技术领域
本发明涉及一种药品的新用途，尤其是一种蜈蚣蛆虫蛋白质在制备抗肾癌药品中的应用。
背景技术
肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌。肾腺癌在泌尿科肿瘤中发病率占第二位，仅次于膀胱肿瘤。
中医病因认为，本症的病位在肾，涉及肝、脾、下焦，主要病机为肾亏毒瘀，属本虚标实之症。
流行病学调查结果显示，吸烟、肥胖、职业、高血压、糖尿病、放射线、药物、食物及遗传等因素与肾癌的发病有关。
现在治疗采用外科手术、放射治疗、化学治疗、免疫治疗。中医将肾癌划分为三种类型：肾亏瘀毒型、温热瘀毒型、气血双亏型，对症分型治疗。
CN103211837A公开了三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用。该发明是三氧化二砷的一种新用途，认为三氧化二砷通过抑制PI3K-Akt转导途径来抑制人肾癌细胞786-0增值，可以作为药物原料制备治疗肾癌的药品。
CN102964425A公开了多西紫杉醇与胞壁酰二肽简化物的共缀物及抗肿瘤作用。该发明描述了一种双功能共缀物的化学合成及抗肿瘤作用，以固相合成的液相合成的方法合成了多西紫杉醇与胞壁酰二肽简化物的共缀物，并通过实验表明该类化合物具有抗肿瘤作用。
CN102971337A公开了一种治疗肿瘤的中药制剂，该中药制剂由牛黄、元参、天花粉、柴胡、茵陈、砂仁、木香、车前子、陈皮、红花、桃仁、丹参、元胡、羚羊角、山茱萸、山药、何首乌、当归、甘草、半枝莲、人参、黄芪等28种中草药组成，按一定重量配比制备而成。
CN103304635A公开了一种环肽化合物抗肿瘤的应用及其制备方法。该发明涉及环肽类化合物的制备方法，以发酵法生成产物并进行分离得到具有活性的环肽类化合物。
上述由植物组成的中药制剂都可以用于抗肾癌药品的制备，但是由于前述的几个药方中药物繁多，每种中草药由于种植区域、气候、品种、采收时间、炮制及加工方法的差异，在工业化生产中难于保证产品的一致性，也难于控制质量。
201210178608.4公开了人工培殖蜈蚣蛆虫的方法，该发明以蜈蚣等为原料，经多步骤定向培殖蜈蚣蛆虫，培殖过程可控，适合工业化生产，培殖的蜈蚣蛆虫消除了蜈蚣具有的毒性，该虫体机体成分具有较高的生物活性。
上述由原植物组成的中药制剂都可以用于抗食管癌药品制备，但是由于前述的几个药方中药物繁多，每种中草药由于种植区域、气候、品种、采收时间、炮制及加工方法的差异，在工业化生产中难于保证产品的一致性，也难于控制质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜈蚣蛆虫蛋白质在制备抗肾癌药品中的应用，采用蜈蚣蛆虫为原料，通过一系列的工艺条件分离纯化成为蜈蚣蛆虫蛋白质，制备成八项给药系统，具有药效高、一致性好的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
（1）将1000g蜈蚣蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X）中常温条件下膨化粉碎。
本步骤中，所述膨化压力为0.1~5MPa，时间为10~60min。
（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出蜈蚣蛆虫蛋白质粗品。
本步骤中，所述膨胀溶剂由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3·H2O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成。
本步骤中，所述提取温度为10~20℃，时间为10~30min。
（3）收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0.5~50μm。
（4）用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液。
本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
（5）超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
本步骤中，所述溶剂为乙腈。
（6）将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化。
本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）组成或4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）组成。
（7）纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为-30~50℃、时间为18~26h。
（8）赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服靶向给药系统等，可用于制备抗肾癌药品。
本技术方案中分离的纯化蜈蚣蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10.6~11.8KPa；用等电聚焦发测定其等电点为pH8.9~9.6；常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的蜈蚣蛆虫蛋白质含量为98.2%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
（1）将1000g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆虫被膨化成粉体；
（2）膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3·H2O，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3·H2O的混合液；
（3）收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0.5~50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；
（4）溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0.3~0.8MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液；
（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加0.02~0.1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速1~10mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；
（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；
（7）纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18~26h干燥制备成冻干蛋白粉。
实施例2：
（1）将1000g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆虫被膨化成粉体；
（2）膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3·H2O，加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度15℃，时间20min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3·H2O的混合液；
（3）收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；
（4）溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0.5MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液；
（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0.05%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；
（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率1.0KW，频率500KHz，流速200mL/min，紫外检测器波长260nm；
（7）纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40℃、时间20h干燥制备成冻干蛋白粉。
实施例3：
（1）将1000g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆虫被膨化成粉体；
（2）膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液；
（3）收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0.5~50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；
（4）溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0.3~0.8MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液；
（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加0.02~0.1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速1~10mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；
（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；
（7）纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18~26h干燥制备成冻干蛋白粉。
实施例4：
（1）将1000g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆虫被膨化成粉体；
（2）膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度20℃，时间10min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液；
（3）收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；
（4）溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0.5MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液；
（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0.08%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速8mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；
（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率2.0KW，频率1000KHz，流速300mL/min，紫外检测器波长280nm；
（7）纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18h干燥制备成冻干蛋白粉。
实施例5：
脂质体注射剂制备：
（1）1mol磷脂酰丝氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入1000~3000L生理盐水水合处理，再用超声波在频率500~2000KHz、功率0.01~5KW处理1~5min。
（2）取上述溶液1~100mL加入到含量0.001~0.01mol/L的0.1~1000mLCaCl2溶液中，在转速30~75r/min条件下搅拌10~30min，然后在25~50℃条件下静置30~120min。
（3）将生成物放置离心机中，在转速1500~3000r/min离心分离5~30min，将离心物从离心机中取出后加入2~50g蜈蚣蛆虫蛋白质混合均匀，在10~25℃条件下静置10~120min。
（4）上述物体加入含有0.01~10mol/L的乙二胺四乙酸的生理盐水溶液0.1~10L中，混合均匀静置30~180min，得到单层脂质体。
（5）取1~10mg单层脂质体与10~200mL生理盐水溶液混合，制备成为注射剂。
实施例6：
脂质体注射剂制备：
（1）1mol磷脂酰丝氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入2000L生理盐水水合处理，再用超声波在频率1000KHz、功率2KW处理5min。
（2）取上述溶液50mL加入到含量0.005mol/L的1000mLCaCl2溶液中，在转速45r/min条件下搅拌30min，然后在30℃条件下静置60min。
（3）将生成物放置离心机中，在转速2000r/min离心分离20min，将离心物从离心机中取出后加入20g蜈蚣蛆虫蛋白质混合均匀，在15℃条件下静置60min。
（4）上述物体加入含有1mol/L的乙二胺四乙酸的生理盐水溶液5L中，混合均匀静置80min，得到单层脂质体。
（5）取5mg单层脂质体与100mL生理盐水溶液混合，制备成为注射剂。
实施例7：
肠溶胶囊的制备：
取10~100g蜈蚣蛆虫蛋白质、500~2000g预凝胶淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为蜈蚣蛆虫蛋白质肠溶胶囊。
实施例8：
肠溶胶囊的制备：
取50g蜈蚣蛆虫蛋白质、1000g预凝胶淀粉及30g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为蜈蚣蛆虫蛋白质肠溶胶囊。
实施例9：
蜈蚣蛆虫蛋白质磁性微球的制备：
取蜈蚣蛆虫蛋白质30g及极细的磁铁粒子（直径20~50nm）70g，加10~20L水使之混悬，将此混悬液加至60L棉籽油中，在4~10℃条件下用功率100~1000W、频率500~1000KHz超声波处理1~10min，制成W/O型乳剂；将乳剂滴加于10~25℃、1000~1500r/min搅拌状态的100L棉籽油中，搅拌10~30min，混悬于60~100L乙醚中，加含有0.2~0.5mol/L甲醛的乙醚溶液为交联剂，以1000~1500r/min搅拌10~60min，然后分次加10~100L乙醚洗脱掉过量的交联剂，2000~3500r/min离心脱去溶剂；冷冻干燥，时间10~20h，温度-30~50℃，成为冻干蜈蚣蛆虫蛋白质磁性微球。
实施例10：
蜈蚣蛆虫蛋白质磁性微球的制备：
取蜈蚣蛆虫蛋白质30g及极细的磁铁粒子（直径30nm）70g，加15L水使之混悬，将此混悬液加至60L棉籽油中，在5℃条件下用功率500W、频率800KHz超声波处理5min，制成W/O型乳剂；将乳剂滴加于20℃、1200r/min搅拌状态的100L棉籽油中，搅拌20min，混悬于80L乙醚中，加含有0.4mol/L甲醛的乙醚溶液为交联剂，以1200r/min搅拌30min，然后分次加50L乙醚洗脱掉过量的交联剂，2500r/min离心脱去溶剂；冷冻干燥，时间15h，温度40℃，成为冻干蜈蚣蛆虫蛋白质磁性微球。
实施例11：
国际抗癌联盟（VICC）对肾癌的TNM分类：
（1）原发肿瘤（T）分期：Tx原发肿瘤不能评估；T0原发肿瘤大小部位不详；Tis原位癌；T1肿瘤浸润食道粘膜层或粘膜下层；T2肿瘤浸润食管肌层；T3肿瘤浸润食管外膜；T4肿瘤侵犯食管邻近结构。
（2）区域淋巴结（N）分期：Nx区域淋巴结不能评估；N0区域淋巴结无转移；N1区域淋巴结有转移。
（3）远处转移（M）分期：Mx远处转移情况不详；M0无远处转移；M1有远处转移。
治疗方法：
（1）局部注射脂质体药剂，按体重70Kg计，每次300~350μg，每天2次；
（2）口服磁性微球药剂，按体重70Kg计，每次3g，每天2次，外界磁场强度2000~3000Gs；
（3）口服肠溶胶囊，按体重70Kg计，每次2粒，每天2次。
治疗结果分级标准：
、近期疗效（40天末与治疗前比较）
（1）完全缓解：病灶完全消失，无新的病灶出现；
（2）部分缓解：病灶缩小到治疗前的50%或更小，无新的病灶出现，多灶性病变时没有一个病灶增大；
（3）稳定期：轻度缓解：病灶缩小面积30%或增大面积25%，自觉症状改善，体力基本状况上升；基本稳定：病灶缩小不到25%或增大面积不超过25%以上，自觉症状改善，体力基本状况上升。
（4）扩展：单个面积或多个病灶总面积比治疗前增大25%以上或出现新的病变，临床症状加重，体力基本状况下降。
、中期疗效（7周~1年）
（1）完全缓解：无瘤生存；
（2）部分缓解：癌体回变到治疗前的面积50%以上，或出现新的病灶；癌体无增大或缩小，病症改善或消失；体力基本状况上升。
（3）转移或扩展：病原灶扩大发展，出现新的转移灶，临床症状加重，体力状况下降。
、远期疗效（1~5年）
（1）无瘤生存；
（2）带瘤生存；
（3）死亡。
治疗结果：