异甘草甙的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101543214 B (45)授权公告日 2012.06.27 CN 101543214 B *CN101543214B* (21)申请号 200910038353.X (22)申请日 2009.03.31 A01N 43/16(2006.01) A01P 3/00(2006.01) (73)专利权人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 罗建军 胡美英 钟国华 郝卫宁 曾勇 林庆胜 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 任重 WO 2009010567 A2,2009.0。

2、1.22, 说明书第 7 页实施例 2. 薛伟等 . 抗菌植物的研究新进展 .农 药 .2005, 第 44 卷 ( 第 6 期 ),241-246. (54) 发明名称 异甘草甙的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种异甘草甙的应用， 具体 应用于防治植物病害。通过室内生物测定和盆 栽试验， 本发明提供了甘草甲醇提取物中活性 成 分 异 甘 草 甙 (isoliquiritin) 对 霜 疫 霉 属 (Peronophythora Chen)、 疫霉属 (Phytophthora capsici Leonian)、芽 枝 霉 属 (Cladosporium LK.exFr)、 核盘菌属 (S。

3、clerotinia)、 炭疽菌属 (Colletotrichum Corda)等属的常见植物病害良 好的防治应用。本发明对甘草及其提取物用于防 治植物病害的新用途提出了新的思路， 为植物替 代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源， 对解决 病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意 义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴斌 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 异甘草甙作为唯一活性成分在防治植物病害方面的应用， 其特征在于所述植物病害 包括霜疫霉属、 芽枝霉属、 核。

4、盘菌属和 / 或炭疽菌属植物病害。 2. 异甘草甙作为唯一活性成分在防治植物病害方面的应用， 其特征在于所述异甘草甙 以 400g/mL 的浓度应用于防治辣椒疫霉病。 权 利 要 求 书 CN 101543214 B 2 1/6 页 3 异甘草甙的应用 技术领域 0001 本发明属于植物杀菌剂技术领域， 具体涉及一种甘草提取物中有效成分异甘草甙 在防治植物病害中的新用途。 背景技术 0002 近年来， 随着植物病理学、 生物学等相关学科的不断发展， 农药中杀菌剂的研究已 进入了一个崭新的时期。高效内吸性杀菌剂如 Strobilurn 类杀菌剂的出现， 一方面使植物 病害的防治获得了突破性进展，。

5、 另一方面也造成病原菌对药剂的抗性问题日益突出。寻求 对环境相容性好， 对病原菌具有持久效果的无公害农药， 在绿色食品日益被重视的今天显 得格外重要。 0003 天然产物常表现出许多生物活性， 数百年来广为人们所用。 其中， 植物源杀菌活性 成分的研究和开发是解决当前化学杀菌剂诸多负面效应的一个重要研究方向。 0004 植物是生物活性化合物的巨大天然宝库， 其产生的次生代谢产物超过 400000 种， 据报道， 现在地球上的 35 万多种植物中， 约有 2400 种植物具有控制有害生物的活性。多年 以来， 国内外科研工作者对多种植物如楝科 Meliacea 植物中米仔兰属 Aglaia 植物、。

6、 樟科 Lauraceae 植物印度鳄梨 Persea indica、 天南星科 Araceae、 植物菖蒲等进行了杀虫物质 的研究， 而植物源抑菌、 杀菌活性物质的研究相对较少， 实际上据报道有 1389 种植物有可 能作为杀菌剂， 植物中的抗毒素、 类黄酮、 罹病相关的蛋白质、 有机酸和酚类化合物等均有 杀菌和抗菌活性。植物源杀菌物质大多为复合的抑菌有效成分， 且具有多种作用位点和作 用机制， 因而植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。 0005 甘草是豆科甘草属植物， 其根和根茎是最常用的中药， 主产于内蒙古和新疆维吾 尔自治区， 除用作药品外， 还广泛用在食品、 酿造和化妆品。

7、工业上， 有着越来越广的应用前 景。近些年， 甘草的活性研究已成为关注的焦点。在临床医学上， 该属植物广泛用于抗炎、 镇痛、 镇咳、 抗溃疡、 抗肝炎、 解毒、 治疗内分泌系统疾病等方面， 即具有抗肿瘤作用、 抗炎及 抗变态反应作用、 抗病原微生物作用、 免疫调节作用等功效， 作为抗病原微生物药物还可以 应用在食品的保鲜防腐方面。 0006 在甘草属植物中， 人们已对乌拉尔甘草、 胀果甘草、 光果甘草、 黄甘草、 粗毛甘草等 进行了化学成分的研究， 如不同种、 同种不同产地、 植株不同部位、 不同组织结构中甘草次 酸 (Clycyrrhetinic aci) 含量的对比。实际上， 从甘草属植物。

8、中已分离出约 170 余种化合 物， 其主要化合物是黄酮类和三萜类化合物， 还有少量的生物碱， 木质素， 香豆素和多种氨 基酸 ； 在研究的成分种类上， 主要有甘草甜素 (Glycyrrhizin)、 甘草多糖类 (Glycyrrhiza polpsacchride)、 甘草黄酮类 (Glycyrrhizaflavonoides)， 分别研究了它们的性质及用途。 0007 甘草的杀菌活性可见于医学上的报道， 而关于甘草提取物对植物病原菌的抑菌活 性未见报道， 尤其是对甘草中具体是哪一种活性成份具有杀菌活性未见有技术报道。 0008 研究甘草提取物对植物病原菌的抑菌活性， 将甘草提取物质应用到植。

9、物病害的防 治上， 对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。而具体研究甘草提取物 说 明 书 CN 101543214 B 3 2/6 页 4 中活性成分对植物病原菌的抑菌活性将可以提高防治的针对性和提高防治效率， 具有重要 的应用前景， 目前没有见到相关技术报道。 发明内容 0009 本发明的目的是克服植物杀菌剂技术的不足， 提供甘草提取物活性成分异甘草甙 在杀菌方面的新应用。 0010 本发明的目的通过以下技术方案来予以实现 ： 0011 提供异甘草甙 (isoliquiritin) 在防治植物病害中的应用。 0012 所述异甘草甙 (isoliquiritin) 为为甘草甲醇。

10、提取物中活性成分。 0013 所述异甘草甙 (isoliquiritin) 的制备方法是采集甘草全株， 优选甘草根， 置于 50电热恒温鼓风干燥箱中烘干 ； 粉碎机粉碎， 过 40 目筛， 所得甘草粉用密封袋密封避光 处保存备提取用。采用现有常规技术对甘草粉粉进行提取。甘草粉甲醇提取物再进行活性 成份的分离、 提纯以及结构鉴定确认活性成分为异甘草甙 (isoliquiritin)。 0014 将异甘草甙 (isoliquiritin) 配制成一定浓度的供试药液， 采用菌丝生长 速率法、 孢子囊芽管萌发法、 离体叶片法对霜疫霉属 (Peronophythora Chen)、 疫霉属 (Phyto。

11、phthora capsici Leonian)、 芽 枝 霉 属 (Cladosporium LK.ex Fr)、 核 盘 菌 属 (Sclerotinia)、 炭疽菌属 (Colletotrichum Corda) 等属的常见植物病害进行了室内毒力 测定并进行了温室盆栽试验。试验结果表明， 异甘草甙 (isoliquiritin) 对供试病原菌具 有良好的抑制效果， 可以开发其在防治植物病害中的新用途。 0015 作为一个优选方案， 本发明提供了所述异甘草甙 (isoliquiritin) 以 400g/mL 的干粉浓度应用于防治辣椒辣椒疫霉病。 0016 本发明的有益效果是 ： 0017。

12、 本发明突破传统的甘草仅应用于医药学的限制， 对甘草的应用提出了新的思路， 并确定了甘草提取物活性成分异甘草甙 (isoliquiritin) 用于防治植物病害的技术方案。 为植物替代化学合成杀菌剂提供了新的开发资源， 对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问 题具有重要的意义。 具体实施方式 0018 下面结合具体的实施例来进一步详细说明本发明， 但本发明的内容并不局限于 此。 0019 实施例 1 异甘草甙 (isoliquiritin) 的制备 0020 采集甘草根， 置于 50电热恒温鼓风干燥箱中烘干 ； 粉碎机粉碎， 过 40 目筛。所 得植物粉用密封袋密封避光处保存备提取用。 0021 。

13、本发明采用现有常规的超声波提取法制备甘草提取物， 也可以参用现有的其他 常规技术提取制备。将制备得到的甲醇提取物经分离、 提纯以及结构鉴定得到异甘草甙 (isoliquiritin)。 0022 实施例 2 ： 异甘草甙 (isoliquiritin) 对霜疫霉属 (Peronophythora Chen) 病菌 的抑制作用 0023 用 75甲醇作为溶剂溶解提取物， 然后再与 PDA 培养基配制成带毒培养基， 以菌 说 明 书 CN 101543214 B 4 3/6 页 5 丝生长速率法测定不同浓度提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用。具体操作是 ： 0024 采用菌丝生长速率法 ： 用 。

14、75甲醇作为溶剂将异甘草甙 (isoliquiritin) 配制成 一定浓度的供试药液， 准确吸取 1mL 药液加入到 49mL 融化的 PDA 培养基中 ( 约 50 ) 混合 均匀后倒入灭过菌的培养皿中(直径9cm)， 每瓶均匀倒入3个培养皿中， 配制成所需浓度的 带毒培养基。 以混入相同体积的无菌水或75甲醇做对照。 供试病菌荔枝霜疫霉病菌在直 径 9cm 的培养皿内用约 17mLPDA 培养基培养， 培养 5 天后在菌落边缘菌丝生长旺盛处用打 孔器打取直径为 0.6cm 的菌饼， 分别接种于每个培养皿中央， 有菌丝的一面向下。每个培养 皿放一个菌饼， 每个处理做三个重复， 25培养箱中。

15、培养数天后， 采用十字交叉法测定菌落 直径 (cm)， 按以下公式计算抑菌率， 实验结果见表 1 ： 0025 0026 表 1 异甘草甙 (isoliquiritin) 对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制作用 (7 天 ) 0027 0028 注 ： 1) 表中结果为三次重复的平均值 ； 0029 2) 同一列数据后标有相同字母者表示在 5水平上差异不显著 (DMRT 法 )。 0030 实验表明， 异甘草甙 (isoliquiritin) 对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制率 明显高于处理， 在 10mg/mL、 5mg/mL、 1mg/mL 干粉浓度时抑制率达 89.443、 80.683、 6。

16、3.830， 显示出很强的抑菌作用。实施例 3 ： 异甘草甙 (isoliquiritin) 对霜疫霉属 (Peronophythora Chen) 病菌的抑制作用 0031 采用载玻片法 ( 方中达， 1998) 测定 ： 将在 PDA 培养基上培养 10 天的荔枝霜疫霉 病菌用无菌水洗下孢子囊， 加入药液制备成含各种浓度药液的孢子囊悬浮液， 孢子囊浓度 调整为每视野 (1010 倍 ) 约 40 60 个孢子囊， 取 50L 孢子囊悬浮液滴在载玻片上， 再 将载玻片置于已放一张滤纸的 9cm 培养皿内， 并在滤纸上滴加少量无菌水以保湿， 盖上培 养皿， 置于 28下光照培养 4 小时后观察。

17、孢子囊萌发情况。按下式计算药剂处理的孢子囊 萌发率和药剂对孢子囊萌发的抑制百分率。 0032 0033 说 明 书 CN 101543214 B 5 4/6 页 6 0034 采用载玻片法测定了异甘草甙 (isoliquiritin) 在 1.3、 1.0、 0.7、 0.5、 0.3、 0.15mg/mL 下对荔枝霜疫霉孢子囊芽管萌发的抑制活性。实验结果表明 ： 处理后 4 小时， 显微镜下观察， 随着处理浓度的升高， 孢子囊萌发率相应降低， 抑制率依次为 97.84、 86.45、 67.27、 52.67、 30.21、 13.26， 具体实验结果见表 2。 0035 将平均抑制率值进行。

18、百分率 - 概率转换， 以概率几率值为横坐标， 处理浓度的 对数值为纵坐标， 求取回归曲线， 得到毒力回归方程 y 3.0474x+5.9922， 相关系数 R 0.9288， EC50为 0.47mg/mL， 95置信限 0.45 0.49。 0036 表2异甘草甙(isoliquiritin)对荔枝霜疫霉病菌孢子囊芽管萌发的抑制活性(4 小时 ) 0037 0038 注 ： 1) 表中萌发率、 抑制率结果分别为五次重复的平均值 ； 0039 2) 同一列数据后标有相同字母者表示在 5水平上差异不显著 (DMRT 法 )。 0040 实 施 例 4 ：异 甘 草 甙 (isoliquirit。

19、in) 对 疫 霉 属 (Phytoph thora capsiciLeonian) 病菌的的温室盆栽试验 0041 辣椒疫霉病菌孢子囊液的制备 ： 采用 MSS 溶液法 ( 常彩涛等， 1995) 诱导辣椒疫霉 病菌产生大量孢子囊， 即将在 PSA 上培养 7 天的菌丝块， 接种于含 PS 液体培养基的三角瓶 中， 在 25 27下培养 48 60 小时后， 滤去液体培养基， 用 20mL MSS 液将滤纸上的菌丝 清洗冲回三角瓶， 在 25 27下光照培养 24 小时后， 取培养菌液用于接种辣椒苗上。 0042 试剂配方如下 ： 0043 (1)MSS 液配方 ： 0044 MgSO47H。

20、2O 0.004mol/L 0045 ， KNO3 0.05mol/L 0046 Fe-EDTA 1mL 0047 蒸馏水 1000mL 说 明 书 CN 101543214 B 6 5/6 页 7 0048 (2)Fe-EDTA 的配方 ： 0049 EDTA-Na2 14.86g 0050 FeSO47H2O 24.9g 0051 蒸馏水 1000mL 0052 盆栽试验在塑料大棚中进行。 每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg， 移栽4叶期 健壮辣椒苗。每处理 3 个重复， 每个重复 5 盆， 每盆 4 株。在幼苗长到 4 5 片真叶时， 先喷 药液， 对照喷自来水， 并设甲霜灵对照， 。

21、2h 后喷接制备好的辣椒疫霉病菌孢子囊悬浮液， 并 立即覆盖塑料薄膜保湿 24h。2、 4、 7d 分别观察发病情况， 记录温度， 发病程度一株为单位， 按 0 4 级的分级标准调查 ： 0053 0 级 ： 无病 ； 0054 1 级 ： 1 片叶发病 ； 0055 2 级 ： 2 片叶发病 ； 0056 3 级 ： 3 片叶发病 ； 0057 4 级 ： 4 片以上叶发病或茎受害 0058 0059 0060 实验结果见表 3 所示 ： 0061 表 3 异甘草甙 (isoliquiritin) 对辣椒疫霉病的盆栽防治效果 0062 说 明 书 CN 101543214 B 7 6/6 页。

22、 8 0063 注 ： 1)53雷多米尔处理为稀释 500 倍液 ； 0064 2) 表中数据为 3 次重复的平均值 ； 数据后标有相同字母者表示在 5水平上差异 不显著 (DMRT 法 )。 0065 室内盆栽测试结果显示， 异甘草甙 (isoliquiritin) 对辣椒疫霉病有较好的防治 效果， 防治效果随处理浓度的升高而提高。供试浓度为 50、 100、 200、 300、 400g/mL 时， 处 理 2 天后防效依次为 65.54、 72.40、 86.22、 85.66、 96.57 ； 处理 5 天后防效依次为 44.44、 74.61、 82.53、 84.13、 88.90。

23、； 处理 10 天后防效依次为 34.38、 50.00、 68.75、 75.00、 86.46。结果还显示处理浓度为 400g/mL 的防效优于对照药剂雷多 米尔锰锌。 0066 实施例 5 ： 异甘草甙 (isoliquiritin) 对 3 种病原菌的抑菌活性 0067 采用菌丝生长速率法测定异甘草甙 (isoliquiritin) 对 3 种分属于芽枝霉属 (Cladosporium LK.ex Fr)、 核盘菌属 (Sclerotinia)、 炭疽菌属 (Colletotrichum Corda) 的花生黑霉病、 大麦条纹病、 香蕉炭疽病原真菌的抑制效果。在无菌条件下， 配制不同浓。

24、度 药剂， 再倒入已融化的培养基(温度约为60)中， 充分摇匀， 趁热倒入90cm的培养皿中制 成含药培养基平板。平板凝固冷却后用接种针接进大小一致、 生长一致的各种植物病原真 菌菌饼(5.0mm)， 每皿接1个菌饼， 生长有菌落的一面朝下， 每处理3个重复， 同时设清 水空白对照、 1甲醇对照。置于生化培养箱中， 25条件下培养 5 天， 再用十字交叉法测量 供试真菌菌落直径的大小， 按以下公式计算抑菌率， 进而计算药剂处理对不同病菌的有效 抑制中浓度 (EC50) 及相关系数 (r) 值。 0068 0069 抑菌活性测定结果见表 4。 0070 表 4 异甘草甙对 3 种植物病原真菌的抑菌活性 0071 说 明 书 CN 101543214 B 8 。