一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811220216.3 (22)申请日 2018.10.19 (71)申请人 中国科学院新疆生态与地理研究所 地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市北京南路40号附3号 (72)发明人 张道远 张燕 刘晓洁 李小双 杨红兰 (74)专利代理机构 乌鲁木齐中科新兴专利事务 所(普通合伙) 65106 代理人 张莉 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生 体系建立的方法 (57)摘要 本发明。

2、属于植物组织培养技术领域， 涉及一 种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建 立的方法， 该方法是由愈伤组织及不定芽的诱 导， 不定芽增殖， 生根培养以及炼苗和移栽步骤 完成， 通过本发明提供的方法， 愈伤组织诱导率 为100%， 不定芽的最高诱导率为30%， 生根和幼苗 成活率分别可达85%和90%。 本发明所述方法为新 疆野苹果的种质保存和遗传转化研究提供基础。 本发明所述方法适用于多种环境， 尤其是新疆， 甘肃等空气湿度低的地方， 大大提高了组培植物 的存活率， 省时省力。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 109169287 A 2019.01.11 CN 109169287。

3、 A 1.一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 其特征在于： 该方法以 叶片为外植体， 愈伤组织诱导及不定芽的诱导， 不定芽的增殖， 生根培养以及炼苗和移栽， 具体操作按下列步骤进行： 愈伤组织及不定芽的诱导： a、 取实验室继代生长的新疆野苹果无菌苗40d叶龄大小的幼嫩完全展开叶片为外植 体， 去掉叶柄部分， 用解剖刀垂直于叶片中央叶脉横切， 将叶片等分为两部分， 以叶片远轴 端为接触面， 接种到诱导培养基中继代2次， 每25天一次， 黑暗培养三周后， 2000lx光照培 养， 光照时间16小时， 培养温度为242， 培养7天后， 肉眼可在切口处见黄色愈伤组织， 20 天左右。

4、在叶片切口处的愈伤组织看到有不定芽的分化， 其中诱导培养基为以MS为基础培养 基， 附加30g/L蔗糖， 琼脂6g/L， 激素为NAA 0.0-2.0mg/L， TDZ 1.0-5.0mg/L或6-BA 1.0- 5.0mg/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 不定芽的增殖： b、 将步骤a诱导出的不定芽切下， 插到不定芽增殖培养基中， 培养条件为黑暗培养三周 后， 2000lx光照培养， 光照时间16小时， 培养温度为242， 培养15天后长成1-4cm丛生芽 或幼苗， 增值倍数达3-5倍， 其中不定芽增殖培养基为以MS为基础培养基， 附加30g/L蔗糖， 琼脂6。

5、g/L， 激素为6-BA 0.4mg/L， NAA 0.0-0.1mg/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115 ， 30分钟； 生根培养： c、 将步骤b得到的3cm幼苗， 沿茎基部切下， 接种到生根培养基上， 约10天可在茎基部看 到粉红色的根尖， 25天可长出3-5条根， 其中生根培养基为以1/2MS为基础培养基， 蔗糖15- 30g/L， NAA 0.0-1.0mg/L， 琼脂6g/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 炼苗和移栽： d、 取株高5cm， 有3-5条根的健壮幼苗移栽到已经湿润的基质中， 基质为营养土:蛭石3: 1， 将幼苗移栽进基质后，。

6、 在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜， 期间每天向膜内喷水， 光照 强度减半， 光照时间为16小时， 培养温度为242， 7天后揭开保鲜膜呈半开状态， 正常光 照下培养且仍需每天向膜内喷水， 直至移栽后第一片新叶完全展开， 即可完全撤去保鲜膜， 此后恢复正常浇水。 2.根据权利要求1所述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 其 特征在于步骤a中诱导培养基中的激素为TDZ 4mg/L、 NAA 1.0 mg/L。 3.根据权利要求1所述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 其 特征在于步骤b中不定芽增殖培养基激素浓度为6-BA 0.4mg/L。 4.根据权利要求1所。

7、述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 其 特征在于步骤c中生根培养基为1/2MS+15g蔗糖+0.1mg/L NAA。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109169287 A 2 一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体涉及到一种基于愈伤组织分化的新疆野 苹果再生体系建立的方法。 背景技术 0002 新疆野苹果(Malus sieversii)又名塞威士苹果， 属苹果属， 是世界栽培苹果的祖 先(Velasco et al.2010； Duan et al.2017)。 新疆野苹果属第三纪孑遗物种。

8、， 其果实形态、 着色、 风味、 株型高矮、 树形等变异很多。 因其自交不亲和特性和自然选择作用形成了许多 抗寒抗病虫、 耐贫瘠的特异单株， 丰富的变异使野苹果赢得了广泛的关注， 已经成为西北地 区及其他省份的主要砧木之一。 位于新疆伊犁谷地的以野苹果为主要建群种的天山野果林 是我国重要的自然林， 在调节气候、 涵养水源、 保持水土等方面有着重要的生态作用。 但由 于农田开发、 过度放牧、 人为砍伐、 苹果小吉丁虫、 腐烂病等原因， 使得近年来新疆野苹果群 落面积急剧减少， 新疆野苹果已被列为国家濒危二级保护植物， 有效保护这一宝贵种质迫 在眉睫。 0003 植物组织培养广义上又称为植物克隆，。

9、 是以植物细胞全能型为理论基础建立的一 种离体培养技术。 因其不受地理环境和季节的限制， 广泛应用于植物的快速繁殖、 品种改 良、 基因工程育种等方面。 苹果是一类重要的经济作物， 一直以来对其组织培养体系研究较 多， 建立了以子叶、 原生质体、 茎段等组织器官为外植体的组织培养体系(韩小姣等， 2008； 潘增光等， 2000； 王贵章等， 2006)， 并且建立了栽培苹果主要品种或重要砧木的组培体系 (Montecelli， 2010； Seong and Song， 2008； Szankowski， 2003； 王淑华等， 2016； 一种苹果砧 木M9的组培快速育苗方法， 专利号： 。

10、CN104737920B； )。 然而对栽培苹果的祖先种， 新疆野苹 果， 其组培体系研究较少。 李心悦(2018)、 刘兵(2011)、 谭冬梅(2009)等以茎段为外植体， 建 立了新疆野苹果的组培体系， 但转化效率较低； 而以健康叶片为外置体进行组培研究的仅 见吴瑞刚等(2017)以新疆野苹果31的叶片为外植体直接诱导了不定芽， 但该材料是筛选出 的 “高再生材料” (李白沙， 2014)， 叶片可经过诱导直接产生不定芽； 而新疆野苹果离体再生 频率高低很大程度上依赖于试材基因型， 大多数野苹果种质不能直接诱导产生不定芽， 因 此， 需要找寻一种更为普适的、 优化的基于叶片愈伤组织分化得。

11、到不定芽的方法。 本发明以 植物幼嫩叶片为外植体， 通过愈伤组织诱导及不定芽的再生、 芽增殖、 生根、 壮苗和移栽过 程， 首次建立了完整基于愈伤组织分化的新疆野苹果的再生体系， 最短成苗时间为2.5个 月。 0004 新疆野苹果高效再生体系的建立是研究其遗传转化体系的基础， 是进行基因功能 验证、 分子育种的重要技术平台。 本发明建立了一整套完善的基于健康叶片愈伤组织分化 的新疆野苹果再生体系， 且再生率较高， 成苗效率高， 为后续新疆野苹果遗传转化体系的建 立奠定坚实基础。 本发明对新疆野苹果的保育及基因资源开发利用具有重要意义。 说 明 书 1/6 页 3 CN 109169287 A 。

12、3 发明内容 0005 本发明目的在于， 提供了一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方 法， 该方法是由愈伤组织及不定芽的诱导， 不定芽增殖， 生根培养以及炼苗和移栽步骤完 成， 通过本发明提供的方法， 愈伤组织诱导率为100， 不定芽的最高诱导率为30， 生根和 幼苗成活率分别可达85和90。 本发明所述方法为新疆野苹果的种质保存和遗传转化研 究提供基础。 本发明所述方法适用于多种环境， 尤其是新疆， 甘肃等空气湿度低的地方， 大 大提高了组培植物的存活率， 省时省力。 0006 本发明所述的一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 该方法 以叶片为外植体， 愈伤组织诱。

13、导及不定芽的诱导， 不定芽的增殖， 生根培养以及炼苗和移 栽， 具体操作按下列步骤进行： 0007 愈伤组织及不定芽的诱导： 0008 a、 取实验室继代生长的新疆野苹果无菌苗40d叶龄大小的幼嫩完全展开叶片为外 植体， 去掉叶柄部分， 用解剖刀垂直于叶片中央叶脉横切， 将叶片等分为两部分， 以叶片远 轴端为接触面， 接种到诱导培养基中继代2次， 每25天一次， 黑暗培养三周后， 2000lx光照培 养， 光照时间16小时， 培养温度为242， 培养7天后， 肉眼可在切口处见黄色愈伤组织， 20 天左右在叶片切口处的愈伤组织看到有不定芽的分化， 其中诱导培养基为以MS为基础培养 基， 附加30。

14、g/L蔗糖， 琼脂6g/L， 激素为NAA 0.0-2.0mg/L， TDZ 1.0-5.0mg/L或6-BA 1.0- 5.0mg/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 0009 不定芽的增殖： 0010 b、 将步骤a诱导出的不定芽切下， 插到不定芽增殖培养基中， 培养条件为黑暗培养 三周后， 2000lx光照培养， 光照时间16小时， 培养温度为242， 培养15天后长成1-4cm丛 生芽或幼苗， 增值倍数达3-5倍， 其中不定芽增殖培养基为以MS为基础培养基， 附加30g/L蔗 糖， 琼脂6g/L， 激素为6-BA 0.4mg/L， NAA 0.0-0.1mg。

15、/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌 115， 30分钟； 0011 生根培养： 0012 c、 将步骤b得到的3cm幼苗， 沿茎基部切下， 接种到生根培养基上， 约10天可在茎基 部看到粉红色的根尖， 25天可长出3-5条根， 其中生根培养基为以1/2MS为基础培养基， 蔗糖 15-30g/L， NAA 0.0-1.0mg/L， 琼脂6g/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 0013 炼苗和移栽： 0014 d、 取株高5cm， 有3-5条根的健壮幼苗移栽到已经湿润的基质中， 基质为营养土:蛭 石3:1， 将幼苗移栽进基质后， 在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保。

16、鲜膜， 期间每天向膜内喷水， 光照强度减半， 光照时间为16小时， 培养温度为242， 7天后揭开保鲜膜呈半开状态， 正 常光照下培养且仍需每天向膜内喷水， 直至移栽后第一片新叶完全展开， 即可完全撤去保 鲜膜， 此后恢复正常浇水。 0015 步骤a中诱导培养基中的激素为TDZ 4mg/L、 NAA 1.0mg/L。 0016 步骤b中不定芽增殖培养基激素浓度为6-BA 0.4mg/L。 0017 步骤c中生根培养基为1/2MS+15g蔗糖+0.1mg/L NAA。 0018 本发明所述的一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 该方法 有益效果为： 说 明 书 2/6 页 4 C。

17、N 109169287 A 4 0019 1.本发明基于愈伤组织分化对新疆野苹果再生体系建立的方法进行了系统的研 究。 在最佳诱导培养基上愈伤组织诱导率为100， 约20天时即有不定芽的产生， 不定芽诱 导效率为30。 诱导的不定芽在移植到不定芽增殖培养基15d后， 可实现3-5倍的增值倍数， 丛生芽或幼苗长至约1-4cm； 3cm以上株高的幼苗可作为生根的材料， 在生根培养基上培养 约1个月后， 生根率达85以上， 幼苗叶片颜色深绿， 油亮， 长势旺盛。 本发明所用移栽方法 适用于多种环境， 尤其是新疆， 甘肃等空气湿度低的地方， 大大提高了组培植物的存活率。 整个再生过程， 最快只需2.5。

18、个月。 0020 2.本发明对比了TDZ(N-苯基-N -1,2,3-噻二唑-5-脲)和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 两种细胞分裂素在新疆野苹果愈伤组织诱导和不定芽分化时影响。 相同质量浓度的TDZ(N- 苯基-N -1,2,3-噻二唑-5-脲)和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)对新疆野苹果愈伤组织的诱导并 没有显著性的差异， 但在愈伤组织分化不定芽上有显著的差异。 本发明所试浓度范围内的 6-BA都不能对愈伤组织有明显的诱导芽的作用， 1-5mg/L的TDZ在诱导不定芽产生上都有作 用。 0021 3.本发明所用的诱导培养基可先诱导愈伤组织， 同时诱导愈伤组织分化不定芽， 省时省力。 0022 。

19、4.叶片和愈伤组织是植物转基因常用的浸染材料， 本发明能高效的诱导愈伤组织 和不定芽的再生， 为新疆野苹果的基因的挖掘， 精准分子育种工作的实现提供了可能。 附图说明 0023 图1为本发明中不定芽分化生长状况图； 0024 图2为本发明中不定芽增殖生长状况图； 0025 图3为本发明中幼苗生根生长状况图； 0026 图4为本发明中幼苗移栽后生长状况图。 具体实施方式 0027 以下结合具体实施方法进一步说明本发明， 而非限制本发明。 0028 实施例1 0029 本发明所述的一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法， 该方法 以叶片为外植体， 愈伤组织诱导及不定芽的诱导， 不定芽的。

20、增殖， 生根培养以及炼苗和移 栽， 具体操作按下列步骤进行： 0030 愈伤组织及不定芽的诱导： 0031 a、 取实验室继代生长的新疆野苹果无菌苗40d叶龄大小的幼嫩完全展开叶片为外 植体， 去掉叶柄部分， 用解剖刀垂直于叶片中央叶脉横切， 将叶片等分为两部分， 以叶片远 轴端为接触面， 接种到诱导培养基中继代2次， 每25天一次， 黑暗培养三周后， 2000lx光照培 养， 光照时间16小时， 培养温度为242， 培养7天后， 肉眼可在切口处见黄色愈伤组织， 20 天左右在叶片切口处的愈伤组织看到有不定芽的分化(图1)， 其中诱导培养基以MS为基础 培养基， 附加30g/L蔗糖， 琼脂6g。

21、/L， 激素为NAA 0.0-2.0mg/L， TDZ 1.0-5.0mg/L或6-BA 1.0-5.0mg/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 随着培养时间的增长， 愈伤 组织的分化率会不断提高， 见表1给出了不同外源植物激素对外植体愈伤率和不定芽再生 说 明 书 3/6 页 5 CN 109169287 A 5 的影响： 0032 表1不同激素浓度对外植体愈伤和不定芽诱导的影响 0033 说 明 书 4/6 页 6 CN 109169287 A 6 0034 0035 表1包括50种不同激素浓度培养基下得到的愈伤率和不定芽诱导率的实验数据； 从愈伤率上来看， 培。

22、养基中同时添加生长素类和细胞分裂素类两种外源植物激素的， 其愈 伤组织形成率并没有差别； 在含有TDZ这种细胞分裂素的培养基中其不定芽的诱导要远远 高于含有6-BA这种细胞分裂素的培养基； 在添加有4.0mg/LTDZ,1.0mg/LNAA的培养基中， 外 植体培养20天能在愈伤组织上有不定芽的产生， 并实现最高不定芽诱导率30； 0036 不定芽的增殖： 0037 b、 因TDZ易使芽体矮小， 所以要更换细胞分裂素类型， 进行不定芽的增殖培养， 将 步骤a诱导出的不定芽切下， 插到不定芽增殖培养基中， 培养条件为黑暗培养三周后， 2000lx光照培养， 光照时间16小时， 培养温度为242，。

23、 培养15天后长成1-4cm丛生芽或幼 苗， 增值倍数达3-5倍(图2)， 其中不定芽增殖培养基以MS为基础培养基， 附加30g/L蔗糖， 琼 脂6g/L， 激素为6-BA 0.4mg/L， NAA 0.0-0.1mg/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 添加或不添加0.1mg/LNAA的2种培养基中都能得到长高的丛生芽或幼苗， 且增值倍 数没有显著性差异， 所以添加有0.4mg/L 6-BA的MS培养基是最适的不定芽增殖培养基； 0038 生根培养： 0039 c、 将步骤b得到的3cm幼苗， 沿茎基部横切下， 接种到生根培养基上， 约10天可在茎 基部看到粉红色。

24、的根尖， 25天可长出3-5条根(图3)， 其中生根培养基以1/2MS为基础培养 基， 蔗糖15-30g/L， NAA 0.0-1.0mg/L， 琼脂6g/L， 灭菌前调pH至6.0， 高温高压灭菌115， 30分钟； 1.0mg/L的NAA可诱导根的产生， 但同时会在茎基部产生大量的愈伤组织， 不利于移 栽， 其中生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基， 添加15g/L蔗糖和0.1mg/LNAA的培养基 可实现幼苗90的生根率， 且幼苗长势旺盛， 能够用于移栽； 0040 炼苗和移栽： 0041 d、 由于组培苗叶片质地薄， 喜湿润环境， 现有的开瓶炼苗方法对组培室或温室的 空气湿度要求很。

25、高， 在新疆地区并不适用， 所以本发明以保鲜膜覆盖法替代开瓶炼苗法； 取 株高5cm， 有3-5条根的健壮幼苗移栽到已经湿润的基质中， 基质为营养土:蛭石3:1， 将幼苗 移栽进基质后， 在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜， 期间每天向膜内喷水， 光照强度减 说 明 书 5/6 页 7 CN 109169287 A 7 半， 光照时间为16小时， 培养温度为242， 7天后揭开保鲜膜呈半开状态， 正常光照下培 养且仍需每天向膜内喷水， 直至移栽后第一片新叶完全展开， 即可完全撤去保鲜膜， 此后恢 复正常浇水； 此种方法可保证幼苗成活率达90以上(图4)。 说 明 书 6/6 页 8 CN 109169287 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 109169287 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 109169287 A 10 。