本申请是申请日为2007年3月26日、发明名称为“调节造血干 细胞生长的方法”的申请号为200780018870.X专利申请的分案申请。
政府支持
本发明得到国立卫生研究院(National Institutes of Health)-NIH拨 款号CA103846-02支持。美国政府具有关于其的某些权利。
与相关申请的交叉参照
本申请要求于2006年3月24日由Leonard I Zon和Trista E.North 提交的，名称为Method to Modulate Hematopoietic Stem Cell Growth的， 美国临时专利申请系列号60/785,968的利益，所述申请整体引入本文 作为参考。
发明领域
本实施方案提供了在体外、体内和先体外后体内增加或减少造血 干细胞群体的调节剂。
背景
干细胞研究拥有于开发疗法的非凡潜力，所述疗法可以改变患有 诸如白血病、糖尿病和贫血的疾病的那些人的未来。许多研究集中于 干细胞生物学作为关于疾病治疗的关键的探究。通过干细胞在正常发 育中的作用的了解，研究者寻求捕获且指导干细胞的先天能力以治疗 许多状况。研究在许多区域中同时进行：检查驱动胚胎干细胞在各种 组织中发育的遗传和分子触发物；学习如何推动那些细胞分裂且形成 特化组织；培养胚胎干细胞且开发起作用的新系；寻找通过消除供体 需要来消除或控制移植物抗宿主病的方法；和产生可普遍移植的细胞 系。
造血干细胞(HSCs)在胚胎发生期间在不同区域中衍生，其中特 异性诱导事件使中胚层转变成血液干细胞和祖先。仍需要阐明特定生 物分子、化学试剂和其他因子之间在这些诱导事件中的关联。例如， 仍需要鉴定何种生物分子或化学试剂有希望用于处理HSC群体用于所 需目的，例如增加HSC群体用于研究或治疗。
概述
本实施方案的组合物和方法提供了HSC调节剂，其是根据具体适 应症所需增加HSC数目或减少HSC数目的试剂。例如，发现增加HSC 数目的HSC调节剂包括前列腺素E2(PGE2)和刺激PGE2途径的试剂。 相反，阻止PGE2合成的HSC调节剂减少HSC数目。
一个实施方案提供了用于促进受试者中的造血干细胞生长的方 法，其包括施用至少一种造血干细胞(HSC)调节剂和药学上可接受 的载体。
在另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰前列腺素途径来增加 HSCs。通过修饰前列腺素途径来增强HSC群体的HSC调节剂可以是 选自下述的至少一种化合物：PGE2、dmPGE2、PGI2、亚油酸、13(s) -HODE、LY171883、Mead酸(Mead Acid)、二十碳三烯酸、环氧二 十碳三烯酸、ONO-259、Cay1039、PGE2受体激动剂、以及这些试剂 中的任何一种的衍生物。在更具体的实施方案中，HSC调节剂是选自 下述的PGE2衍生物：16，16-二甲基PGE2、19(R)-羟基PGE2、16，16- 二甲基PGE2p-(p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯酯、11-脱氧-16，16-二甲基 PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16，16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、 丁环前列素、硫前列酮、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去 甲(tetranor)PGE2、15(S)-15-甲基PGE2和15(R)-15-甲基PGE2。
在另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰Wnt途径来增加 HSCs。通过修饰Wnt途径来增强HSC群体的HSC调节剂可以是选自 下述的至少一种化合物：PGE2、dmPGE2、BIO、LiCl、以及这些化合 物的衍生物。
在另外一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰cAMP/P13K/AKT 第二信使来增加HSCs。通过修饰cAMP/P13K/AKT第二信使来增强 HSC群体的HSC调节剂可以是选自下述的至少一种化合物：8-溴 -cAMP、毛喉素、以及这些试剂的衍生物。
在另外一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰Ca2+第二信使来增 加HSC群体。通过修饰Ca2+第二信使来增强HSC群体的HSC调节剂 可以是选自下述的至少一种试剂：Bapta-AM、芬地林、尼卡地平、以 及这些化合物的衍生物。
在另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰NO/血管紧张素信号 传导来增加HSCs。通过修饰NO/血管紧张素信号传导来增强HSC群 体的HSC调节剂可以是选自下述的至少一种化合物：L-Arg、硝普钠、 钒酸钠、缓激肽、及其衍生物。
在另外一个实施方案中，增强HSC群体的HSC调节剂可以是选自 下述的至少一种试剂：美贝维林、丙酮缩氟氢羟龙、阿替洛尔、吲哚 洛尔、加波沙朵(Gaboxadol)、犬尿烯酸、肼屈嗪、噻苯达唑、比枯 枯灵碱(Bicuclline)、Vesamicol、黄夹次苷、丙咪嗪、氯磺丙脲、1，5- 亚戊基四唑、4-氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、 N-甲酰基-Met-Leu-Phe、加拉碘铵、IAA 94、氯烯雌醚、以及这些化合 物的衍生物。
另一个实施方案提供了通过使新生干细胞群体与选自下述的至少 一种化合物接触来促进HSC生长的方法：PGE2、PGI2、亚油酸、13 (s)-HODE、LY171883、Mead酸、二十碳三烯酸、环氧二十碳三烯 酸、ONO-259、Cay1039、PGE2受体激动剂、16，16-二甲基PGE2、19 (R)-羟基PGE2、16，16-二甲基PGE2p-(p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯 酯、11-脱氧-16，16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16，16-二甲基PGE2、 9-脱氧-9-亚甲基PGE2、丁环前列素、硫前列酮、PGE2丝氨醇酰胺、 PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R) -15-甲基PGE2、BIO、8-溴-cAMP、毛喉素、Bapta-AM、芬地林、尼 卡地平、硝苯地平、匹莫齐特、毒毛旋花子苷原、毛花苷、L-Arg、硝 普钠、钒酸钠、缓激肽、美贝维林、丙酮缩氟氢羟龙、阿替洛尔、吲 哚洛尔、加波沙朵、犬尿烯酸、肼屈嗪、噻苯达唑、比枯枯灵碱、 Vesamicol、黄夹次苷、丙咪嗪、氯磺丙脲、1，5-亚戊基四唑、4-氨基吡 啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、 加拉碘铵、IAA 94、氯烯雌醚、及其衍生物。新生干细胞群体可以从 外周血、脐带血、绒毛膜绒毛、羊膜液、胎盘血或骨髓中收集。
本发明的另一个实施方案提供了用于促进HSC先体外后体内扩增 的方法，其包括在至少一种HSC调节剂的存在下温育HSC。本发明的 另一个实施方案提供了用于促进HSC先体外后体内扩增的方法，其包 括收集HSC来源样品(例如，外周血、脐带血、羊膜液、胎盘血、骨 髓、绒毛膜绒毛)且在至少一种HSC调节剂例如PGE2的存在下贮藏 其。具体实施方案提供了包含适合于HSC来源样品贮藏的容器的试剂 盒，其中所述容器预装入增加HSCs的至少一种HSC调节剂。另外的 实施方案提供了试剂盒，其包含适合于HSC来源样品贮藏的容器和包 含合适量的增加HSCs的至少一种HSC调节剂的小瓶。本发明的进一 步实施方案提供了用于促进HSC先体外后体内扩增的方法，其中使新 生HSC来源在最初收集时、在加工期间、在贮藏时、在解冻后、或在 输液期间与PGE2或其衍生物接触。
在本发明的另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰前列腺素途 径来抑制HSCs。通过修饰前列腺素途径来抑制HSC群体的HSC调节 剂可以是选自下述的至少一种化合物：吲哚美辛、芬布芬、NS398、 SC560、舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞来昔布、 PGJ2、马兜铃酸、AH6809、AH23848、以及这些的衍生物。
在另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰Wnt途径来抑制 HSCs。通过修饰Wnt途径来抑制HSC群体的HSC调节剂可以是选自 下述的至少一种试剂：前列腺素抑制剂、Kenpaullone、丙戊酸、或其 衍生物。
在本发明的另外一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰 cAMP/P13K/AKT第二信使来抑制HSCs。通过修饰cAMP/P13K/AKT 第二信使来抑制HSC群体的HSC调节剂可以是选自下述的一种或多种 化合物：PD98059、KT5720、H89、U0126、渥曼青霉素、及其衍生物。
在另一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰Ca2+第二信使来抑制 HSCs。通过修饰Ca2+第二信使来抑制HSC群体的HSC调节剂可以是 选自下述的至少一种试剂：BayK 8644、硫利哒嗪、以及这些试剂的衍 生物。
在另外一个实施方案中，HSC调节剂通过修饰NO/血管紧张素信 号传导来抑制HSCs。通过修饰NO/血管紧张素信号传导来抑制HSC 群体的HSC调节剂可以是选自下述的至少一种化合物：L-NAME、依 那普利、卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙坦、Telimasartan、 组胺、氨溴索、白杨黄素、环己酰亚胺、亚甲蓝、肾上腺素、地塞米 松(Dexamethazone)、普罗地芬、异硫氰酸苄酯、麻黄碱、及其衍生 物。
在本发明的一个另外实施方案中，抑制HSC群体的HSC调节剂是 选自下述的至少一种化合物：Paragyline、普萘洛尔、依他硝唑、甲巯 咪唑、西诺沙星、青霉胺、呋塞米、Eburnamininone、阿柔比星、华法 林、γ-氨基丁酸、炔诺酮、鹰爪豆碱、二氢奎尼丁、乙肼苯哒嗪、甲氧 明、羟基脲、双氢麦角胺、安他唑林、3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非 那吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、酚苄明、美芬丁胺、四氢 烟酸、愈创兰油烃、咪唑、β-胡萝卜素、氯苯丁酯、以及这些化合物的 衍生物。
另一个实施方案提供了用于抑制受试者中的HSC生长的方法，其 包括施用至少一种HSC调节剂和药学上可接受的载体。在具体实施方 案中，HSC调节剂是选自下述的一种或多种化合物：吲哚美辛、塞来 昔布、芬布芬、前列腺素(Prosteglandin)J2、琥丁唑酮、舒林酸、及 其衍生物。
另一个实施方案提供了通过使新生干细胞群体与选自下述的至少 一种化合物接触用于减少HSC生长的方法：吲哚美辛、芬布芬、NS398、 SC560、舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞来昔布、 PGJ2、马兜铃酸、AH6809、AH23848、Kenpaullone、丙戊酸、PD98059、 KT5720、H89、U0126、渥曼青霉素、BayK 8644、硫利哒嗪(Thiridazine)、 L-NAME、依那普利、卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙 坦、Telimasartan、组胺、氨溴索、白杨黄素、环己酰亚胺、亚甲蓝、 肾上腺素、地塞米松、普罗地芬、异硫氰酸苄酯、麻黄碱、Paragyline、 普萘洛尔、依他硝唑、甲巯咪唑、西诺沙星、青霉胺、呋塞米、 Eburnamininone、阿柔比星、华法林、γ-氨基丁酸、炔诺酮、鹰爪豆碱、 二氢奎尼丁、乙肼苯哒嗪、甲氧明、羟基脲、双氢麦角胺、安他唑林、 3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非那吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、 酚苄明、美芬丁胺、四氢烟酸、愈创兰油烃、咪唑、β-胡萝卜素、氯苯 丁酯、PGE2受体拮抗剂、以及这些化合物的衍生物。
附图说明
图1表示关于使用斑马鱼胚胎影响AGM中的干细胞的化学药品的 筛选示意。
图2A和2B涉及前列腺素激动剂和拮抗剂，其改变runx1/cmyb表 达而不影响血管发育。图2A显示在原始(gata1和lmo2)和永久(lmo2 和cd41)血细胞生成期间分离的FACS分选细胞群体的微阵列表达概 况。显示了与GFP-细胞相比较，每个GFP+分选级分中的cox1(淡灰 色)和cox-2(深灰色)的相对表达。图2B显示与对照相比较(每个 三重峰中的第1条)，在暴露于长效dmPGE2(10μM，每个三重峰中 的第2条，深灰色)或非特异性cox抑制剂吲哚美辛(10μM，每个三 重峰中的第3条)后的内皮和HSC特异性基因表达的qPCR概况。2 种处理都导致与关于检查的每种基因的对照相比较统计学上显著的差 异(ANOVA，p＜0.05，n＝8)。
图3描述了指出前列腺素激动剂和拮抗剂改变runx1/cmyb表达的 数据，其通过经由共焦显微镜术检测到的双基因(bigenic)斑马鱼胚胎中 的HSC数目的定量分析：DMSO 23.3±5.0(平均值±SD)，dmPGE2 (10μM)38.0±2.2，吲哚美辛(10μM)(ANOVA，p＜0.00001，n＝10/ 处理)。
图4A和4B显示用dmPGE2处理增强亚致死照射的成年斑马鱼中 的造血恢复。执行斑马鱼全KM照射恢复实验。星号(*)指示统计学 上显著的差异：*＝50μM对对照，**＝50μM对10μM和50μM对对照， ***＝所有显著的变量(ANOVA，p＜0.05，n＝15/变量)。图4A显示了 在DMSO和dmPGE2处理的(50μM)斑马鱼中照射恢复的第0、4、7、 10和14天时在KM中的造血细胞谱系的代表性F SC/SSC FACS概况。 图4B显示在对照鱼(三角形)和dmPGE2处理的鱼(正方形，10μM； 圆圈，50μM)中前体细胞、淋巴样细胞和髓样细胞的KM重构的动力 学。
图5A和5B描述了改变亚致死照射的成年斑马鱼中的HSC相关基 因表达和恢复的PG途径的调节。图5A显示如通过对于照射后第3天 分离的全KM的qPCR测量的，dmPGE2处理对干细胞和内皮标记的作 用。星号(*)指出统计学上显著的差异(双尾t检验，n＝15，runx1： p＝0.0001；lmo2：p＝0.014；fli1：p＝0.049)。图5B描述了cox1(SC560， 10μM)和cox2(NS398，10μM)抑制对于照射恢复(n＝5/处理)的作 用。对于用SC560或NS398处理的鱼，由于在这些处理组中的过量死 亡，在第14天时无法获得分析。
图6A和6B显示dmPGE2调节小鼠ES细胞中的集落数目和造血 分化。进行M3434和OP9ES细胞集落形成测定；计数是铺平板的每 100,000个细胞。条指出对照处理的ES细胞和用渐增剂量的dmPGE2 (10μM、20μM、100μM)的处理或吲哚美辛处理的(10μM、100μM) ES细胞。星号(*)指出统计学上显著的差异(双尾t检验，n＝5/变量)。 图6A，显示了渐增剂量的dmPGE2和经由吲哚美辛抑制环加氧酶活性 对甲基纤维素中的造血分化的作用；终末类红细胞(E)、混合粒细胞 /单核细胞(GM)和多能(GEMM)祖先集落的数目(10μM dmPGE2： GM p＝0.005，GEMM p＝0.017；20μM dmPGE2：dE p＝0.04，GM p＝0.007， GEMM 0.016；100μM吲哚美辛：GM p＝0.024)。图6B，dmPGE2和 吲哚美辛对OP9造血集落数目的作用(20μM：p＝0.047)。
图7A和7B描述了PGE2对集落数目的影响。更具体而言，图7A 和7B举例说明了在(A)甲基纤维素和(B)OP9测定中集落形成的 吲哚美辛(100μM)抑制的dmPGE2介导的(10μM)援救。
图8A-图8F指出鼠BM暴露于dmPGE2增加CFU-S和再增殖HSCs 的数目。星号(*)指出统计学上显著的差异。图8A和8B，WBM(在 冰上2小时)用EtOH对照或dmPGE2(1μM/106个细胞)的先体外后 体内处理对CFU-S8和CFU-S12(60,000个细胞/受体；CFU-S12：双 尾t检验，n＝10，p＜0.0001)的作用。图8C，在用吲哚美辛(1μM/106 个细胞)先体外后体内处理后对CFU-S12的作用(100,000个细胞/受 体，双尾t检验，n＝10，p＝0.0002)。图8D，ckit+sca1+谱系-干细胞 在用dmPGE2或EtOH对照处理后的CFU-S 12评估(双尾t检验，100 个细胞：n＝10，p＝0.013；300个细胞：p＝0.0003)。图8E和8F，有限 稀释竞争再增殖测定。显示了在12周时如通过FACS分析(e)测定 的，与对照(正方形)或dmPGE2处理的(圆圈)细胞样品移植的细 胞总数目相关的阴性受体数目。在移植后6、12和24周时通过Poisson 统计学计算的，在EtOH对dmPGE2处理的WBM的受体中的移入频 率(小图F)(ANOVA，n＝10/变量，6周：p＝0.005；12周：p＝0.002； 24周：p＝0.05)；在每个时间点上对分析存活的受体数目显示于表6- 表8中。
图9A-9N描述了显示鼠BM暴露于dmPGE2增加脾重量和1次 HSC移入的数据。图9A和9B，在第(a)8和(b)12天时用EtOH 对照或dmPGE2先体外后体内处理WBM和分离的HSCs对脾重量的 作用(双尾t检验，CFU-S8：n＝5，p＝0.339；CFU-S12：n＝9，p＜0.00001)。 图9C，与对照比较，在吲哚美辛处理(绿色)后的脾重量(双尾t检 验：n＝10，p＝0.00026)。图9D，在KSL细胞的dmPGE2处理后的脾 集落数目(双尾t检验，100个细胞：n＝4，p＝0.0013；300个细胞：n＝5， p＝0.009)。图9E，举例说明在对照和dmPGE2暴露的BM细胞的受体 中的CD45.1移入水平(左上象限)的代表性FACS图。图9F-9J，在 dmPGE2处理的WBM(圆圈)对对照(正方形)的受体中的平均嵌合 状态(F、H、I)和计算的移入频率(图9G和9J)。图9K和9L，在 CFU-S12测定中用cox1(SC560，10μM)和cox2(NS398，10μM)抑 制剂先体外后体内处理WBM对集落数目(配对t检验，n＝10，SC560 p＝0.00016，NS398p＜0.00001和脾重量(配对t检验，n＝10，SC560 p＝0.025，NS398p＝0.00075)的作用。图9M和9N，在5-FU骨髓损伤 后的外周血(处理后第14天)和骨髓(处理后第16天)WBC计数； 体内暴露于SC560或NS398显著抑制WBC恢复，而dmPGE2增强 WBC计数。
图10呈现了Wnt信号传导途径的图解。
图11A和11B描述了wnt活性的调节影响成体稳态的数据。图11A 显示了照射测定的示意图；图11B呈现了在wt，hs：wnt8，hs：dkk 和hs：dnTCF成体中在照射后第10天时整个肾髓的FACS分析。
图12显示了在体内Top：dGFP测定中在由前列腺素信号传导引 起的发育胚胎中的wnt活性中的改变的qPCR定量。
图13呈现了描述PG和wnt途径的相互作用的潜在点的模型。(1) PGE2不能援救dkk、axin、dnTCF；吲哚美辛不能阻断wnt8。(2)PGE2 援救dkk，但不援救axin和dnTCF；吲哚美辛可以阻断wnt8；PGE2 援救dkk和axin，但不援救dnTCF；吲哚美辛可以阻断wnt8。(4)PGE2 援救dkk、axin和dnTCF；吲哚美辛可以阻断wnt8。
图14显示了在照射以及用dmPGE2或吲哚美辛处理后第3天时， 在Top：dGFP成体的肾髓中的GFP阳性细胞百分比。
详述
除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学和技术术语应具有 由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求， 单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
应当理解本发明不限于本文描述的具体方法、规程和试剂等，并 且同样可以改变。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的， 并且不意欲限制完全由权利要求限定的本发明的范围。
除了在操作实施例中或另有说明时，表示本文使用的成分或反应 条件的量的所有数目应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。术语“约” 当与百分比结合使用时可以意指±1％。
鉴定的所有专利和其他出版物为了描述和公开例如此种出版物中 描述的方法的目的特别引入本文作为参考，所述方法可以与本发明结 合使用。这些出版物仅在本申请的提交日期前提供其公开内容。在这 点上任何事情不应解释为承认本发明人由于在先发明或由于任何其他 原因无权在时间上先于此种公开内容。关于日期的所有声明或关于这 些文件内容的陈述基于对于申请人可用的信息，并且不构成关于这些 文件的日期或内容的正确性的任何承认。
造血干细胞(HSC)稳态受生长因子、信号传导分子和转录因子 的紧密控制。在主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区中在胚胎发生期间衍 生的终末HSCs随后定居在胎儿和成体造血器官中的小生境。Dzierzak， 12Curr.Opin.Hematol.197-202(2004)；Galloway & Zon，53Curr.Top. Devel.Biol.139-58(2003)。
本发明提供了用于在体外、体内或先体外后体内调节HSC生长和 更新的方法。该方法包括使新生干细胞群体与至少一种HSC调节剂接 触。这种群体可以包含在外周血、脐带血、骨髓、羊膜液、绒毛膜绒 毛、胎盘或其他造血干细胞小生境内。在一个实施方案中，本发明提 供了用于促进细胞群体中的造血干细胞生长和更新的方法。在另一个 实施方案中，本发明提供了用于抑制细胞群体中的造血干细胞生长和 更新的方法。
本发明部分基于PGE2和增强PGE2合成的试剂引起HSC数目中 的增加的发现。相反，阻断PGE2合成的试剂减少HSCs。在这点上， 影响PGE2合成的试剂可以视为HSC调节剂。例如，负责PGE2合成 的环加氧酶(cox)可能是HSC形成所需的。此外，血管舒张剂促进 HSC扩增，相反，血管收缩剂减少HSC数目。例如，肼屈嗪——抗高 血压血管舒张剂增加HSCs，而芬布芬——非类固醇类抗炎药血管收缩 剂减少HSCs。这些试剂因此也视为HSC调节剂。
如本文所使用的，HSC调节剂可以促进或抑制HSC生长和更新。 HSC调节剂影响细胞群体中的HSC数目。HSC调节剂影响培养中(在 体外)、在短期温育期间(先体外后体内)或在体内的HSC扩增。参 见下表1。增加HSC数目的HSC调节剂包括上调PGE2合成的试剂。 HSC数目中的增加可以是比治疗前由受试者显示出的HSC数目多约10 ％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80 ％、约90％、约100％、约150％、约200％或更多的增加。
引起HSC数目中的减少的HSC调节剂下调PGE2合成和/或促进 血管收缩。参见例如下表2。HSC数目中的减少可以是比治疗前由受 试者显示出的HSC数目少约10％、约20％、约30％、约40％、约50 ％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200 ％或更多的减少。HSC数目可以通过疾病症状的减轻进行评估，例如 增加的血小板计数、增加的血细胞比容，其中血小板计数或血细胞比 容增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70 ％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％或更多。对HSC 数目的作用可以通过疾病症状的减轻进行评估，例如增加的血小板计 数、增加的血细胞比容，其中血小板计数或血细胞比容增加约10％、 约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约 90％、约100％、约150％、约200％或更多。
在一个实施方案中，PGE2或dmPGE2用作HSC调节剂以增加HSC 群体。
本发明的HSC调节剂还包括HSC调节剂的衍生物。如本文所使用 的，衍生物包括化学修饰的化合物，其中所述修饰由熟练的化学家视 为常规的，例如另外的化学部分(例如，酸的酯或酰胺，保护基团， 例如用于醇或硫醇的苯基、和用于胺的叔丁氧基羰基)。衍生物还包 括放射性标记的HSC调节剂，HSC调节剂的缀合物(例如，生物素或 抗生物素蛋白、使用酶例如辣根过氧化物酶等、使用生物发光剂、化 学发光剂或荧光剂)。此外，可以给HSC调节剂或其部分添加部分以 增加体内半衰期。如本文所使用的，衍生物还包含类似物，例如包含 化学修饰形式的特定化合物或其类别的化合物，和维持所述化合物或 类别的药学和/或药理学活性特征的化合物，也包含在本发明中。如本 文所使用的，衍生物还包含HSC调节剂的前体药物，这已知增强药物 的所需性质(例如，可溶性、生物利用率、制备等)。
HSC调节剂的直接先体外后体内施用可以使造血干细胞能够显著 体内扩增，从而使得甚至更小量的造血干细胞随后在移植中可以是足 够的。因此，例如，脐带血干细胞移植现在不仅可以应用于儿童还可 以应用于成年人。此种干细胞可以从包括例如外周血、脐带血、骨髓、 羊膜液或胎盘血的来源进行收集。可替代地，包含HSC的来源样品可 以进行收获，然后立即在HSC调节剂例如PGE2的存在下进行贮藏， 并且在引入受试者内之前在HSC调节剂的存在下进行最初温育(在分 化前)。
此外，一种或多种HSC调节剂可以在体内用于增加骨髓或其他来 源(例如脐带血)中的干细胞数目。通过增加干细胞的数目，来自受 试者的干细胞总收获可以得到显著改善。进一步地，通过增加由受试 者收获的干细胞数目，可用于移植回该受试者内或另一个受试者内的 干细胞数目也可以得到显著改善，从而有效减少移入的时间，且随后 导致受试者在其间具有不足的嗜中性粒细胞和血小板的时间中的减 少，从而防止感染、出血或其他并发症。
此外，本发明可以减少其否则不能转移足够细胞用于干细胞收获 以继续进行关于其最初疾病的治疗的受试者比例，所述治疗例如化学 治疗和其他骨髓切除治疗。因此，还可以减少具有延迟的最初移入的 受试者数目的比例。此外，本发明还可以通过增加HSC数目促进骨髓 切除治疗后的恢复。
HSC调节剂例如表1和本文公开的那些可以在体内用于增加HSC 生产和先体外后体内增加HSC数目。这通过将一种或多种化合物施用 于受试者或干细胞来完成。
HSC调节剂还可以用于给受试者提供自体的HSCs。一般地，这涉 及下述步骤：给有此需要的受试者施用HSC调节剂，以增强骨髓内的 干细胞群体扩增和/或转移外周循环中的干细胞；收获一种或多种骨髓 干细胞或外周循环中的一种或多种干细胞；且将一种或多种收获的干 细胞移植回受试者内。
此外，得自根据上文描述的本发明方法收获的干细胞可以使用本 领域已知用于干细胞深低温保藏的技术进行深低温保藏。因此，使用 深低温保藏，干细胞可以这样维持，从而使得一旦确定受试者需要干 细胞移植，那么干细胞可以进行解冻且移植回受试者内。如前所述， 在深低温保藏技术期间一种或多种HSC调节剂例如PGE2的使用可以 增强HSC群体。
更具体而言，本发明的另一个实施方案提供了从脐带血或等价新 生儿或胎儿干细胞来源收集的HSCs的增强，这可以进行深低温保藏用 于此种干细胞在解冻后的治疗用途。此种血液可以通过本领域已知的 几种方法进行收集。例如，因为脐带血是HSCs的丰富来源(参见 Nakahata & Ogawa，70 J.Clin.Invest.1324-28(1982)；Prindull等人， 67Acta.Paediatr.Scand.413-16(1978)；Tchernia等人，97(3)J.Lab. Clin.Med.322-31(1981))，所以关于新生儿血液的极佳来源是脐带 和胎盘。新生儿血液可以通过从脐带中直接引流和/或通过在根和扩张 静脉处从分娩胎盘中针抽吸来获得。参见例如，美国专利号7,160,714； 5,114,672；5,004,681；美国专利申请系列号10/076180，公开号 20030032179。
实际上，脐带血干细胞已用于重构在用骨髓切除(myeloablative)剂 量的化学-放射疗法治疗后具有恶性和非恶性疾病的儿童中的血细胞生 成。Sirchia & Rebulla，84 Haematologica 738-47(1999)。还参见 Laughlin 27 Bone Marrow Transplant.1-6(2001)；美国专利号6,852,534。 此外，已报道脐带血中的干细胞和祖细胞看起来在培养中比在成体骨 髓中的那些具有更大的增殖能力。Salahuddin等人，58Blood 931-38 (1981)；Cappellini等人，57Brit.J.Haematol.61-70(1984)。
可替代地，胎儿血可以借助于通过超声(Daffos等人，153Am.J. Obstet.Gynecol.655-60(1985)；Daffos等人，146Am.J.Obstet.Gynecol. 985-87(1983)，通过胎盘穿刺(Valenti，115Am.J.Obstet.Gynecol. 851-53(1973)；Cao等人，19J.Med.Genet.81-87(1982))，通过 胎儿镜检查(Rodeck，in PRENATAL DIAGNOSIS，(Rodeck & Nicolaides， 编辑，Royal College of Obstetricians & Gynaecologists，London，1984)) 指导的针在胎盘根部处从胎儿循环获得。事实上，除了脐带血和胎盘 外，绒毛膜绒毛和羊膜液也是多潜能胎儿干细胞的来源(参见 WO 2003042405)，其可以通过本发明的HSC调节剂进行处理。
用于收集、加工和贮藏脐带血的各种试剂盒和收集设备是已知的。 参见，例如，美国专利号7,147,626；7,131,958。收集应在无菌条件下 进行，且血液可以用抗凝剂进行处理。此种抗凝剂包括柠檬酸盐-磷酸 盐-葡萄糖、酸性柠檬酸盐-葡萄糖、Alsever氏溶液(Alsever & Ainslie， 41N.Y.St.J.Med.126-35(1941)、DeGowin氏溶液(DeGowin等人， 114J.A.M.A.850-55(1940))、Edglugate-Mg(Smith等人，38J.Thorac. Cardiovasc.Surg.573-85(1959))、Rous-Turner溶液(Rous & Turner 23J.Exp.Med.219-37(1916))、其他葡萄糖混合物、肝素或双香豆 乙酯(ethyl biscoumacetate)。参见Hurn Storage of Blood 26-160(Acad. Press，NY，1968)。
各种程序是本领域已知的且可以用于就HSCs富集收集的脐带血。 这些包括但不限于单独或组合的平衡密度离心、在单位重力的速度沉 降、免疫玫瑰花结(rosetting)和免疫粘连、对流离心淘洗、T淋巴细 胞除尽、和荧光激活细胞分选术。参见例如，美国专利号5,004,681。
一般地，收集的血液通过添加低温防护剂制备用于深低温贮藏， 例如DMSO(Lovelock & Bishop，183Nature 1394-95(1959)； Ashwood-Smith 190 Nature 1204-05(1961))，甘油，聚乙烯吡咯烷 酮(Rinfret 85Ann.N.Y.Acad.Sci.576-94(1960))，聚乙二醇(Sloviter & Ravdin 196 Nature 899-900(1962))，清蛋白，葡聚糖，蔗糖，乙 二醇，i-赤藓糖醇，D-核糖醇，D-甘露糖醇(Rowe，3(1)Cryobiology 12-18(1966))，D-山梨糖醇，i-肌醇，D-乳糖，氯化胆碱(Bender 等人，15J.Appl.Physiol.520-24(1960))，氨基酸(Phan & Bender， 20Exp.Cell Res.651-54(1960))，甲醇，乙酰胺，甘油单乙酸酯 (Lovelock，56Biochem.J.265-70(1954))，和无机盐(Phan & Bender， 104Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1960))。血浆的添加(例如，至20-25 ％的浓度)可以增加DMSO的保护效应。
收集的血液应以受控速率冷却用于深低温贮藏。不同的低温防护 剂和不同的细胞类型具有不同的最优冷却率。参见，例如Rapatz，5(1) Cryobiology 18-25(1968)，Rowe & Rinfret，20Blood 636-37(1962)； Rowe，3(1)Cryobiology 12-18(1966)；Lewis等人，7(1)Transfusion 17-32(1967)；Mazur 168Science 939-49(1970)。用于HSC来源的 操作、深低温保藏和长期贮藏的考虑和程序是本领域已知的。参见， 例如，美国专利号4,199,022；3,753,357；4,559,298；5,004,681。还存 在具有用于血液贮藏的相关规程的各种设备。美国专利 号6,226,997；7,179,643。
HSC来源的解冻和重构中的考虑也是本领域已知的。美国专利号 7,179,643；5,004,681。HSC来源血液还可以进行处理以防止凝集(参 见Spitzer，45Cancer 3075-85(1980)；Stiff等人，20Cryobiology 17-24 (1983)，且去除毒性低温防护剂(美国专利号5,004,681)。此外， 存在测定HSC移植单位的移入细胞剂量的各种方法。参见美国专利号 6,852,534；Kuchler Biochem.METHODS IN CELL CULTURE & VIROLOGY 18-19(Dowden，Hutchinson & Ross，Strodsburg，PA，1964)；10Methods in Medical Research 39-47(Eisen，等人，编辑，Year Book Med.Pub.， Inc.，Chicago，IL，1964)。
因此，不限于任何具体收集、处理或贮藏规程，本发明的实施方 案提供了给新生儿血液添加HSC调节剂，例如PGE2或dmPGE2。这 可以在收集时，或在准备用于贮藏时、或在解冻后和在输注前完成。
例如，从受试者中分离的干细胞，例如用或不用HSC调节剂先前 处理受试者，可以在HSC调节剂例如HSC调节剂例如PGE2或在表1 中列出的那些的存在下进行温育，以扩增HSCs的数目。扩增的HSCs 随后可以重新引入它们从中获得的受试者内或可以引入另一个受试者 内。
HSC调节剂包括表1中列出和本文公开的PGE2和化合物因而可 以特别用于：减少受试者中的干细胞再输注后移入的时间；减少延迟 的原始移入的发生率；减少血小板生产的继发性衰竭的发生率；和减 少受试者中的干细胞再输注后血小板和/或嗜中性粒细胞恢复的时间。 这些方法一般包括下述步骤：给有此需要的受试者施用HSC调节剂， 以增强骨髓内的干细胞群体的扩增和/或转移外周循环中的干细胞，和 随后收获一种或多种骨髓干细胞或外周循环中的干细胞，并且随后如 通过受试者的具体需要确定的，在合适的时间将收获的干细胞移植回 受试者内。
HSC调节剂，例如引起HSC数目增加的HSC调节剂可以提供方 便的单剂疗法，以改善干细胞移植的效率，允许实体瘤、骨髓瘤和淋 巴瘤的更攻击性治疗，和增加用于干细胞移植的候选者的数目。
本发明的方法还可以用于增加来自供体受试者的干细胞数目(包 括骨髓细胞或脐带血细胞)，其细胞随后用于援救已接受骨髓切除性 化学治疗或辐射治疗的受体受试者。
如本文所使用的，受试者包括在用于恶性疾病的治疗过程中或作 为基因治疗的组分其为用于自体干细胞或骨髓移植的候选者的任何 人。其他可能的候选者是其捐赠干细胞或骨髓给受试者用于同种异体 移植用于恶性疾病或基因治疗的受试者。受试者可以已经历辐射疗法， 例如作为用于除造血外的细胞类型的恶性肿瘤的治疗。受试者可能患 有贫血，例如镰状细胞贫血、地中海贫血(thalessemia)、再生障碍性 贫血、或HSC衍生物的其他缺乏。
本发明的方法因此提供了下述利益：(1)允许移植在其否则将由 于无法接受的失败的移入的高风险不视为候选者的患者中进行；(2) 减少产生最低限度可接受的收获所需的单采血液成分术次数；(3)通 过增加可用于移植的HSCs数目来减少移入的原发性或继发性衰竭的 发生率；和(4)通过增加重要的造血谱系的定型祖先的数目来减少原 始移入所需的时间。
本发明的HSC调节剂可以具有改善单采血液成分术产量和改善单 采血液成分术的细胞的移入潜能的干细胞移植中的临床利益。
本发明的HSC调节剂，例如引起HSC数目减少的HSC调节剂， 还可以在治疗患有造血系统的过度增生病症的受试者中有用。过度增 生病症可以包括但不限于，真性红细胞增多、特发性血小板增多、伴 髓样化生的骨髓纤维化、和慢性髓细胞性白血病。
本发明的化合物或试剂可以包含在药学上可接受的制剂中。此种 药学上可接受的制剂可以包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。如本 文所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶 剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。 例如，载体可以适合于注射到脑脊液内。赋形剂包括药学上可接受的 稳定剂。本发明涉及任何药学上可接受的制剂，包括以大分子复合物、 纳米胶囊(nanocapsule)、小球体或珠形式的合成或天然聚合物，和基于 脂质的制剂，包括水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒、合成人工膜小 泡和重新包封的红细胞。
当试剂或化合物递送给患者时，它们可以通过任何合适的途径施 用，包括例如经口(例如，在胶囊、悬浮液或片剂中)或通过肠胃外 施用。肠胃外施用可以包括例如肌内、静脉内、关节内、动脉内、鞘 内、皮下或腹膜内施用。试剂还可以经口、经皮、局部或通过吸入(例 如，支气管内、鼻内、经口吸入或鼻内滴剂)或直肠施用。如指示的 施用可以是局部或全身的。试剂还可以使用本领域技术人员众所周知 的病毒载体进行递送。
本发明预期局部和全身施用。局部施用的所需特征包括达到有效 化合物的有效局部浓度，以及避免来自活性化合物的全身施用的不利 副作用。在优选实施方案中，拮抗剂局部施用。局部化的递送技术在 例如51J.Biomed.Mat.Res.96-106(2000)；100(2)J.Control Release 211-19(2004)；103(3)J.Control Release 541-63(2005)； 15(3)Vet.Clin.North Am.Equine Pract.603-22(1999)；1(1)Semin. Interv.Cardiol.17-23(1996)中得到描述。
药学上可接受的制剂可以悬浮于水性载体中并且通过常规皮下针 或使用输注泵引入。
施用于个体的试剂的量将依赖于个体的特征，例如一般健康、年 龄、性别、体重和对药物的耐受以及排斥的程度、严重性和类型。依 赖于这些和其他因子，技术人员将能够决定合适的剂量。
在本发明的范围内的HSC调节剂可以在各种方法中进行鉴定，例 如斑马鱼遗传系统。斑马鱼是用于研究脊椎动物发育和疾病的极佳的 遗传系统。参见例如，Hsia & Zon，33(9)Exp.Hematol.1007-14(2005)； de Jong & Zon；39Ann.Rev.Genet.481-501(2005)；Paffett-Lugassy & Zon，105Meth.Mol.Med.171-98(2005)；Haffner & Nusslein-Volhard， 40Int’l J.Devel.Biol.221-27(1996)。外部发育的胚胎是透明的且器 官可以容易地显现。斑马鱼和哺乳动物共享许多在发育中相同的基因 程序。当斑马鱼交配时，它们产生大量(每周100-200个)透明胚胎。 许多胚胎可以置于相对小的空间，并且存在短世代时间(约3个月)。 大规模筛选已产生具有特定缺陷的超过2000个遗传突变型，所述特定 缺陷影响胚胎发生的基本上每个方面。Driever等人，123Devel.37-46 (1996)；Eisen，87Cell 969-77(1996)。许多血液突变型已在描述 血细胞生成中的关键事件中有用。Dooley & Zon，10Curr.Op.Genet. Devel.252-56(2000)。斑马鱼已用于执行基于完整生物的小分子筛选， 因为大量胚胎可以排列到包含来自化学文库的化合物的微量滴定板 内。例如，Peterson和同事测试了关于发育缺陷的1,100种化合物。 Peterson等人，97P.N.A.S.USA 12965-69(2000)。根据这个筛选， 约2％的化合物是致死的，且1％引起特定表型。例如，1种化合物抑 制称为耳石的内耳结构的形成，但不引起其他缺陷。
还可能筛选突变表型的化学抑制剂。Peterson等人，22Nat. Biotech.595-99(2004)；Stern等人，1Nat.Chem.Biol.366-70(2005)。 在一个此种筛选中，发现化学药品援救gridlock突变型——主动脉先天 性缩窄模型。Peterson等人，2004。这种援救的机制涉及校正血管发生 缺陷的VEGF的诱导。这些数据证实高度有效和特异的化合物可以使 用斑马鱼进行鉴定。
进一步就斑马鱼而言，已构建高密度遗传学图，其包括微卫星标 记、基因和表达序列标签(ESTs)。Knapuk等人，18Nat.Genet.338-43 (1998)；Shimoda等人，58Genomic 219-32(1999)；Kelly等人， 10Genome Res.558-67(2000)；Woods等人，20Genome Res.1903-14 (2000)。已着手进行全长cDNA计划作为斑马鱼EST计划的延伸。 已构建密集RH图且与Sanger中心关于基因组测序计划的数据整合。 由NIH支持的重要的环球网资源是斑马鱼信息网络(ZFIN)，用于团 体的焦点。称为斑马鱼国际资源中心(Zebrafish International Resource Center)(ZIRC)的原种中心和支持实验室也极大地帮助该领域。Sanger 中心测序可以在2007年完成的斑马鱼基因组。
永久血细胞生成的开始已在许多脊椎动物物种中进行研究。在禽 类物种中的初期工作中，鸡-鹌鹑嵌合体证实永久造血干细胞不在卵黄 囊中出现，而在胚体内出现。Dieterien-Lievre 33J.Embryol.Exp. Morphol.607-19(1975)。在爪蟾属(Xenopus)胚胎中使用二倍体/ 三倍体嵌合体的类似研究阐明与背外侧板比较，腹侧血岛(卵黄囊等 价物)在成体血细胞生成中起较少的作用。Kau & Turpen 131J. Immunol.2262-66(1983)。基于背外侧板中胚层包含产生永久血细胞 生成的推定造血细胞的发现，几个组进一步研究了发育中的主动脉生 殖腺中肾(AGM)区。Medvinsky等人，364Nature 64-67(1993)； Godin等人，364Nature 67-70(1993)。在这个区域内，存在最初在猪 中识别的在主动脉的腹侧壁中的细胞簇。Sabin，9Contrib.to Embryol. 213-62(1920)。其他人已暗示这些簇代表衍生自“成血”内皮细胞的早 期造血干细胞。
AGM血细胞生成的过程在脊椎动物中是进化上保守的。Galloway & Zon，53Curr.Topics Dev.Biol.139-58(2003)。在小鼠中，干细胞 的开始在8.5天至9天时发生，正当循环开始时。在第11天时AGM 区的造血干细胞可以移植，然而，在第10天时的细胞不导致长期移入。 进一步的研究已阐明主动脉是极化的，且来自腹侧和背侧区域的因子 将修饰细胞的行为。例如，主动脉的背侧区域衍生自体壁(somatic)中胚 层。它在TGFα、BMP和sonic hedgehog信号传导的影响下。Parnanud & Dieterlen-Lievre，126Devel.617-27(1999)。
细胞标记研究已证实AGM中的推定HSC具有侵袭主动脉下间质 以及多种组织的潜能。Jaffredo等人，125Devel.4575-83(1998)；Jaffredo 等人，224Devel.Biol.204-14(2000)。这些细胞标记研究使用黑墨(India ink)或受输入脉管系统内用LacZ标记的逆转录病毒影响的细胞。这些 命运作图实验显示组织内的造血细胞的标记。这些研究阐明了在脊椎 动物胚胎中的主动脉内的造血干细胞的开始。
已发现几种基因是AGM血细胞生成所需的。基因runx1(以前的 AML1癌蛋白质)在其中发现造血细胞的腹侧区域中的主动脉壁中表 达；这种基因功能是AGM血细胞生成所需的。Cal等人，13Immunity 423-31(2000)。runx1突变型小鼠缺乏AGM且具有缺陷的血细胞生 成。runx1突变型中的缺陷可以被由Tie2启动子驱动的runx1转基因援 救，从而证实内皮和造血驱动的runx1表达足以调节AGM血细胞生成。 Miller等人，32Nature Genet.645-49(2002)。在runx1敲入(knock-in) 中，存在用LacZ标记的主动脉下间充质细胞，且这个观察已解释为意 指一些主动脉下细胞可以产生造血干细胞。North等人，126Devel. 2563-75(1999)。近期研究已证实主动脉下内皮细胞挤过内皮层且形 成造血簇。Bertrand等人，102P.N.A.S.USA 134-39(2005)；Tavian & Peault，33Exp.Hemat.1062-69(2005)；Tavian & Peault，49Int’l J.Devel. Biol.243-50(2005)；Tavian等人，1044Ann.NY Acad.Sci.41-50 (2005)。
因此，可能争论成血干细胞还是主动脉下中胚层细胞是HSCs的真 正前体。一旦造血干细胞芽出内皮壁，它们就是CD45+且表达转录因 子runx1和c-myb。AGM细胞也在通过notch信号传导的控制下。notch1 敲除小鼠AGM造血干细胞以及runx1和c-myb的表达在主动脉区域中 不存在。Kumano等人，18Immunity 699-711(2003)；Robert-Moreno 等人，132Devel.1117-26(2005)。此外，coupTF转录因子也缺乏AGM 造血干细胞，尽管它尚未得到充分研究。You等人，435Nature 98-104 (2005)。尽管runx1、cymb、notch和coup看起来对于AGM血细胞 生成是重要的，但这些因子的相互作用、时间和空间关系、以及其他 潜在未知因子的作用是未知的。血细胞生成开始的遗传程序的更好理 解明显是必需的。
进行化学遗传筛选以鉴定在斑马鱼胚胎发生期间调节永久HSC形 成的新途径。图1。在哺乳动物血细胞生成过程中HSC发育所需的基 因例如runx1和cmyb，在受精后36小时(hpf)时在类似于哺乳动物 AGM的区域中的背主动脉的腹侧壁中表达。North等人，16Immunity 661-72(2002)；Mukouyama等人，9Curr.Biol.833-86(1999)； Kalev-Zylinska等人，129Devel.2015-30(2002)；Burns等人，30Exp. Hematol.1381-89(2002)。野生型胚胎与个别化合物一起从3体节阶 段温育直至36hpf。将关于runx1和cmyb的探针组合且用于通过原位 杂交检测HSCs。大多数化学药品，2357种中的2275种(91.7％)无 法改变runx1/cmyb表达，而35种(1.4％)和47种(1.9％)分别导致 增加或减少的AGM HSCs。
在改变runx1/cmyb表达的82种物质中，10种影响前列腺素(PG) 途径。PGs通过cox1、cox2和组织特异性异构酶由花生四烯酸形成。 至少5种PG途径化合物增加HSC基因表达(表1)，且5种减少HSC 基因表达(表2)。在36hpf时，runx1/cmyb+HSCs包含在主动脉中 的平扁的内皮细胞系和造血簇。亚油酸(10μM)——PG前体增加 runx1/cmyb+HSCs(22种改变的/评分的30种)，而塞来昔布 (20μM)——cox2的选择抑制剂减少HSCs(26/31)。血管标记flk1 保持相对不变。前列腺素E2是在斑马鱼中产生的主要效应物前列腺素 类(Grosser等人，99P.N.A.S.USA 8418-23(2002))，并且由cox1 和cox2调节。使斑马鱼胚胎暴露于前列腺素合成的抑制剂以及外源前 列腺素。用PGE2(25/49)处理导致比PGI2(28/47)在20μM时更强 的runx1/cmyb表达，而用SC560(cox1、10μM、30/36)和NS398(cox2、 20μM、35/44)以及非特异性cox抑制剂同种型选择性抑制cox活性导 致减少的HSCs。这些发现令人信服地证明了PGs在AGM HSCs形成 中的特定作用。
表1.增加HSCs的示例HSC调节剂
鉴定为调节runx1/cmyb+HSCs的PG途径化合物在列1中列出。 列2指示在其上鉴定具体化合物的频率。第3列显示化合物对HSC基 因表达的作用(#改变的胚胎/评分的胚胎#)
表2.减少HSCs的示例HSC调节剂
鉴定为调节runx1/cmyb+HSCs的PG途径化合物在列1中列出。 列2指示在其上鉴定具体化合物的频率。第3列显示化合物对HSC基 因表达的作用(#改变的胚胎/评分的胚胎#)
使用本文描述的斑马鱼筛选技术鉴定了另外的HSC前列腺素途径 改性剂，例如表3中显示的那些：
表3.示例前列腺素途径改性剂
HSC抑制剂 HSC增强剂 吲哚美辛 dmPGE2 SC560 PGE2 NS398 PGI2 阿司匹林 二十碳三烯酸 布洛芬 ONO-259 萘普生 Cay10397 马兜铃酸 AH6809(EP1/2antag) AH23848(EP4antag)
cox1在脉管系统中的表达先前得到描述；cox1活性的击倒抑制主 动脉和静脉之间的内皮边界的发展。Cha等人，282Devel.Biol.274-83 (2005)。因为HSCs源自成血内皮细胞群体，所以cox1功能的丧失 将影响HSC发育。通过原位杂交，在36hpf时cox2在包含AGM的尾 区域中广泛表达。在FACS分离的血液和内皮细胞群体中，发现cox1 和cox2在从原始到永久血细胞生成的转换期间都是上调的。cox1表达 的高水平在lmo2+内皮细胞和CD41+HSCs中都检测到，而cox2仅在 HSC级分中是上调的(图2，小图A)。这些结果暗示cox1和cox2 通过干细胞小生境以及HSC自身的调节来参与AGM HSCs的诱导。
亚油酸和Mead酸可以充当底物用于前列腺素生产并且在筛选中 作为上调HSC形成的试剂进行分离。为了确定哪种前列腺素介导AGM 中的HSCs中的增加，使斑马鱼从3体节到36hpf暴露于外源纯化的 前列腺素并且如先前所述进行染色。在斑马鱼中，主要生理学活性的 前列腺素是PGE2、PGI2和PGF2。Pini等人，25Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol.315-20(2005)；Grosser等人，2002。这些中的每一个就 其对AGM HSCs的作用进行测试。发现PGE2和PGI2都适度地增加 AGM中的Runx1+Cmyb+细胞数目，而PGE2无作用。由于在体内前列 腺素生产和破坏的紧密调节，还检查了缓慢代谢形式的PGE2。
长效衍生物16，16-二甲基-PGE2(dmPGE2，10μM)引起检查的 78％胚胎(97/124)中的runx1/cmyb+AGM HSCs中的增加。AGM HSCs 通过在分析的90％胚胎(92/102)中的吲哚美辛(10μM)处理得到抑 制。PGE2是通过质谱分析法在36hpf胚胎(18+/-6pg/50胚胎；n＝4) 中测量的最丰富的PG，且吲哚美辛处理使PGE2形成减少在可检测水 平以下(＜2pg/50胚胎；n＝3)7。用dmPGE2的处理通过flk1染色对 脉管系统具有最低限度的作用；吲哚美辛略微改变检查的30％胚胎 (15/49)中的肌节间脉管。使具有绿色荧光HSCs和髓样祖细胞的转 基因cmyb：GFP斑马鱼与lmo2：dsRed鱼杂交，所述lmo2：dsRed鱼 具有红色荧光内皮细胞和HSCs，以显现体内化学暴露的作用。在36hpf 时，通过共焦显微镜术成像的活胚胎显示在吲哚美辛处理后沿着主动 脉底面显著减少的HSCs数目，和在dmPGE2暴露后显著增加的HSCs。 图3。这暗示PG影响沿着主动脉的背侧壁形成的HSCs的总数目；HSCs 在异常位置处的诱导不明显。通过qPCR，runx1表达在添加dmPGE2 后增强3倍，而吲哚美辛引起runx1表达中明显50％的减少；还观察 到cmyb表达中的显著改变(图2，小图B)。
为了证实PGE2活性的要求，低剂量(40μM)的吗啉代寡核苷酸 (MO)用于击倒cox1和cox2的表达；cox1活性的低剂量抑制允许胚 胎前进通过原肠胚形成，而模拟cox依赖性发育缺乏。Grosser等人， (2002)。cox的MO抑制减少AGM HSCs(cox154/74；cox260/71)。 质谱法分析证实PGE2在这些胚胎中在可检测水平以下，与MO介导 的内源前列腺素合成的抑制一致(n＝4)。对HSCs的作用通过使MO 注射的胚胎与10μM dmPGE2一起温育得到逆转(cox1/dmPGE229/52 援救的；cox2/dmPGE243/60)。PGE2合酶的MO击倒引起HSCs的 减少(35/50)，这通过dmPGE2添加得到援救(25/45)，从而指出通 过PGE2信号传导足以调节HSC形成。PGE2通过几种受体EP1-4来 发信号，所有所述受体都存在于斑马鱼基因组中。Cha等人，20Genet. Devel.77-86(2002)。EP2和EP4受体的MO击倒导致减少的runx1/cmyb 表达(EP239/63；EP444/67)，这不通过暴露于外源dmPGE2得到逆 转。通过qPCR分析证实在36hpf时，EP2和EP4存在于CD41+HSC 和CD41-非干细胞FACS分选的细胞群体中。这些实验证实PGE2介导 的信号传导调节AGM区域中的HSCs的形成。
为了进一步研究前列腺素和HSC生产之间的相互作用，使用本文 描述的斑马鱼胚胎技术筛选众多前列腺素衍生物。一般而言，测定指 出增强PGE2的稳定性的衍生物增加HSCs。关于其相对于对照未观察 到增强的那些往往是与在HSCs中无活性的受体优先结合的化合物。这 些化合物对HSC数目的作用在表4中指出：
表4.影响HSC生产的前列腺素衍生物
指示增加HSC生产的相对效力。无箭标指示相对于对照不显著的 HSC增强。
为了检查PGE2在成年斑马鱼中的HSC稳态中的作用，执行肾髓 (KM)照射恢复测定。Burns等人，19Genes & Devel.2331-42(2005)。 对野生型鱼进行亚致死照射，暴露于dmPGE2，并且通过FACS 11就 KM恢复的动力学进行评估(图4A)。与DMSO暴露的对照比较，KM 的造血重构速率在暴露于50μM dmPGE2的鱼中显著增强(图4A，B)。 祖先百分比中的升高分别先于髓样和淋巴样群体的恢复。在照射后第3 天时在PGE2处理的KM上通过qPCR的干细胞、祖细胞和内皮细胞标 记的表达水平显示了runx1和lmo2的显著上调(图5)。cox活性经由 非选择性和选择性抑制剂的抑制显著减少KM恢复和受影响的总体存 活(图5)。结果指出PGE2在KM稳态中起重要作用。
还评估了前列腺素途径对哺乳动物HSC和祖先群体的作用。在胚 样体扩增期间给ES细胞添加dmPGE2增加在OP9基质细胞层上和甲 基纤维素集落形成测定中的造血集落数目(图6A，B)。Nakano等人， 272Sci.722-24(2002)。OP9、终末类红细胞(dE)和粒细胞/单核细 胞(GM)集落在暴露于10μM(GM p＝0.005)和20μM(OP9p＝0.047； dE p＝0.04；GM p＝0.007)dmPGE2后以剂量依赖方式增加。多能粒细 胞/红细胞/单核细胞/巨噬细胞(GEMM)集落的数目在dmPGE2处理 (10μM：p＝0.017；20μM：p＝0.016)后增强2.9倍。在100μM时，dmPGE2 对ES细胞是毒性的。执行qPCR以测定PG途径组分是否存在于ES 细胞中：Cox1、Cox2、PGE2合酶、和PGE受体1-4存在于检查的所 有阶段。吲哚美辛在20μM(OP9p＝0.047)和100μM(GM p＝0.024) 时抑制集落生长(图6A，B)；抑制效应在2种集落形成测定中通过 外源dmPGE2得到援救(图7A，B)。这些数据暗示前列腺素途径在 血细胞生成中的作用在斑马鱼和哺乳动物之间是保守的。
可替代地，造血或内皮细胞在AGM(主动脉-生殖腺-中肾)区中 的扩增可以通过下述进行研究：使小鼠交配，随后在胚胎发育的第8.5 天时开始用PGE2在其饮用水中给新妊娠雌性服用。PGE2水平可以对 鼠胚胎的植入有作用；等待直至第8.5天开始治疗允许植入进行，仍提 供了药物影响可以在第10.5天时开始在AGM区中发现的干细胞群体 的时间。妊娠雌性在胚胎发育的第11.5天时用CO2处死，并且从子宫 中分离胚胎且用低聚甲醛进行固定。固定的胚胎可以加工用于关于 HSCs标记例如Runx1、c-myb或Sca1的整装制片原位杂交，或实施使 用针对HSCs的抗体的免疫组织化学，以发现扩增的干细胞群体的证 据。可以使用不同剂量，例如10(-1)、10(-3)和10(-5)微克/g 体重。3只妊娠雌性小鼠可以用于上文所述的每个剂量，且用于未暴露 的对照变量。有效剂量随后在涉及从胚胎的AGM区解剖的细胞的移植 实验中使用。
CFU-S和长期再增殖HSCs的扩增也可以在小鼠中进行研究。发 现扩增在AGM区中的潜在干细胞的单剂PGE2可以在植入后(约E8.5) 在饮用水中饲喂给妊娠雌性。对照雌性进行平行处理。妊娠雌性在11.5 dpc时进行安死术。从子宫中收集胚胎，通过显微解剖分离AGM区和 制备AGM细胞用于移植。实验和/或对照细胞的1胚胎等价物的组合 将注射入被照射的受体小鼠的尾静脉内，在其中它们将归巢至脾(短 期)和骨髓(长期)。实验细胞对对照细胞的贡献可以在移植后12天 时进行分析，其通过关于处死的受体小鼠的脾集落数目的标准CFU-S 测定，或在移植后1个月时通过骨髓的流式细胞术以测定竞争性长期 HSC再增殖。
因为心血管系统的发育与胚胎发生期间的造血干细胞生产密切关 联，所以血压对PGE2信号传导和AGM HSCs诱导的作用可能是相关 的。在任何脊椎动物中关于血细胞生成的最保守位点是主动脉的腹侧 壁。主动脉中的细胞在斑马鱼中发育30小时时出现，并且在那里发育 直至约46小时，那时它们进入循环或侵袭组织。AGM HSC生产可以 在第一次心搏后和当脉管系统内的血压达到临界水平时定时发生。在 斑马鱼中，第一次心搏在23小时时发生。在这时，心搏缓慢和心脏的 收缩相对虚弱。在30小时时，确立强循环。制备AGM干细胞的提示 可能是血压中的改变。在斑马鱼筛选中鉴定的几种化学药品调节血压 和心肌收缩性。例如，化学药品肼屈嗪，常用的抗高血压药已知增加 前列腺素E2表达。暴露于肼屈嗪的胚胎的原位分析证实血管发生中的 极少改变，但血液干细胞数目中的大量增加。此外，药物毒毛旋花子 苷原，强心苷增加心脏的收缩性且还增加AGM干细胞。此外，β阻断 剂，阿替洛尔导致血管舒张且还导致AGM干细胞提高的生产。扰乱心 搏的化学药品例如BDM和肾上腺素，以及沉默心脏(silent heart)突变 型可以改变AGM干细胞的生产，并且可以确定循环对于AGM生产是 否是必需的。为了进一步确定血压和前列腺素途径之间的关联，肼屈 嗪、毒毛旋花子苷原和阿替洛尔可以在COX2抑制剂的存在下与斑马 鱼一起温育。类似研究可以用COX2吗啉代来完成以确定它们是否能 够阻断由肼屈嗪介导的干细胞活化。
为了研究潜在的体内效应，使鼠全骨髓(WBM)先体外后体内暴 露于dmPGE2(1μM/106个细胞)，且受照射的受体用6x104处理的 WBM细胞进行移植。CFU-S12的数目在dmPGE2处理的WBM的受体 中增加3倍(p＜0.0001)(图8b，图9A，表6-表8)；类似地，更成 熟的CFU-S8集落也得到增强(图9A，表5)。为了评估内源PGE2 需求，使WBM细胞与吲哚美辛(1μM/106个细胞)一起先体外后体 内温育。1x105细胞移植后，在吲哚美辛处理的细胞的受体中观察到 CFU-S 12数目中70％的减少(p＝0.0002)(图8C，图9C，表4-表6)； 用特异性cox1和cox2抑制可见类似结果(图9K，L)。这些结果暗 示PGE2处理不仅增强造血干细胞形成，也是CFU-S活性所需的。
表5.dmPGE2对CFU-S12的作用
脾重量和CFU-S活性在注射WBM或ckit+sca1+谱系-FACS分选 细胞的受照射受体中在第12天时进行评估，所述细胞用EtOH、dmPGE2 或吲哚美辛进行处理(1μM/106细胞)。
表6.dmPGE2对辐射防护的竞争性BM再增殖的作用
WBM(CD45.1)用EtOH载体或dmPGE2进行先体外后体内处理 且移植到亚致死照射的受体(CD45.2)内，所述受体具有列2和3中 所示比的固定数目的(CD45.1/CD45.2)竞争者细胞。列4举例说明在 6周时具有超过5％CD45.1嵌合状态的动物数目，且列5证实嵌合状 态的平均百分比。最后1列指示分析的CD45.2受体数目。
表7.dmPGE2对辐射防护的竞争性BM再增殖的作用。
WBM(CD45.1)用EtOH载体或dmPGE2进行先体外后体内处理 且移植到亚致死照射的受体(CD45.2)内，所述受体具有列2和3中 所示比的固定数目的(CD45.1/CD45.2)竞争者细胞。列4举例说明在 12周时具有超过5％CD45.1嵌合状态的动物数目，且列5证实嵌合状 态的平均百分比。最后1列指示分析的CD45.2受体数目。
表8.dmPGE2对辐射防护的竞争性BM再增殖的作用。
WBM(CD45.1)用EtOH载体或dmPGE2进行先体外后体内处理 且移植到亚致死照射的受体(CD45.2)内，所述受体具有列2和3中 所示比的固定数目的(CD45.1/CD45.2)竞争者细胞。列4举例说明在 24周时具有超过5％CD45.1嵌合状态的动物数目，且列5证实嵌合状 态的平均百分比。最后1列指示分析的CD45.2受体数目。
PG途径组分存在于小鼠和人中的基质细胞和HSC群体中(普林 斯顿干细胞和基质细胞数据库)。Ivanova等人，298Sci.601-04(2002)； Nakano等人，101Blood 383-89(2003)。Cox1、Cox2、PGE2-合酶以 及受体EP2和EP4存在于在5-氟尿嘧啶(5FU)损伤后的胎儿肝HSCs 和BM HSC中，从而暗示PGE2信号传导由HSCs利用。Venezia等人， PLoS Biol 2，e301(2004)。为了测定CFU-S数目中的增加是否是由 于PGE2对干细胞群体的直接作用，使FACS分离的ckit+sca1+谱系- (KSL)BM细胞暴露于dmPGE2且以100或300个细胞/受照射的受 体进行移植。脾重量(图9D)和CFU-S12在dmPGE2处理的细胞的 受体中显著增加(图9D，表6-表8)。这些结果指出dmPGE2可以导 致HSCs和未成熟的祖先的细胞自主活化。
为了确定dmPGE2暴露是否可以增强HSC重构，进行有限稀释竞 争再增殖分析。Zhang&Lodish，103Blood 2513-21(2004)。使先体 外后体内暴露于dmPGE2的WBM(CD45.1)以各种剂量与固定数目 的未处理的竞争者细胞(CD45.1/CD45.2)独立混合，并且注射入同类 受体小鼠(CD45.2)内。外周血在移植后6、12和24周时获得并且通 过FACS进行检查，以确定处理的测试细胞对造血再增殖的贡献(图 9E-9J)。阳性重构定义为测试细胞多谱系嵌合状态＞5％(图9F，H， I)。如通过Poisson统计学分析测定的，在dmPGE2处理的BM中可 见再增殖细胞数目中的显著增加(图8E，图9G，9J)。在6周时，在 dmPGE2处理的WBM的受体中移入细胞/106个WBM细胞的计算频率 增强3.3倍(p＝0.005)，且短期再增殖HSCs的频率在移植后12周时 高4倍(p＝0.002)(图8E，8F，图9G)。在24周时，在dmPGE2 处理的细胞的受体中长期再增殖HSCs的频率增强2.3倍(p＝0.05)(图 8F，图9J)。在12和24周分析时，所有受体中的重构都是多谱系的， 从而指出瞬时dmPGE2处理增加小鼠中的再增殖HSCs的频率而不损 害分化能力。在dmPGE2处理的HSCs对血细胞生成的贡献中未观察 到下降。为了测定dmPGE2处理是否增强对BM小生境的归巢，WBM 用活体染料CDFA进行标记，随后暴露于dmPGE2且移植。在移植后 12小时时，在对照和dmPGE2处理细胞之间不存在归巢中的显著差异 (p＝0.83)。
在更精确地表征干细胞生产中的前列腺素途径的要求的努力中， 利用几种另外的商购可得的环加氧酶(COX)抑制剂。一般的COX抑 制剂吲哚美辛、萘普生、布洛芬和阿司匹林(asprin)以及Cox2特异 性抑制剂NS-398，都经由上文描述的测定就对AGM HSCs的作用进行 测试。每种Cox1或Cox2化学抑制剂减少主动脉中的干细胞。Cox通 过改变花生四烯酸负责加工PG′s。如通过ephrinB2和Flk1染色可见的， 血管发生和主动脉规格在处理的胚胎中保持完整，然而，血管发生的 一些方面特别是肌节间血管的形态学被一些化学药品扰乱。关于COX1 和COX2的吗啉代反义寡核苷酸也个别注射入斑马鱼胚胎内，以证实 主动脉中的干细胞的减少是由于Cox抑制。使用任一吗啉代 Runx1+Cmyb+细胞在AGM区域中都减少。如先前报道的，极高浓度 的Cox1 MO引起主动脉和静脉规格中的缺陷，而cox2吗啉代在高浓 度时引起原肠胚形成停滞。Cha等人，20Genes & Devel.77-86(2006)； Cha等人，282Devel.Biol.274-83(2005)。在较低浓度的任一MO时 观察到HSCs中的减少，且尾部中的脉管结构未严重改变。此外，精确 描绘脉管系统的fli1 GFP转基因斑马鱼用于评估吗啉代和化学药品对 血管发生的作用。Cox 1或Cox2的内杂交(Inhybridization)不影响通 过化学药品或吗啉代的主动脉的发育。肌节间血管被一些处理改变。
前列腺素E2是在斑马鱼胚胎发生期间制备的主要前列腺素且调节 脉管组织。Pini等人，25Arterioscler Thromb Vasc Biol.315-20(2005)； Grosser等人，99P.N.A.S.USA 8418-23(2002)。精确地何种前列腺 素受前列腺素途径组分的化学药品和/或吗啉代抑制影响可以通过质谱 法分析进行分析。类似地，质谱法可以证实在暴露于前列腺素途径底 物例如亚油酸或mead酸后的E2诱导。PGE2在AGM HSCs形成中的 作用分析理论上导致何种受体在将前列腺素信号传导传播给下游效应 物中有活性的分析。4种PGE2受体已在斑马鱼中得到鉴定。PGE受体 的特异性激动剂和拮抗剂帮助这种鉴定。此外，介导HSC诱导的特异 性受体可以使用如前所述的吗啉代通过功能击倒进行研究。前列腺素 受体各自的表达以及2种环加氧酶可以通过原位杂交进行研究，以评 估这些基因产物在发育自始至终的定位，特别是集中于AGM区域。
本发明证实PGE2在2种脊椎动物物种斑马鱼和小鼠中增强造血干 细胞和多能祖先的数目。先前研究已证实未修饰的PGE2可以影响小 鼠中的血细胞成熟(Boer等人，100Blood 467-73(2002)；Rocca等 人，99P.N.A.S.USA 7634-39(2002))，和刺激CFU-S8祖先中的细 胞周期(Feher & Gidali，247Nature 550-551(1974))；然而，PG介导 的细胞信号传导对HSCs的作用先前未进行检查。cox1和cox2看起来 在AGM HSC形成中具有不同功能：cox1在造血小生境特别是成血内 皮的形成中是重要的，而cox2可能涉及HSCs自身的自我更新和增殖。 相反，纯合Cox1或Cox2敲除小鼠是存活的，在HSC形成中没有明显 缺陷(Langenbach等人，58Biochem.Pharmacol.1237-46(1999))； 认为这是由于PGE2的母体和同胞贡献。Cha等人，282Devel.Biol. 274-83(2005)；Langenbach等人，83Cell 483-92(1995)。
重要的是，Cox2-/-小鼠的分析证实血细胞比容水平中的改变和无 法从5-FU诱导的BM损害中恢复(Lorenz等人，27Exp. Hematol.1494-502(1999)；这些发现暗示在成年Cox2-/-小鼠中HSC 缺陷的存在与我们提出的关于PG在HSC稳态中的作用一致。为了阐 明Cox1和Cox2在调节成体中的HSC稳态中的作用，我们使用cox1 (SC560)或cox2(NS398)的选择性化学抑制剂进行CFUS 12(图9k， l)和5-FU骨髓恢复测定。发现与对照相比较，任一酶的抑制显著改 变CFUS活性，以及外周血和BM WBC数目的恢复(图9m，n)。此 外，dmPGE2在5FU处理后的施用显著增强BM恢复。总之，这些数 据暗示如在斑马鱼中，Cox1和Cox2维持在成年小鼠中调节HSC稳态 中的作用，且PGE2是这种HSC调节的介质。
经历BM移植的患者显示增加的内源PGE2水平。Cayeux等人， 12Bone Marrow Transplant 603-08(1993)。尽管由于血小板抑制，cox 抑制剂一般不在移植后给予，但我们的研究提高了此种试剂在人BM 抑制后的施用可能损害HSC移入的可能性。PGE2及其类似物已安全 地施用于人。Talosi等人，32J.Perinat.Med.368-74(2004)；Thanopoulos 等人，146Eur.J.Pediatrics 279-82(1987)。这些可能对于HSCs的先 体外后体内或体内扩增是有用的。用于扩增鼠HSCs的dmPGE2浓度 包含在PGE2在人血清中的生理范围内。Hertelendy等人，3 Prostaglandins 223-37(1973)。本公开内容举例说明PGE2在脊椎动 物中充当HSCs的有效调节剂，并且可能证明在治疗具有骨髓衰竭或移 植后的患者中有用。
在斑马鱼中的血细胞生成研究先前已集中于命名为原始的第一波 血细胞生成，和斑马鱼胚胎的主动脉、生殖腺和中肾(AGM)区中的 永久造血干细胞的衍生。关于脊椎动物中的AGM干细胞的生产知之甚 少，但runx1和notch1已显示是AGM HSC形成所需的。还存在由此 notch调节runx1的遗传关系。使用约2500种具有已知作用的化合物文 库大规模化学遗传筛选干细胞诱导效应物，指出导致前列腺素(PG) E2生产的化学药品引起干细胞数目中的增加，而阻止PGE2合成的化 学药品导致干细胞的减少。还发现其他化学药品例如血管舒张剂和血 管收缩剂改变干细胞数目，从而确立胚胎发生期间血管紧张度是干细 胞生产的触发物的假设。Wnt信号传导途径的成员已假定调节造血干细 胞数目，尽管迄今为止这些研究已唯一地检查成体骨髓稳态。研究Wnt 信号传导在胚胎AGM生产中的作用，以鉴定与notch-runx途径或与前 列腺素的潜在遗传相互作用。为了定义参与AGM干细胞形成的另外基 因，继续在AGM生产中具有缺陷的突变型的大规模筛选。至少12种 突变型已得到分离。鉴定的基因和途径可能对我们的基本干细胞生物 学的理解具有显著影响，并且可以导致关于疾病例如镰状细胞贫血、 地中海贫血和再生障碍性贫血的新疗法。
使用斑马鱼作为模型，表征涉及在胚胎发生期间永久造血干细胞 衍生的信号传导途径的方法，包括使用突变型、morphants、转基因和 化学药品评估前列腺素调节AGM干细胞生产的假设，和检查wnt途径 在AGM HSCs形成中的作用，且研究与已知在AGM区域中有活性的 其他信号传导途径的潜在相互作用。斑马鱼遗传学可以用于限定在胚 胎发生期间涉及AGM HSC形成的新途径，且允许大规模诱变筛选斑 马鱼的永久血细胞生成中的缺陷。这允许分离和表征负责正常AGM HSC生产的一些突变基因。
在限定调节胚胎血细胞生成的产生的新途径中的工作已阐明 CDX-HOX途径。发现缺陷基因负责突变型斑马鱼kugelig中减少数目 的HSCs。Davidson等人，425Nature 300-06(2003)。kgg突变型在 早期胚胎发生期间具有SCL+造血干细胞的缺陷，且缺乏祖先标记 GATA-1和runx1的表达。突变胚胎中的脉管系统形成在脉管系统中正 常但极少红细胞的循环。突变基因编码CDX4，尾部家族的成员。哺乳 动物具有3种CDX基因，包括CDX1、2和4。尾部基因已知通过调 节HOX基因来起作用。较后的HOX基因显示在kgg突变型中减少的 表达。已确定HOX基因在血液发育中作用于CDX4的下游。hoxb7或 hoxa9的超表达导致kgg突变型中的造血缺陷的强援救。为了评估 CDX4是否足以指定胚胎发生期间的造血干命运，将CDX4 mRNA注 射入斑马鱼胚胎内。许多SCL阳性细胞在通常不形成血液的胚胎区域 中发现。cdx4足以诱导异位血液干细胞的事实允许这个工作转化到哺 乳动物系统内。
尽管鼠胚胎干细胞(ESCs)的显著体外血液形成潜能，但获得可 以重构受照射小鼠的造血干细胞(HSCs)已证明是挑战性的。研究者 已用工程改造为异位表达hoxB4的ESCs成功地移入致死照射的成年 小鼠。Kyba等人，109Cell 29-37(2002)。血液重构显示髓样优势， 可能是由于从这些胚胎群体无法完全模仿成体HSC。CDX4和hoxb4 的共表达促进造血胚细胞在支持性OP9基质培养上的强扩增。当静脉 内注射入致死照射的小鼠内时，这些细胞群体提供强辐射防护，和重 构高水平淋巴样-髓样供体嵌合状态。Wang等人，102 P.N.A.S.USA 1981-86(2005)。
为了探究可能是cdx-hox途径下游的途径，微阵列分析用于鉴定在 kgg突变型和野生型胚胎中差异表达的基因。Raldh2，视黄酸(RA) 生产所需的酶在血液形成的早期阶段期间在kgg突变型中超表达。 Perz-Edwards等人，229Devel.Biol.89-101(2001)；Begemann等人， 128Devel.3081-94(2001)。这个数据导致RA可能作用于抑制血液 形成和CDX-HOX途径用于限制RA生产的假设，从而允许血液形成 发生。换言之，cdx-hox途径控制视黄酸信号传导。
为了测试这点，野生型斑马鱼胚胎用RA进行处理，且事实上它们 变得严重贫血。用阻断raldh2活性的化学药品DEAB处理kgg胚胎 (Perz-Edwards，2001)恢复kgg突变型中的血细胞生成。用DEAB处 理无法援救hoxa9a的表达，从而指出RA作用于hox基因的下游。DEAB 还在野生型胚胎中诱导类红细胞的扩增。DEAB和RA还影响源自ES 细胞衍生的胚样体(EBs)的小鼠造血祖先的形成。在发育的第2至3 天之间给EBs添加DEAB导致‘原始’胚样集落(CFU-Ep)中5-8倍增 加，类似于斑马鱼中的结果。用DEAB可见原始卵黄囊类红细胞的类 似刺激。相比之下，RA处理引起所有集落类型的生长中的一般抑制。 总之，这些结果暗示其中RA受CDX-HOX途径抑制的新模型是卵黄 囊血细胞生成发生所需的。还参见Davidson等人，425Nature 300-06 (2003)；Davidson & Zon，292(2)Devel.Biol.506-18(2006)。
鉴定的另外基因是moonshine，正常原始和永久红细胞生成所需的 基因。突变的基因是Tif1γ，染色质的推定调节剂。Ransom等人，2PloS 1188-96(2004)。这种因子包含PHD指、布罗莫结构域、锌指，并且 近期已通过与SMAD2和SMAD437相互作用与BMP信号传导联系。 Dupont等人，121Cell 87-99(2005)。这种因子在血细胞生成中的作 用可以使用阻抑基因增强子筛选进行确定。
另外的突变型已命名为bloodless。这种基因是原始血细胞生成和 AGM血细胞生成所需的，尽管永久血细胞生成恢复。bloodless表型看 起来是非细胞自主的并且bloodless控制SCL和GATA1表达。在这种 突变基因作图中存在困难。Liao等人，129Devel.649-59(2002)。
阐明类红细胞至髓样命运转换的机制的工作显示GATA1是髓样 谱系抑制所需的。Galloway等人，8(1)Devel.Cell 109-16(2005)。 更具体而言，研究称为vlad tepes的GATA1缺陷斑马鱼突变型，且揭 示整个血岛转化成髓样命运。这种有趣的细胞命运改变举例说明 GATA1和PU.1拮抗彼此的活性。它们可以形成调节髓样和类红细胞 程序的复合物。进一步的工作证实PU.1的击倒使髓样细胞祖先变成类 红细胞。39Rhose等人，8Devel.Cell 97-108(2005)。这项研究提供 了关于在造血系统内的可塑性的合理性。研究GATA1和GATA2的靶 基因表达和类红细胞的依赖已显示大多数基因绝对依赖于GATA1，然 而，一些基因需要GATA1和GATA2用于完全表达。已发现几种新基 因是绝对GATA不依赖的。
SCL缺陷morphants的表征指出这种SCL MO表型非常类似于哺 乳动物生物学中的SCL敲除的那种。SCL是早期造血细胞发育所需的。 SCL的异常调节在正常血细胞生成中有缺陷的cloche和spadetail突变 型中是明显的。Dooley等人，277(2)Devel.Biol.522-36(2005)。
在理解血岛发育的努力中，研究者分离了LMO2启动子，且证实 启动子的近侧163个碱基对足以诱导在发展中的血岛以及脉管系统中 的GFP表达。这些转基因鱼系对于移植实验是无价的。DsRed以及GFP 都已与LMO2启动子连接，从而允许构建双重转基因系。原始谱系的 这些LMO2阳性细胞在早期胚胎或成体的移植模型中不赋予长期重 构。Zhu等人，281(2)Devel.Biol.256-269(2005)；Mead等人， 128Devel.2301-08(2001)；Oates等人，98Blood1792-1801(2001)； Pratt等人，11Physiological Genomics 91-98(2002)；Huber等人，11 Current Biology 1456-61(2001)。
主要目标是发展用于斑马鱼系统的造血细胞移植。通过流式细胞 术的造血群体测定发现简单的向前散射和侧散射可以分离斑马鱼中的 所有造血系统谱系。类红细胞、髓样和淋巴样细胞可以与前体级分一 样好地分离。这指导特定细胞群体移植到缺乏血液的突变型胚胎内。 将来自供体的GFP阳性肾髓注射入一般bloodless的这些胚胎内。移植 后6个月，循环中的所有细胞都是绿色的，从而指出它们是供体衍生 的。vlad tepes和bloodless胚胎看起来是极佳宿主。此外，次级移植物 证实在肾髓中的长期重构活性。还证实成体骨髓可以用于援救致死照 射的成年斑马鱼中的血细胞生成。Traver等人，104Blood 1298-1305 (2004)。这种移植规程对于后续干细胞生物学研究是非常有用的。 还参见Traver等人，4Nature Immunol.1238-46(2003)。
斑马鱼全肾髓(WKM)细胞的有限稀释分析可以显示HSCs在斑 马鱼肾髓中的频率。因为这些研究定量可转移干细胞的数目，所以它 们提供了用于比较野生型对突变型斑马鱼中的干细胞功能的功能测 定。为此，重构研究通过下述来进行：使用亚致死γ辐射剂量切除未 标记的受体的造血淋巴系统(hematolymphoid system)，然后将 5,000-500,000个GFP标记的WKM细胞的稀释物移植到宿主内。外周 血用作WKM稀释测定中的载体细胞且当单独注射时充当阴性对照。 移植后3个月后，WKM从宿主切开，并且通过流式细胞术进行分析， 以测量髓样闸门中的GFP+供体细胞的百分比。受体就供体移入评分为 “成功”或“失败”。使用二项式最大限制统计学，测定HSCs在斑马鱼 WKM中的发生率为61,910个细胞中1个，其中95％置信区间在 50,798-79,244个细胞之间。这个数目非常类似于小鼠的那种，其在 50,000-130,000个HSCs/骨髓细胞体积中具有～1个。Smith等人，88 P.N.A.S.USA 2788-92(1991)。因此，这些数据暗示骨髓群体中的干 细胞数目是进化上保守的。
工作也已探究斑马鱼AGM干细胞生产和notch途径。AGM被认 为由早期体节发生(somitogenesis)期间存在的侧中胚层形成。该组织表 达flk1。随着其迁移，它开始表达称为gridlock的动脉特异性标记。随 后，不迟于18体节时，细胞表达tie1和tie2，并且继续内侧迁移且形 成固体索(solid cord)。该索变成空心的并且成为主动脉。在30小时 时，runx1转录因子最初腹侧表达。其后不久，c-myb阳性造血细胞在 主动脉的腹侧壁中发现。主动脉的背侧部分表达称为tbx20的T盒转 录因子。斑马鱼中的过程看起来非常类似于其他脊椎动物的那种，包 括人、小鼠、鸡和蛙。Galloway & Zon，53Curr.Topics Devel.Biol. 139-58(2002)。
还检查了runx1在AGM发育中的作用。类似于小鼠敲除，runx1 在斑马鱼中的击倒导致AGM中表达c-myb的细胞数目减少。runx1的 超表达导致主动脉中干细胞数目的扩增，和c-myb在静脉中的异位表 达。原始血细胞生成在runx1 morphant中正常进行。这提供了关于AGM 形成的runx1需求的证据，并且另外确定runx1是足以产生永久干细胞 的因子。notch途径在AGM形成中的作用的评估揭示runx1作用于notch 信号传导下游或与之平行。
突变型mindbomb缺乏用于δ，notch受体的配体的E3泛蛋白连接 酶。同样，mindbomb突变型完全缺乏notch信号传导，且无法在AGM 中制备任何造血干细胞。Itoh等人，4Devel.Cell 67-82(2003)。runx1 的超表达在mindbomb中援救AGM中的c-myb阳性细胞数目。这暗示 runx是notch的重要靶。在初步研究中，给mindbomb突变型添加长效 前列腺素E2无法证实任何类型的援救。这可能是由于细胞响应前列腺 素E2的能力中的缺陷；notch信号传导在AGM区域发育中可能比前 列腺素E2更早需要。在mindbomb突变型中使用前列腺素E2的剂量 应答曲线可能阐明了这点。相反，不迟于36hpf时具有增加的干细胞数 目的Notch ICD胚胎可以与Cox抑制剂一起温育，以察看前列腺素信 号传导是否具有介导AGM HSC上调的作用。其他造血突变型可以类 似研究。
独特的转基因系统用于检查notch途径。使携带驱动gal4的热激 (HS)启动子的1种转基因系与另一种系进行交配，所述另一种系具 有驱动notch的细胞内结构域的UAS序列(称为NICD的激活型)。 Lawson等人，128Devel.3675-83(2001)。这在热激后提供了针对胚 胎的活化notch信号。在热激后，这些胚胎的AGM显示c-myb和runx1 以增加的强度并且在现在包括背侧和腹侧主动脉以及静脉的较大区域 表达。基于用磷酸-组蛋白H3抗体的免疫染色或通过BrdU标记，这种 异位表达不伴随细胞增殖中的变化。这种命运改变可以被runx1吗啉代 阻止，从而形式上证实runx1作用于notch的下游。
notch活化是否在成体血细胞生成中起类似作用，使用双转基因鱼 以条件超表达notch来研究。鱼用2000rads进行亚致死照射，然后实 施热激，活化notch。骨髓血细胞生成通过FACS就向前和侧散射进行 分析，以检查髓样、淋巴样和前体级分。不迟于热激后第7天时，表 达NICD的鱼具有增加的髓样和前体级分，并且不迟于第14天时，与 野生型相比较，存在淋巴样细胞中的增加。照射后的恢复在notch活化 后更快速。此外，runx1、scl和lmo2在热激后不久在成体中上调。这 证实我们在胚胎中发现的notch-runx途径也在成年斑马鱼中起作用。 参见Burns等人，19(19)Genes & Devel.2331-42(2005)。
斑马鱼已证明在疾病的表征中是有用的。已开发了具有人疾病等 价物的许多突变鱼。参见，例如，Dooley & Zon，10Curr.Op.Genet. Devel.252-56(2000)。例如，在斑马鱼系统中已发现影响红细胞生成 的许多膜缺陷。在研究中，鉴定的突变基因是BAND 3、BAND 4.1和 血影蛋白。有趣的是，BAND 3突变型看起来具有非常类似于HEMPAS 或CDA 2型的缺陷。BAND 3位于分裂类红细胞前体中的纺锤极，在 其中它调节先天性；异常红系造血性(dyserthropoietic)贫血。参见，例 如，Liao等人，127(3)Devel.127(3)：5123-32(2000)；Paw等 人，34(1)Nature Genet.59-64(2003)。
近来，grx5作为shiraz突变基因分离。Shaw等人，440Nature 96-100 (2006)。谷氧还蛋白5位于线粒体中并且是铁硫簇生产所需的。还 分离了frascati突变型中的线粒体铁输入基因缺陷，且类似于鱼，frascati 敲除小鼠发展贫血。还参见Donovan等人，403Nature 776-81(2000)； Donovan等人，100Blood 4655-60(2002)；Wingert等人，131(24) Devel.6225-35(2004)；Fraenkel等人，115J.Clin.Invest.1532-41. (2005)；Wingert等人，436Nature 1035-39(2005)。
作为Trans-NIH Zebrafish Genome Initiative的部分，设计了 Affymetrix芯片。这涉及通过研究突变型和野生型在不同时间点上的基 因表达模式影响斑马鱼血细胞生成的超过10种突变型的研究。Weber 等人，106(2)Blood 521-30(2005)。我们还通过个体原位杂交筛选 评估了大规模表达概况分析。这项工作已鉴定了作为血液特异性程序 的部分的超过160种基因。
wnt途径在AGM HSCs形成中的作用以及与已知在AGM区域中 有活性的其他信号传导途径的潜在相互作用也是相关的。基于关于wnt 途径在成年骨髓中的HSC自我更新中的作用的良好工作，Reya等 人423Nature 409-14(2003))，wnt途径可以调节AGM HSC生产。 关于wnt信号传导的典型途径涉及GSKβ的活化和β-联蛋白随后易位 至核，在其中它随后与2种相似转录因子TCF或LEF1之一相互作用， 以活化wnt调节的基因(图10)。wnt途径受dickkopf和APC负调节。 wnt3的表达刺激小鼠中的HSCs扩增3倍(Reya，2003；Wilbert等人， 423Nature 448-52(2003))，但令人惊讶地HSCs中的β-联蛋白的敲 除不导致自我更新中的缺陷。Cobas等人，199J.Exp.Med.221-29 (2004)。更近期的研究已证实GSK3B抑制剂导致HSC分化中的减 少。
尽管已知关于wnt信号传导在干细胞自我更新调节中的作用，但 关于AGM中的永久干细胞的wnt诱导的信息很少。支持wnt信号传导 在HSC诱导中起作用的假设，β-联蛋白通过差异展示RT-PCR法鉴定 为在小鼠(REF)中HSC形成时在AGM区域中差异表达。为了定义 wnt信号传导在AGM中的作用，可以研究转基因鱼的wnt途径特异性 可诱导系。已制备了许多转基因鱼，其中热激启动子驱动wnt途径的 各种成员的表达。用于研究的示例鱼包括：热激wnt8，热激dickkopf， 和热激显性失活TCF突变型。类似于notch研究中利用的那种的单一 热脉冲可以用于研究wnt信号传导抑制或上调对AGM HSC生产的作 用。
在更好地理解wnt信号传导在AGM形成中的作用的努力中，可以 检查wnt8热激鱼。wnt8在胚胎的较后方面中在尾芽区域中表达。基于 runx1和c-myb表达，胚胎在18-22体节之间的热激导致AGM中的干 细胞群体的显著上调。wnt8的活化导致干细胞的扩增，但其他wnts可 能在这个过程中类似地起作用。测定哪种wnt蛋白质在发育中的AGM 区域中表达可能是相关的。CDX4+细胞将通过微阵列分析进行检查。 信息学可以用于检查在这些HSCs中表达的wnts和wnt受体的特性。 此外，wnt 3、wnt5和wnt8cDNAs将通过原位杂交进行研究。由微阵 列推导的其他wnts将通过ISH进行研究。在发育期间热激的完整时间 过程可以局限于在其中wnt信号传导是HSC形成所需的精确时间段。 还可以检查抑制AGM中的wnt信号传导的热激显性失活的TCF和热 激dickkopf系。显性失活的TCF消除了经典途径，而dickkopf热激构 建体抑制经典和非经典wnt途径。造血干细胞在这些系的热暴露后完 全缺乏。为了进一步分析wnt是否是AGM HSC形成所需的，几种wnt 激动剂和拮抗剂化学药品可以例如通过本文描述的方法进行测试。
在HS wnt8、HS dkk和HS-DN TCF转基因胚胎中在热激后的基因 表达研究经由表达杂交技术和Q-PCR分析进行检查。造血干细胞标记 包括SCL、LMO2、GATA-2、GATA-1、runx1、PU.1和ikaros可能是 相关的，以测定wnt信号传导对HSC群体的作用。同样终末分化的淋 巴样(rag1、LCK、免疫球蛋白T细胞)，髓样(髓过氧化物酶、L- 丝束蛋白)和类红细胞(促红细胞生成素受体，Erb2)血细胞群体以 及内皮(fli1、flk1、tie2和tie1)细胞的标记的表达将在wnt诱导和抑 制后进行检查。此外，AGM区域中的wnt表达可以使用TOP-FLASH 斑马鱼系进行直接监控。TOP-FLASH报道分子鱼在由多聚LEF 1结合 位点构成的诱导型启动子下表达GFP。Dorsky等人，241Devel. Biol.229-37(2002)。报道分子已知在较后的中胚层形成中是活性的。 可能先前描述的cdx4由wnt模仿。TOP-FLASH报道分子的表达可以 在发育中的AGM区域中深入检查。wnt途径热激鱼用于进一步研究 wnt信号传导在成年髓稳态中的作用。评估在HS wnt8和HS-DN TCF 转基因鱼中在照射后的肾髓恢复将解释关于wnt信号传导在HSC增殖 和维持中的需求。此外，有限稀释和使用热激诱导的髓与正常髓相比 较的竞争性再增殖研究是有用的。
wnt和notch途径与AGM干细胞的前列腺素诱导的关联也可能在 血细胞生成中是重要的。notch功能失去和wnt功能失去的胚胎表型是 非常相似的，其中两者都导致AGM干细胞的显著缺乏。这导致一种途 径可以交叉调节另一种的假设。我们计划评估热激wnt8构建体是否将 援救mindbomb突变型，和类似地显性失活的TCF突变型是否可以通 过活化notch ICD得到援救。这种类型的分析应导致这些途径在胚胎发 生期间活化的精确定时的更好理解。它还允许我们关于这些途径相互 作用理解更多。突变鱼(和/或吗啉代注射的鱼)还可以用于与notch 和wnt缺乏以及功能表型获得组合。如果2种途径合作以调节干细胞 诱导和/或干细胞增殖、更新和分化，那么应确立如上所述和关于Notch 表征的分子标记检查。
wnt途径的成员已显示与前列腺素相互作用。例如，对于由wnt诱 导的结肠癌模型，阻断Cox1或2的非类固醇类阻止癌形成。如上所述， PGE2导致AGM中的干细胞的增加。PGE2可以援救wnt缺陷胚胎。 COX2抑制剂可以阻断HS-wnt8的作用。由本发明包含的其他HSC改 性剂包括Wnt途径改性剂。发现抑制HSCs的示例Wnt途径改性剂是 Kenpaullone(HDAC效应，不是GSK3b)，和丙戊酸(HDAC效应， 不是GSK3b)。发现修饰Wnt途径的HSC增强剂是氯化锂和BIO。
使用表达wnt的激活物或阻遏物的转基因斑马鱼，检查了wnt信 号传导对主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区域中的HSCs发育的作用。 wnt信号传导的诱导导致增强的HSC形成，而抑制减少HSC生产。在 成年斑马鱼中，增加的wnt活性增强照射后肾髓恢复期间的祖细胞数 目。因为(PG)E2调节脊椎动物中的HSC形成和稳态，所以在HSC 发育期间和髓恢复中的wnt和PG途径的相互作用通过使TOP：dGFP 胚胎暴露于调节前列腺素信号传导的药物进行探究。发现二甲基-PGE2 (dmPGE2)，HSC形成的有效诱导物增强wnt信号传导，而环加氧酶 抑制剂吲哚美辛(indo)导致wnt活性的事实上缺乏。HSC形成经由 wnt阻遏的抑制由dmPGE2处理部分援救，而HSCs经由wnt超表达的 诱导由indo暴露逆转。Indo还阻断在成年鱼中照射后wnt介导的肾髓 祖先中的增加。PGE2诱导TOP：gal小鼠的AGM中的wnt活性，从 而指出wnt和PG相互作用的分子保守和wnt在HSC形成中的作用。
更具体而言，Wnt通过其主要转录介质β-联蛋白的信号传导在许 多胚胎背景中控制组织成型、细胞命运决定和增殖中起重要作用，包 括器官的发育和分化。参见图10。Wnt活性已显示在HSC移植到 NOD/SCID小鼠内后增加成年HSC自我更新且增强干细胞再增殖。也 发现β-联蛋白在e10-12时在小鼠胚胎中的AGM区域中差异表达。wnt 信号传导在斑马鱼中HSC形成期间是否有作用使用wnt途径的热激可 诱导激活物和阻遏物来测定。简言之，收获wnt可诱导胚胎且于38℃ 热激20分钟。基因型通过GFP表达进行分选，且AGM HSCs通过 runx1/cmyb表达进行原位分析。在5体节时wnt8经由热激的诱导导致 在36hpf时在AGM中增加的HSC形成，而wnt信号传导经由dkk和 dnTCF诱导的消除显著抑制runx1/cmyb表达。这是在任何生物中wnt 信号传导是AGM HSC形成所需的第一个证据。
照射恢复测定也用于研究wnt信号传导在斑马鱼中造血稳态中的 作用。表达wnt相关基因的转基因鱼进行亚致死照射，并且热激基因 诱导通过在照射后第2天时于38℃过夜温育来起始。如先前对于前列 腺素实验概述的，肾髓在照射后的各个时间点上进行收获。图11。利 用热激wnt8鱼证实在照射后第10天时与对照相比较，祖先群体中的 增加，类似于用PGE2可见的那种。wnt信号传导经由热激dkk或dnTCF 的诱导彻底改变髓恢复的动力学，并且可以导致髓再生的完全衰竭和 致死现象。
具有APC突变的患者中的临床经验已显示前列腺素合成的抑制导 致减少的wnt介导的息肉形成。此外，在结肠癌细胞系中的近期研究 暗示前列腺素和wnt信号传导途径之间的相互作用。这些相互作用使 用wnt报道分子斑马鱼转基因系TOP：dGFP进行体内检查。在50％ 外包时，对胚胎不实施任何处理(对照)，实施吲哚美辛或PGE2，且 在胚胎中活化的wnt信号传导的量通过由wnt结合位点驱动的GFP诱 导进行评估。在头中GFP表达中的改变的分析通过原位杂交进行分析。 与对照相比较，PGE2处理显著增强wnt活性，而吲哚美辛严重减少 GFP表达。图12。这些数据包含在胚胎发育期间wnt和前列腺素途径 的相互作用的首次体内证明。
此外，吲哚美辛和dmPGE2用于研究在HSC发育期间和损害后的 髓恢复中的wnt和前列腺素途径的相互作用。图13反映PG和wnt途 径的相互作用的潜在点。在5体节时热激的wnt8胚胎中wnt介导的 runx1/cmyb表达的增强可以通过用吲哚美辛处理得到阻断。此外，如 通过关于runx1/cmyb的原位杂交显示的，dmPGE2可以援救在36hpf 时dkk活化对AGM HSCs形成的抑制作用。然而，初步研究显示 dmPGE2处理不足以在超表达dnTCF的胚胎中援救HSC形成。
为了测定前列腺素途径操作是否可以改变成体中的肾髓再增殖中 的wnt活性，在Top：dGFP系中进一步检查dmPGE2和吲哚美辛的作 用。dmPGE2在照射后第3天时显著增强wnt活性，而吲哚美辛抑制 GFP表达。图14。为了辨别前列腺素信号传导的调节是否可以修饰wnt 介导的对照射后肾髓恢复的作用，wnt基因通过在照射后2天时于38℃ 热激和随后在热激后1天时暴露于前列腺素途径药物进行活化。使hs： wnt8-GFP鱼暴露于吲哚美辛，同时使dkk1、axin和dnTCF转基因鱼 暴露于dmPGE2。全肾髓在照射后第10天时通过FACS进行分析。观 察到用吲哚美辛处理严重减少在前体细胞群体中wnt介导的增强，从 而暗示PGE2水平可以在体内直接调节wnt信号传导。
这些实验暗示wnt活性通过PG信号传导调节的药理学操作将提供 用于治疗性调节HSC稳态的新方法。
现在将通过非限制性例子进一步描述几个实施方案。
实施例
实施例1.化学筛选设计和证实测试。
将野生型年龄匹配的胚胎排列到个别测试化合物的48孔板(～5 个胚胎/孔)内，并且从3体节暴露直至36hpf时。利用3个化合物文 库：NINDS Custom Collection(1040)、SpecPlus Collection(960)和 BIOMOL ICCB Known Bioactives(480)。5％(123/2480)的化合物 是毒性的，导致死亡或严重形态学异常。进行关于runx1和cmyb的原 位杂交以评估HSCs。化合物以10μM、20μM和50μM进行重新测试。 干细胞特异性在36hpf时使用flk1进行评估。PGE2、PGI2、dmPGE2 和所有cox抑制剂(Sigma)以10μM-20μM使用。
runx1/cmyb的定性评分(具有改变的HSCs的胚胎#/评分的#)使 用下述标准来进行：正常的/未改变的＝runx1/cmyb+内皮细胞的连续系 和偶然的造血簇。减少的/缺乏的＝runx1/cmyb+细胞中的减少，包括在 HSCs的系中大缺口的存在，分离的阳性细胞，或表达的缺乏。增加的 /过量＝runx1/cmyb+细胞中的增强，包括许多HSC簇，HSCs的增厚系， 或异位表达。
共焦成像
将活的36hpf处理的双基因斑马鱼胚胎包埋在包含0.4mg/ml Tricaine-S的1％低熔点琼脂糖中用于共焦成像。cmyb-GFP转基因报 道分子系由包含cmyb启动子基因组序列(Galloway，Zhu，Lin，Zon， 未公开的)的BAC生成；lmo2：DsRed鱼如所述的进行生成27。对于 HSC定量，cmyb/lmo2+阳性细胞在z-堆叠(stack)图像的计划中进行 计数(n＝10/处理)。
吗啉代击倒
将针对斑马鱼cox1和cox2、PGE2合酶以及EP2和EP4的吗啉代 寡核苷酸(GeneTools)(Grosser等人，2002；Cha等人，2006，Pina 等人，25Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.315-20(2005))注射(40μM) 入在单细胞期时的斑马鱼胚胎内。对于援救实验，使3体节期MO注 射的胚胎暴露于10μM dmPGE2。
微阵列基因表达概况分析
gata1：GFP(12体节)、lmo2：GFP(12体节和35hpf)和cd41： GFP(35hpf)阳性细胞进行FACS分选；如前所述总RNA进行纯化 且使用Affymetrix斑马鱼基因芯片进行分析。Weber等人，106Blood 521-30(2005)。
定量PCR
qPCR使用先前描述的引物组来进行。Burns等人，19Genet Devel. 2331-42(2005)。胚胎(n＝50)如所述的进行处理。qPCR(60℃退火) 使用SYBR Green Supermix在iQ5Multicolor RTPCR Detection System (BioRad)(n＝10次重复)上进行，并且测定相对表达水平。关于EP2 和EP4的引物对通过本领域众所周知的方法进行测定。全KM RNA (n＝15/变量)的qPCR如所述的在照射后第3天时进行。Burns等人， 19Genes Devel.2331-42(2005)。关于S细胞RNA的qPCR(在Stat-60 中收获的，Tel-Test)使用Stratagene Sybrgreen试剂盒在Stratagene qPCR 机器上进行。PG引物序列通过本领域众所周知的方法进行测定。
质谱法
PGE2和稳定的PGI2代谢物6-酮-PGF1α使用HPLC串联质谱分析法 进行测量。来自匀浆胚胎的乙酸乙酯提取物掺加相应的稳定同位素标记 的内标准(d4-PGE2和d4-6-酮PGF1α)，并且允许与甲氧基胺反应。监控 下述质量过渡：m/z 384→272(PGE)，m/z 398→368(6-酮PGF1α和TxB2)。
辐射恢复测定
使成年斑马鱼暴露于23Gyγ-照射。在照射后第2天时，使鱼过夜 暴露于溶于鱼水的DMSO对照、dmPGE2(10或50μM)、吲哚美辛 (10μM)、SC560(10μM)或NS398(10μM)。对在第0、2、4、7、 10、14天时分离的全KM实施F SC/SSC FACS分析，以鉴定造血谱系 (n＝5/处理x3次重复)。Traver等人，104Blood 12980305(2004)。
ES细胞分化测定
ES细胞造血分化测定如先前所述的进行。Kyba等人100(1) P.N.A.S.USA 11904-10(2003)；Wang等人，102P.N.A.S.USA 19081-86 (2005)。dmPGE2(10、20或100μM)或吲哚美辛(20、100μM) 在EB扩增期间在第4天和第5天时添加。M3434甲基纤维素集落形 成和OP9集落测定在第6天时进行，并且分别在第8和5天时进行分 析。集落类型通过形态学分析进行鉴定；求一式两份的化学暴露的平 均值以确定报道的集落数目(n＝最低限度3次重复)。
鼠集落形成单位-脾(CFU-S)
使来自8周龄C57Bl/6小鼠的股的WBM细胞与(1μM/106个细胞) dmPGE2、吲哚美辛、SC560、NS398或EtOH对照一起在冰上先体外 后体内温育2小时。对于每个变量处理2个独立的BM样品(n＝5/处 理x 2次重复)。受体小鼠用分离剂量的10Gy进行致死照射。将6x104未分级分离的dmPGE2或对照处理的BM细胞眶后注射入受照射的受 体小鼠内。脾在第8或12天时解剖，称重并且用Bouin氏溶液进行固 定；计数造血集落/脾。1x105细胞/受体在用cox抑制剂处理后进行移 植。FACS分选的ckit+sca1+谱系-BM细胞如上所述进行处理，并且以 100个细胞/受体或300个细胞/受体的剂量进行移植。
5-氟尿嘧啶骨髓损害
小鼠如所述的用5-FU(150mg/kg)进行处理。Venezia等人，2004。 SC560、NS398、dmPGE2(1mg/kg)或EtOH对照在注射后第1、5、9、 13和17天时通过IP注射进行施用。外周血在第7天和第14天时获得， 定量且使用针对B220/IgM(B-淋巴样)、CD4/8(T-淋巴样)、Mac1/Gr1 (髓样)、Ter119/CD71(类红细胞)和ckit/sca1(干/祖先)的抗体 (eBioscience)实施多谱系FACS分析。小鼠在第16天时处死，并且 分离骨髓、定量且通过FACS进行分析。
有限稀释竞争移植
使来自CD45.1C57Bl/6小鼠的WBM如所述的与dmPGE2或EtOH 对照一起先体外后体内温育。处理的测试细胞以下述比独立地移植到 具有未处理的CD45.1/CD45.2竞争者的受照射的CD45.2受体(n＝5/ 变量x2)内：15,000∶200,000(0.075∶1)、50,000∶200,000(0.25∶ 1)、200,000∶200,000(1∶1)、2,000,000∶200,000(10∶1)。外周 血(PB)在移植后6、12和24周时获得，并且白细胞进行FACS分析 以测定关于每个系列的处理群体的测试重构。PB嵌合状态＞5％的频率 用于使用L-Calc程序(Stem Cell Technologies)计算再增殖细胞的数 目。对于12周和24周PB样品，多谱系重构通过如上文的FACS分析 进行测量。
实施例2.另外的HSC调节剂。
斑马鱼胚胎如上所述进行筛选。通过本文描述的技术鉴定且由本 发明包含的另一组HSC改性剂是cAMP/P13K/AKT第二信使改性剂， 这可以是PG信号传导的下游。抑制HSC的那些包括PD9805、KT5720、 H89、U0126和渥曼青霉素。增强HSC的那些包括8-溴-cAMP和毛喉 素。
也可能作用于PG信号传导下游的另一组HSC改性剂是Ca2+第二 信使改性剂。这些包括表9中列出的HSC抑制剂和HSC增强剂：
表9.示例Ca2+第二信使改性剂
HSC抑制剂 HSC增强剂 BayK 8644 Bapta-AM 硫利哒嗪 芬地林 尼卡地平 匹莫齐特 毒毛旋花子苷原 毛花苷
通过本文描述的筛选技术鉴定且由本发明包含的另一组HSC改性 剂是NO/血管紧张素信号传导改性剂，这可以与PG和wnt信号传导相 互作用。这些包括表10中列出的HSC抑制剂和HSC增强剂：
表10.示例NO/血管紧张素信号传导改性剂
HSC抑制剂 HSC增强剂 L-NAME L-Arg 依那普利 硝普钠 卡托普利 钒酸钠 AcSDKP 缓激肽
氯沙坦 Telimasartan 组胺 氨溴索 白杨黄素 环己酰亚胺 亚甲蓝 肾上腺素 地塞米松 普罗地芬 异硫氰酸苄酯 麻黄碱
还应用本发明的斑马鱼筛选方法以鉴定其与PH或wnt信号传导的 相互作用目前不清楚的其他HSC调节剂。也由本发明包含的这些化合 物包括如表11中所示的抑制或增强HSCs的那些：
表11.示例HSC调节剂
HSC抑制剂 HSC增强剂 Paragyline 美贝维林 普萘洛尔 丙酮缩氟氢羟龙 依地硝唑 阿替洛尔 甲硫咪唑 吲哚洛尔 西诺沙星 加波沙朵 青霉胺 犬尿烯酸 呋塞米 肼屈嗪 Eburnamininone 噻苯达唑 阿柔比星 比枯枯灵碱 华法林 Vesamicol γ-氨基丁酸 黄夹次苷 炔诺酮 丙咪嗪 鹰爪豆碱 氯磺丙脲
二氢奎尼丁 1，5-亚戊基四唑 乙肼苯哒嗪 4-氨基吡啶 甲氧明 二氮嗪 羟基脲 苯磷硫胺 双氢麦角胺 12-甲氧基十二碳烯酸 安他唑林 N-甲酰基-Met-Leu-Phe 3-硝基丙酸 加拉碘铵 N-苯氨茴酸 IAA 94 非那吡啶 氯烯雌醚 二氯犬尿烯酸 3-雌二醇 L-Leu 酚苄明 美芬丁胺 四氢烟酸 愈创兰油烃 咪唑 β-胡萝卜素 氯苯丁酯