技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于治疗老年性白血病的组合 物。
背景技术
老年性白血病，一般指年愈60岁的白血病患者与其他年龄组白血病一 样，是一种病因不明的原发于造血干细胞的恶性疾病，是衰老的造血微环境 与白血病干细胞共同作用的结果。老年白血病多数缓慢起病，逐步进展，以 乏力、面色苍白、食欲不佳、劳动后气急等为主。老年人白血病是全世界治 疗难题，迄今没有行之有效的治疗方案。传统化疗/辐射疗法和造血干细胞移 植是治疗老年白血病的常用技术。
经典化疗/辐射疗法是治疗多种肿瘤的常规治疗技术。化疗/辐射疗法的 原理很简单，就是直接杀死患者肿瘤细胞。对于诸多实体瘤，局部化疗/辐射 疗法的治疗法案应用广泛，效果较佳。然而，血液系统遍布全身，因此无法 通过上述方案杀死血液肿瘤细胞。经典化疗/辐射疗法在杀死肿瘤细胞的同时 也破坏患者体内正常的细胞，产生严重的毒副作用。针对肿瘤细胞的靶向化 疗被证明非常有效，但是仅仅局限于如CML的少数肿瘤类型。有效剂量化 疗老年患者难以承受，亚剂量、低剂量化疗治疗老年白血病难以有效杀死白 血病细胞。因此，化疗/辐射疗法的严重副作用，不适合于老年白血病患者。
干细胞疗法是治疗诸多恶性血液肿瘤、免疫缺陷、自身免疫等疾病的重 要途径。治疗用的干细胞类型有多种，但当前应用最广的是各种类型的成体 干细胞，如造血干细胞、间充质干细胞等。干细胞疗法的工作原理是部分或 者完全重建因疾病、损伤、衰老等因素而失去正常功能的组织与器官、甚至 某个系统。造血干细胞移植是最早应用于临床、能够彻底治愈部分血液疾病 的干细胞疗法。造血干细胞疗法将造血干细胞植入患者体内，能够归巢到骨 髓定居，进行自我更新，并且增殖产生所有成熟造血细胞，最终重建整个造 血系统。因此，在结合化疗等预处理方案清除患者体内的肿瘤细胞后，移植 自体来源或者配型合适的异体来源造血干细胞，可以重建造血及免疫系统， 彻底治愈部分血液病。由于造血干细胞移植需要对患者进行化疗等预处理才 能实现成功植入，这个预处理过程对老年患者几乎无法承受。此外，由于衰 老原因，造血干细胞移植本身就很难成功植入老年患者，主要原因是老年人 骨髓微环境老化，以及整个造血支持系统的老化。当前，造血干细胞移植受 到造血干细胞来源短缺、移植排斥等问题局限。因此，一种折中途径就是降 低供体造血干细胞的配型要求，达到植入和造血重建，结合间充质干细胞疗 法抑制移植物抗宿主的免疫排斥(GVHD)。这种折中方案适合儿童和青壮年， 但因患者身体条件，不适合老年患者。总之，由于老年患者难以承受移植前 的预处理，并且衰老的造血微环境导致很难植入供体造血干细胞。因此，造 血干细胞移植在治疗老年白血病方面受到局限，迄今成功甚少，亟需寻求一 种用于治疗老年性白血病的方法或药物。
发明内容
有鉴于此，本发明大量实验以期找到一种药物组合，实现衰老骨髓微环 境年轻化，成功压制老年白血病肿瘤细胞，能够在一定时期内恢复造血稳态， 提高了患者生活质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下方案：一种用于治疗老年性白 血病的组合物，包括：
年轻的骨髓间质干细胞、维生素C以及用于维持年轻骨髓间质干细胞生 理活性的生理盐水。
作为优选，年轻骨髓间质干细胞浓度为4-6×106个/ml。
更优选地，年轻骨髓间质干细胞浓度为5×106个/ml。
作为优选，维生素C浓度为40-60μg/ml。
更优选地，维生素C浓度为50μg/ml。
作为优选，所述骨髓间质干细胞为间充质干细胞与骨髓内皮细胞的组合。
更优选地，所述间充质干细胞与骨髓内皮细胞的比例为90-99:1:10。
在本发明的实施例中，所述间充质干细胞与骨髓内皮细胞的比例为99:1。
更优选地，年轻的骨髓间质干细胞使用剂量为0.5-1.5×107cells/kg。 推荐的使用方式是髓腔内注射。
本发明还提供所述组合物在用于制备治疗老年性白血病的用途。
本发明实现老年白血病动物长期带病生存，长期实现老年白血病病理缓 解、延长患者生命的创新技术。采用本发明所述药物组合物定期输注还可以 完全控制疾病的发展，大大延长患者寿命，没有化疗和预处理出现的毒副作 用。
本发明所述组合物应用于治疗老年人骨髓增生异常疾病，以及其他普通 髓系增生性疾病的缓解辅助治疗，没有毒副作用，有效缓解患者症状，实现 长期带病生存，提高生存质量，延长患者寿命，具有良好的应用前景。
术语与定义
年轻的骨髓间质干细胞：取自6月内健康小鼠、大鼠骨髓间质干细胞，或者 30岁以下健康人骨髓间质干细胞，原代培养可以传代6代以内的细胞。
附图说明
图1.YBMSC免疫表型鉴定；
(A)YBMSC分离及培养不同代次显微镜照片；
(B)流式分析表明YBMSC的免疫表型为CD31-，CD45-，Ter119-，PDGFRa+， PDGFRb+，CD51+，CD105+。
图2老年骨髓增生异常疾病模型参数鉴定；
图3输注YBMSC有效缓解老年骨髓增生异常。
具体实施方式
本发明公开了一种用于治疗老年性白血病的组合物，本领域技术人员可 以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能 在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适 当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述骨髓间质干细胞，可以按照下述实施例自行制备，也可购自 市场。如实施例1中自行制备的年轻骨髓间质干细胞，可购自Cyagene,货号 MUBMX-01001。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1年轻骨髓间质干细胞的分离培养
(1)Day0，安乐死小鼠，取出小鼠(6个月以内)的4条腿放在6cm 培养皿中，把肉尽可能剥离干净，用含有10x双抗的DPBS依次洗3次后放 在室温的DMEM:F12中(有文献提到室温比放置在冰上更好)，使用5ml 注射器用DMEM:F12将骨髓尽可能吹干净，将骨髓用70um滤网过滤，收集 骨头和滤网上的碎骨片，放在预先加入1.5mlDMEM:F12培养基的六孔板的 一个孔中，用剪刀把骨头尽可能剪碎，再加入1.5ml配好的胶原酶II(在避 光的1.5mlEP管中，已经用DMEM：F12配好)，这样胶原酶II的终浓度 为1mg/ml，用1ml移液器将剪碎的骨片吹散，均匀扑满整个孔，小心放入培 养箱中37℃消化1-2h(文献中是用带有摇床的培养箱消化，静置消化1.5-2h 效果也可以)。消化完成后将消化液吸弃，用DMEM：F12洗3次，加入3ml DMEM：F12+10％FBS(Gibico)完全培养基放置在37℃培养箱培养3d(尽 可能放置在里面角落里，以保证3d期间不要挪动它)。
(2)Day3，将培养基吸弃，骨片转移到另一个新孔再培养3d，洗掉培 养基和骨片的孔用F12洗3遍，换3ml新的完全培养基继续培养6d(第三 天已经可以看到在骨片下面及周围有许多MSC细胞爬出)。
(3)Day6，换液，吸弃培养基，加入3ml新的完全培养基。
(4)Day9，传代，吸弃培养基，用DMEM：F12洗一遍，加入0.5ml0.25％ 胰酶37℃消化2.5min，镜下看到大部分细胞变圆或已开始浮起，加入2ml完 全培养基终止消化，用1ml移液器小心将细胞吹打下来，转移到15ml离心 管，室温，250g，5min离心。用2ml完全培养基重悬细胞沉淀，平分到2 个6cm培养皿中，每个培养皿加6ml完全培养基，此时为P1代。
(5)依细胞密度每2-3天换液一次，每6-7天按照1:3-1:4比例传代一次。 不同代次YBMSC进行显微镜观察拍照(图1A)，YBMSC：bonemarrowderived stromacell骨髓源基质细胞。
(6)YBMSC表型鉴定一
(CD45/TER119/CD31-PDGFRα/β+CD105+CD51+)
(a)取培养至P3代的细胞，经0.25％胰酶消化成单细胞，用DPBS洗一遍， 用200ul2％FBS/DPBS重悬细胞。b.加入1ulFcblockerCD16/32(1:200)， 冰上，孵育15min。
(b)4℃，500g，5min离心，500ul2％FBS/DPBS重悬细胞，分成5管， 100ul/tube，分别加入以下抗体：
100ul→unstain
100ul→tube1+0.5ulanti-PDGFRα-biotin(1:200)
100ul→tube2+0.5ulanti-PDGFRβ-biotin(1:200)
100ul→tube3+0.5ulantiCD105-biotin(1:200)
100ul→tube4+0.5ulanti-CD51-biotin(1:200)
冰上，孵育15min。
(c)分别加入以下对应抗体：
100ul→tube1+0.5ulstreptivin-anti-FITC
+0.5ulanti-CD45-APC(1:200)，
+0.5ulanti-Ter119-APC(1:200)，
+1ulanti-CD31-APC(1:100)，
100ul→tube2+0.5ulstreptivin-anti-FITC
100ul→tube3+0.5ulstreptivin-anti-FITC
100ul→tube4+0.5ulstreptivin-anti-FITC
冰上，孵育15min，避光。
(d)4℃，500g，5min离心，350ul含DAPI(1:400)的2％FBS/DPBS 重悬细胞，使用流式检测表明YBMSC的免疫表型为CD31-，CD45-，Ter119-， PDGFRa+，PDGFRb+，CD51+，CD105+，是典型的间质细胞特征(图1B)。
实施例2.老年骨髓增生异常模型建立
为了评估YBMSC治疗老年骨髓增生的效果，首先建立老年骨髓增生异 常模型。将含有白血病基因修饰的造血干细胞移植到自然衰老小鼠，构建骨 髓微环境自然衰老的老年骨髓增生小鼠模型。该模型小鼠外周血骨髓单核细 胞在12-24周比野生对照组显著提高(图2A)，并且生存曲线表明大量小鼠会 发病死亡(图2B)，发病鼠的表型跟老年骨髓增生一致。
选择自然衰老的小鼠，进行亚致死剂量照射，然后植入经过白血病基因 修饰的造血干细胞。移植后12-24周，小鼠集中发病(图2A)，平均死亡时间 为移植后159天(图2B)，P<0.0001，n＝32。
实施例3年轻骨髓间质干细胞移植治疗老年骨髓增生
选取老年白血病动物模型，发病标准是外周血髓系单核细胞百分比 (Mac1+)超过60％。将组合物(年轻骨髓间质干细胞(YBMSC)及维生素C以 及用于维持年轻骨髓间质干细胞生理活性的生理盐水)以1×107cells/kg的 剂量移植老年白血病动物模型。
其中年轻骨髓间质干细胞浓度为5×106个/ml，间充质干细胞与骨髓内 皮细胞的比例为99:1，维生素C浓度为50μg/ml。一次YBMSC输注剂量为 1×107cells/kg，骨髓腔内注射。每隔一个月输注一次YBMSC。每个月检测 外周血单核细胞(Mac1+)细胞百分比。
Y轴为外周血单核细胞流式分析占整个外周血有核细胞百分比(Mac1+)。 X轴为输注YBMSC后检测时间点。黑色箭头表示输注YBMSC的时间点。 图3显示了三只代表性患者治疗结果。
如图3所示，三个代表性的老年骨髓增生症患者模型YBMSC移植后四 个月内连续流式分析结果表明，外周血肿瘤细胞负荷持续下降，病情持续缓 解，小鼠健康状态良好，不再出现弓背、皮肤炎症、食欲不振、消瘦等现象， YBMSC治疗期小鼠也实现长期带病生存。
发明人通过大量动物试验(n>100)，证实(0.5-1.5)×107cells/kg 注射剂量的年轻骨髓间质干细胞、40-60μg/ml的维生素C以及用于维持年轻 骨髓间质干细胞生理活性的生理盐水的组合物，均能达到外周血肿瘤细胞负 荷持续下降，病情持续缓解，小鼠健康状态良好，实现长期带病生存的效果。 加40-60μg/ml的维生素C的实验组与不加维生素C的对照组治疗效果差别 具有统计学意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。