基因药物。 所 0025 所述肿瘤抑制剂的纳米制剂， 优选为表面聚乙二醇修饰的脂质体、 纳米粒、 聚合物 泡囊、 聚合物胶束、 固体脂质纳米粒。 肿瘤抑制剂以包裹或共价连接的方式与纳米载体结 合， 所述纳米制剂粒径为10-300nm。 0026 述纳米制剂进一步优选为聚乙二醇-高分子材料纳米乳。 所述高分子材料为聚乳 酸、 聚乳酸-聚羟基乙酸、 聚己内酯或二硬。

13、脂酰磷脂酰乙醇胺。 聚乙二醇分子量为1000- 说 明 书 2/5 页 4 CN 105709227 A 4 20000Da， 优选2000-5000Da， 聚乳酸分子量为5000-50000Da， 优选20000-4000Da。 0027 本发明抗肿瘤组合物的抗肿瘤效果按照如下方法测定： 0028 以PEG-PLA为载体， 采用单乳法制备纳米粒。 Zeta/激光粒度仪测定纳米粒的平均 粒径和电位， 透射电镜观察其形态。 0029 建立皮下荷A549肺癌动物模型， 调控肿瘤内纤维蛋白的形成后， 通过免疫荧光和 Elisa技术评价肿瘤内纤维蛋白的变化情况。 0030 采用免疫荧光评价调控肿瘤内纤。

14、维蛋白后， 肿瘤内部灌流的变化情况。 0031 用红外染料DiR标记纳米粒后， 通过小动物活体成像仪评价调控肿瘤内纤维蛋白 后， 纳米载体在实验组和对照组的肿瘤内富集差异。 0032 用绿色荧光探针香豆素-6标记纳米粒后， 通过冰冻切片观察调控肿瘤内纤维蛋白 后后， 纳米载体在实验组和对照组的肿瘤内分布差异。 0033 通过肿瘤生长抑制实验， 评价本发明提供的抗肿瘤组合物对A549肿瘤的抑制效 果。 0034 本发明提供的组合物具有良好的抗肿瘤效果， 可能是由于以下原因： 0035 肿瘤内部的有效血液灌流是肿瘤递药的基础。 肿瘤的新生血管由于周细胞缺乏， 基底膜不完整而功能不完善， 加上细胞外。

15、基质在一定程度上挤压瘤内血管， 肿瘤内的血流 灌注往往低于周围正常组织， 从而阻止药物有效到达肿瘤从而影响肿瘤的药物递送。 为了 增加肿瘤内的灌注， 血管丰富和基质丰富的肿瘤其策略有所不同。 针对血管丰富的肿瘤， 既 往研究一般采用血管正常化的手段。 由于这种促进血管正常化的手段在一定程度上减少了 血管内皮细胞之间的空隙， 一般只能增加小分子药物或者粒径偏小的纳米药物(10-40nm) 的递送， 无法增加100nm左右的纳米药物的递送。 0036 纤维蛋白作为凝血瀑布的终产物， 除了在内皮损伤部位富集外， 还可以作为肿瘤 基质的成分之一在肿瘤细胞外沉积， 并且呈交联状态， 与血栓、 损伤部位的。

16、纤维蛋白结构类 似。 肿瘤基质中纤维蛋白主要是由于肿瘤血管的渗漏性以及肿瘤细胞表面的组织因子共同 作用而形成。 正常组织由于血管内皮的完整性而不会有纤维蛋白的表达。 纤维蛋白除了具 备高度的肿瘤特异性外， 其瘤内分布也在存在一定的位置特异性。 对于血管较为丰富的肿 瘤， 肿瘤内的纤维蛋白主要分布于血管附近， 这是由于纤维蛋白原渗入血管后即被肿瘤内 过表达的组织因子所启动的凝血瀑布转化为纤维蛋白所致。 大量的纤维蛋白可能会对肿瘤 内血管造成一定程度的挤压， 从而减少肿瘤内的血流灌注而进一步减弱肿瘤的药物递送。 0037 本发明采用纤维蛋白调控药物和肿瘤抑制剂结合， 并控制纤维蛋白调控药物的用 量。

17、， 从而提高肿瘤抑制剂的递送效果， 通过增加具有正常功能的血管数目， 来增加药物递 送， 从而达到良好的抗肿瘤效果。 0038 以下为实施例： 0039 实施例1 0040 荷A549肺癌模型小鼠经过rtPA连续两周(剂量为25mg/kg/d)腹腔注射后， 制备冰 冻切片。 免疫荧光染色结果显示， 生理盐水组纤维蛋白呈条索状分布在血管周围， 而在远离 血管处分布很少(图1A， B)。 而rtPA处理后， 肿瘤内纤维蛋白断裂呈散在分布(图1C， D)， 说明 rtPA可以有效降解肿瘤内纤维蛋白。 进一步通过Elisa定量分析发现纤维蛋白的特异性降 解产物D-二聚体在rtPA处理组约为对照组的2.。

18、3倍， 再次证明rtPA对肿瘤内纤维蛋白的有 说 明 书 3/5 页 5 CN 105709227 A 5 效破坏。 0041 实施例2 0042rtPA给药结束后尾静脉给予488标记的凝集素(488- lectin)， 剂量为5mg/kg， 1h后二氧化碳窒息处死动物后迅速用PBS及4多聚甲醛溶液灌 流， 并制备冰冻切片。 CD31免疫荧光染色后， 共聚焦显微镜分析功能化血管(488 +CD31+)占所有血管(CD31+)的比例， 结果显示， rtPA处理后， 肿瘤内部功能化的血管明显增 多， 从生理盐水组的38.33.9增加到了75.57.0， 大大提升了肿瘤内的血流灌注(图 2)。 我们。

19、推测主要是因为rtPA破坏了肿瘤血管附近的纤维蛋白， 解除了纤维蛋白对肿瘤血 管的挤压， 使得部分原先受挤压的血管在挤压解除后重新获得灌流， 成为有功能的血管， 为 纳米药物的有效递送建立了条件。 0043 实施例3 0044 纳米粒采用单次乳化法制备。 24mg的聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)， 用1mL二氯甲 烷溶解后加入到5mL 0.6的胆酸钠溶液中， 之后冰水浴5s/5s脉冲超声15次， 功率为200W。 旋转蒸发除去二氯甲烷后浓缩至合适浓度即得未修饰纳米粒(NP)。 粒度/电位测定仪结果 显示纳米粒粒径为115.50.7nm(图3A)， 电位为11.50.6mv， 电镜下纳米粒。

20、子大小均一， 分散性好， 表面光滑呈规则圆球形(图3B)。 0045 实施例4 0046 rtPA给药结束后， 用近红外染料DiR标记纳米粒， 按10 g/kg剂量尾静脉给药后24h 采用小动物活体成像仪检测纳米粒在肿瘤部位的聚集程度， 结果提示rtPA处理更有利于纳 米粒在肿瘤内聚(图4A左边： rtPA， 右边： 生理盐水组)， 离体组织成像及半定量结果证实， rtPA处理组的肿瘤组织内平均荧光强度是生理盐水组肿瘤组织的2.0倍左右(图4B和C)， 而 实验组与对照组相比， 正常器官中的平均荧光值没有显著性差异(图4D和E)。 说明rtPA的处 理可以有效增加纳米粒在肿瘤组织内的分布， 但。

21、是对正常器官内的纳米粒分布没有影响。 0047 实施例5 0048 rtPA给药结束后， 用绿色荧光探针香豆素-6标记纳米粒， 按0.05mg/kg剂量尾静脉 给药后4h， 灌流并制备冰冻切片。 共聚焦显微镜观察结果显示， rtPA处理组纳米粒子可以广 泛地分布在肿瘤内部， 并到达距离血管较远处的肿瘤部位(图5， C， D)。 而生理盐水中， 纳米 粒子主要部分在血管附近， 且荧光较rtPA组更弱(图5， A， B)。 我们推测是由于rtPA的作用破 坏了血管附近的纤维蛋白， 解除了血管挤压并减弱了可能存在的纳米药物穿透阻力， 可以 将纳米药物有效递送到肿瘤组织并较为均一地分布到整个肿瘤组织中。

22、。 0049 实施例6 0050 待肿瘤直径达到4-5mm时， 将24只荷瘤裸鼠模型平均分成四组， 每组6只。 a， 对照组 (两周生理盐水腹腔注射， 从第二周开始尾静脉给予生理盐水)； b， rtPA组(两周rtPA腹腔注 射， 从第二周开始尾静脉给予生理盐水)； c， NP-PTX组(两周生理盐水腹腔注射， 从第二周开 始尾静脉给予NP-PTX)； d， rtPA+NP-PTX组(两周rtPA腹腔注射， 从第二周开始尾静脉给予 NP-PTX)。 尾静脉给药开始计为第0天， PTX给药剂量为8mg/kg， 每两天给药一次， 实验期间每 两天记录一次肿瘤的大小和荷瘤小鼠的体重。 给药结束后继续。

23、监测4天后二氧化碳窒息法 处死动物， 取肿瘤组织， 称重并制备冰冻切片， 参照TUNEL试剂盒的说明书进行凋亡染色， 采 说 明 书 4/5 页 6 CN 105709227 A 6 用1 g/ml的Hochest33342室温染色5min， PBS洗三次后置于荧光显微镜下观察不同处理组 肿瘤组织内肿瘤细胞凋亡的状况。 根据记录的裸鼠的重量绘制小鼠体重变化曲线， 计算肿 瘤生长抑制率。 肿瘤体积变化曲线显示， 生理盐水组肿瘤持续增长， 仅给予rtPA组的肿瘤增 长情况与生理盐水组类似。 而仅给予NP-PTX组可以一定程度抑制肿瘤的生长。 在给予rtPA 的基础上， NP-PTX可以较单给药NP。

24、-PTX组更为显著地抑制肿瘤的生长(图6A， C， D)。 NP-PTX 及rtPA+NP-PTX组对肿瘤生长的肿瘤重量抑制率分别为： 35.7和73.7， 对肿瘤体积抑制 率分别为42.8和71.7。 整个实验期间， 各组荷瘤小鼠的体重无明显差异(图6B)， 说明 PTX剂量在小鼠可承受范围内， 未引起明显毒副作用。 TUNEL染色结果显示生理盐水组与 rtPA组仅有散在的单个细胞凋亡， 而NP-PTX组可以引起略多的肿瘤细胞凋亡， rtPA+NP-PTX 组则可以引起肿瘤组织内广泛的细胞凋亡(图6E)(从左至右依次为对照组， rtPA组， NP-PTX 组和rtPA+NP-PTX组)， 该结果与反应肿瘤生长情况的肿瘤体积变化曲线相一致。 0051 本领域的技术人员容易理解， 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以 限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含 在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105709227 A 7 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 105709227 A 8 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 105709227 A 9 。