技术领域
本发明属医药领域，涉及天然来源的胡柚提取物在制备降脂功能食品、保健品或药物中的应用，尤其涉及胡柚提取物的制备方法和在小鼠体内水平上降脂的应用。
背景技术
近几十年来，肥胖已经成为世界范围内主要的公共健康问题。肥胖可以增加诸如2 型糖尿病、冠心病、高血压等慢性病的发病风险。肥胖是由能量摄入和代谢支出不平衡诱发的代谢综合症，具体表现为脂肪组织的脂肪积累，导致脂肪细胞数量增多，脂肪细胞尺寸增大。目前，用于肥胖治疗的方法主要有节食、吃减肥药等，但具有很多限制因素，比如副作用和容易反弹等。因此，副作用较小的天然产物越来越引起人们的研究兴趣。
胡柚（Citrus changshanensis）是柚和酸橙的杂交后代，是浙江省衢州市常山县特有的杂柑类良种，至今己有上百年的种植历史。其香气独特、浓郁，果实外形美观，呈鲜黄色，富有光泽，果肉金黄色，汁液丰富，食之酸甜适中，略带苦味，食后使人觉得非常爽口。胡柚具有清凉祛火，镇咳化痰，润喉醒酒，养颜益寿等诸多药理功效，营养价值很高。然而，对于胡柚提取物在活体内是否具有降脂活性、胡柚不同组织部位提取物降脂是否具有组织特异性，尚未见诸报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种胡柚提取物在制备降脂功能食品、保健品或药物中的应用，所述胡柚提取物是指胡柚油胞层、白皮层和囊衣层的提取物的冷冻干燥粉末，经过丙酮超声提取、旋转蒸发、过固相萃取（SPE）柱、真空干燥得到。
本发明强调胡柚提取物这种天然产物在降脂中的最新发现。本发明证实胡柚油胞层、白皮层和囊衣层提取物（剂量均为40mg/kg BW）能够在高脂诱导肥胖C57BL/6小鼠体内（in vivo）降低体重，显著降低肝脏和脂肪组织质量，显著降低血清中含有的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇，降低肝脏中含有的甘油三酯和总胆固醇。
本发明的另一个目的是提供一种胡柚提取物在制备脂肪代谢异常相关降脂产品中的应用，所述胡柚提取物是将胡柚油胞层、白皮层和囊衣层的提取物的冷冻干燥粉末，经过丙酮超声提取、旋转蒸发、过固相萃取柱、真空干燥得到，所述脂肪代谢异常相关降脂产品为功能食品、保健品或防治药物。
本发明提供的胡柚提取物能够降低高脂诱导肥胖C57BL/6小鼠体内（in vivo）体重，显著降低肝脏和脂肪组织质量，显著降低血清中含有的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇，降低肝脏中含有的甘油三酯和总胆固醇。可作为功能食品、保健品或防治药物用于脂肪代谢异常相关疾病的防治。
附图说明
图1是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其小鼠状态的影响。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，3个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=10。
图2-1是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其肝脏质量的影响。
图2-2是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其睾周脂肪质量的影响。
图2-3是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其肾周脂肪质量的影响。
图3-1是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其血清甘油三酯的影响。
图3-2是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其血清总胆固醇的影响。
图3-3是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）的影响。
图4-1是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其肝脏甘油三酯的影响。
图4-2是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其肝脏总胆固醇的影响。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1 胡柚提取物的制备
胡柚果实经过手工分离得到油胞层、白皮层和囊衣层，液氮速冻后经过低温真空干燥，磨样后得到冷冻干燥粉末。分别称取胡柚油胞层、白皮层和囊衣层冷冻干燥粉末1 g，用80%丙酮20 mL（固液比1:20） 超声30 min，频率为60 kHz，功率为30 W。提取液通过减压抽滤得到澄清提取液，如此重复3次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸去丙酮，得到胡柚提取物水溶液。
水溶液用固相萃取（SPE）Sep-Pak? C18柱进行纯化（12 cc/2 g，Waters），纯化过程分为活化、平衡、上样、淋洗和洗脱五个步骤：SPE小柱首先用20 mL甲醇活化，再用20 mL去离子水平衡，然后水溶液上样，待充分吸附后，小柱用40 mL去离子水淋洗以洗去果实中的糖酸等极性物质，真空抽干后用80 mL甲醇充分洗脱，洗脱液用真空干燥仪蒸干，分别得到粉末66.3 mg、63.6 mg和42.1 mg，得到的粉末即为胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末。
实施例2 胡柚提取物的C57BL/6小鼠试验
C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂的低脂饲料（含10%脂肪）和高脂饲料（含45%脂肪）购自江苏美迪森生物医药有限公司。所有小鼠在恒温恒湿环境下饲养，提供12 h光照12 h黑暗环境。每组10只小鼠，低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导肥胖组，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层提取物3个处理组剂量都为40 mg/kg BW。所有小鼠可以自由摄取食物和蒸馏水，处理组通过灌胃针灌胃的方式进行给药，低脂和高脂对照组灌胃蒸馏水。试验为期16周，1周连续给药6天，停药1天。试验每周测定1次小鼠重量，1次小鼠摄食量，数据用平均值±标准误（ ）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行Duncan多重比较，不同的上标字母表示具差异显著性（p<0.05），具体的小鼠初始体重、最终体重和平均摄食量见附表1。表1是以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠为饲喂对象，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层SPE粉末对其体重和摄食量的影响。给药16周，每周监测小鼠体重变化，第1周测定初始体重，第16周测定最终体重。每周监测1次小鼠摄食量，16周平均得到平均摄食量。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导肥胖组，3个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=7-10。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行Duncan多重比较，不同的上标字母表示具差异显著性（p<0.05）。
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试验进行16周后处死小鼠，胡柚油胞层、白皮层和囊衣层提取物处理组的小鼠状态见附图1。
试验进行16周后处死小鼠，分离得到肝脏、睾周脂肪和肾周脂肪，分别称重，低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，3个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=7-8。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行Duncan多重比较，不同的上标字母表示具差异显著性（p<0.05），具体的脏器质量见附图2-1、附图2-2和附图2-3。
试验进行16周后处死小鼠，采集血清，使用罗氏Cobas 8000生化仪测定血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，3个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-8。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行差异显著性数据分析，进行Duncan多重比较，不同的上标字母表示具差异显著性（p<0.05），具体的C57BL/6小鼠血清甘油三脂和总胆固醇含量见附图3-1、附图3-2和附图3-3。
试验进行16周后处死小鼠，分离得到肝脏，使用北京北化康泰临床试剂有限公司的试剂盒测定肝脏甘油三酯和总胆固醇，低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，3个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-8。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行差异显著性数据分析，进行Duncan多重比较，不同的上标字母表示具差异显著性（p<0.05），具体的C57BL/6小鼠肝脏甘油三脂和总胆固醇含量见附图4-1和附图4-2。