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一种负载AU纳米颗粒的ΓPGA水凝胶中的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610068698.X (22)申请日 2016.01.29 A61K 49/04(2006.01) (71)申请人东华大学地址 201620 上海市松江区松江新城人民北路 2999 号申请人上海市第十人民医院 (72)发明人史向阳朱建志孙文杰周本青周一伟彭琛 (74)专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所 31233 代理人黄志达 (54) 发明名称一种负载 Au 纳米颗粒的 -PGA 水凝胶中的制备方法 (57) 摘要本发明涉及一种负载 Au 纳米颗粒的 -PGA 水凝胶中的制备方法，包括：。

2、将 PEI 溶液加入到活化的 mPEG-COOH 的溶液中，得 PEINH2-mPEG，溶于超纯水后加入氯金酸，搅拌，加入硼氢化钠水溶液，得 (Au0)200-PEINH2-mPEG ；向活化的 -PGA 溶液中加入碳酸氢钠，然后加入到AOT的DCM溶液中，得W/O乳液，加入到PVA的溶液中，得W/O/W聚合物乳液；将 (Au0)200-PEINH2-mPEG 的超纯水溶液逐滴加入到聚合物乳液中，搅拌即得。本发明工艺简单，成本低廉；制备的水凝 X 射线衰减性能较好，造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和生物相容性。。

3、 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图7页 CN 105664183 A 2016.06.15 CN 105664183 A 1.一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，包括： (1)将PEI的DMSO溶液加入到经过EDC和NHS活化的mPEG-COOH的DMSO溶液中，搅拌2-5 天，透析，冻干，得到PEINH2-mPEG； (2)将HAuCl4溶液加入到步骤(1)中的PEINH2-mPEG的超纯水溶液中，搅拌，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液，继续搅拌1-2h，透析，冻干，得。

4、到(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒； (3)向经过EDC和NHS活化的-PGA超纯水溶液中加入NaHCO3反应，将反应结束后的溶液加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌，形成W/O乳液；然后将W/O 乳液加入到PVA的超纯水溶液中，搅拌，形成W/O/W的聚合物乳液； (4)将步骤(2)中(Au0)200-PEINH2-mPEG的超纯水溶液加入到步骤(3)的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌，除去有机溶剂，离心洗涤，得到-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG，即负载 Au纳米颗粒的-PGA水凝胶。 2.根据权利要求1所述。

5、的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中mPEG-COOH、和PEI的质量比为240： 100； EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌 1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h； mPEG-COOH、 EDC和NHS的质量比为240： 230： 140。 3.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中透析为截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天。 4.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)H。

6、AuCl4溶液加入到PEINH2-mPEG的超纯水溶液后，搅拌的时间为0.5h。 5.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEINH2-mPEG、 HAuCl4和NaBH4的质量为100： 127： 58.2； PEINH2- mPEG的超纯水溶液的浓度为1mg/mL。 6.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中-PGA与NaHCO3的质量比为1： 1.3； -PGA超纯水溶液、 AOT的DCM溶液和PVA超纯水溶液的体积比为1： 2： 15； EDC和NH。

7、S活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h； -PGA、 EDC和NHS的质量比为20mg： 30mg： 34mg。 7.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中-PGA超纯水溶液的浓度为1mg/mL； AOT的DCM溶液的浓度为33.5mg/ mL； PVA的超纯水溶液的浓度为20mg/mL。 8.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中-PGA和(Au0)200-PEINH2-mPEG的质量比为1： 1.67。 9.根据权利要求1所述的。

8、一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌的时间为12h。 10.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶应用于CT成像造影剂。权利要求书 1/1 页 2 CN 105664183 A 2 一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法技术领域 0001 本发明属于水凝胶的制备领域，特别涉及一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法。背景技术 0002 计算机断层扫描(CT)成像由于其高空间分辨率、深层穿透能力、简便的图像后。

9、处理技术和较低成本等特点，已经成为了临床上应用最广泛的诊断检测技术之一。为了获得更高分辨率的CT图像， CT成像造影剂应运而生。目前临床上常用的CT成像造影剂主要为含碘(I)造影剂，如碘海醇(iohexol)，碘普胺(iopromide)，碘帕醇(iopamidol)等。但是此类造影剂成像效率不是很高，因此为了获得更好的成像效果往往需要大剂量注射，故而对肾脏副作用也较明显。因此为了获得更好的CT成像效果，需要开发新型CT造影剂。金(Au)纳米颗粒作为一种新型的CT成像造影剂，在CT成像方面具有传统造影剂无可比拟的优势。 Au的原子序数更高， X射线衰减系。

10、数更大，故而可以减少Au纳米颗粒造影剂的使用量来获得相同的成像效果。此外， Au的化学惰性在人体内不会释放有毒离子，使Au纳米颗粒造影剂在CT成像造影剂方面具有更独特的优势。 0003 近年来纳米技术的出现极大地推动了Au纳米颗粒在CT成像造影剂方面的发展，制备出的Au纳米颗粒具有形貌尺寸可控、表面易修饰等特点。前期研究采用硼氢化钠(NaBH4) 还原法制备聚乙烯亚胺(PEI)稳定的Au纳米颗粒的结果表明，通过还原法制备的Au纳米颗粒尺寸较小，粒径较为均匀，并且表现出较好的X射线衰减性能，且其表面存在大量的氨基活性基团，可以作为修饰位点进行进一步的修饰(一种叶酸。

11、靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，公开号： CN104288788A，公开日期： 2015.01.21)。 0004 在诸多纳米颗粒的修饰方法中，纳米水凝胶具有独特的优势。相比于单个纳米颗粒，纳米凝胶具有良好的胶体稳定性，生物相容性、高负载能力、易于合成、尺寸可控、易于多功能化等特点。 -聚谷氨酸(-PGA)是一种天然多聚氨基酸，具有优良的水溶性和生物相容性，是一种优良的环保型高分子材料，目前已广泛应用于纳米水凝胶的制备。根据之前报道的纳米水凝胶具有更好的柔性和流动性易被肿瘤细胞吞噬的特点，以及纳米颗粒形成团簇结构可。

12、能会产生协同效应增强材料的X射线衰减能力的优势。 0005 检索国内外文献发现，尚没有关于以NaBH4还原法合成的PEI稳定的Au纳米颗粒为交联剂制备-PGA水凝胶作为CT成像造影剂研究的相关报道。发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是提供一种负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶中的制备方法，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛；制备的-PGA纳米水凝胶能稳定地分散于水溶液中，粒径分布均匀， X射线衰减性能较高、造影效果显著，具有良好的医用前景。说明书 1/7 页 3 CN 105664183 A 3 0007 本发明的一种负载Au纳米颗粒的-PGA水。

13、凝胶中的制备方法，包括： 0008 (1)将PEI的DMSO溶液加入到经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化的羧甲基化甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH的二甲基亚砜DMSO 溶液中，搅拌2-5天，透析，冻干，得到PEINH2-mPEG粉末；其中， mPEG-COOH、和PEI的质量比为240： 100； 0009 (2)将氯金酸HAuCl4溶液加入到步骤(1)中的PEINH2-mPEG的超纯水溶液中，搅拌 0.5h，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液，继续搅拌1-2h，透析，冻干，得到(Au0)200-PEI NH2。

14、-mPEG纳米颗粒粉末；其中， PEINH2-mPEG、 HAuCl4和NaBH4的质量为100： 127： 58.2； 0010 (3)向经过EDC和NHS活化的-PGA超纯水溶液中加入NaHCO3反应0.5h，以降低PEI 表面氨基与-PGA表面羧基的静电作用；将反应结束后的溶液加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌10min，形成W/O乳液；然后将W/O乳液逐滴加入到PVA的超纯水溶液中，搅拌15min，形成W/O/W的聚合物乳液；其中， -PGA与NaHCO3的质量比为1： 1.3； -PGA超纯水溶液、 AOT的DCM溶液和PVA超纯水溶。

15、液的体积比为1： 2： 15； 0011 (4)将步骤(2)中(Au0)200-PEINH2-mPEG的超纯水溶液逐滴加入到步骤(3)的W/O/ W的聚合物乳液中，搅拌，除去有机溶剂，离心洗涤，得到-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG，即负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶；其中， -PGA和(Au0)200-PEINH2-mPEG的质量比为1： 1.67。 0012 所述步骤(1)中EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h； mPEG-COOH、 EDC和NHS的质量比为240： 230： 140。 0013 所述步骤(1)和步骤。

16、(2)中透析为截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3 天。 0014 所述步骤(2)HAuCl4溶液加入到PEINH2-mPEG的超纯水溶液后，搅拌的时间为 0.5h。 0015 所述步骤(2)中PEINH2-mPEG的超纯水溶液的浓度为1mg/mL。 0016 所述步骤(3)中EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h； -PGA、 EDC和NHS的质量比为20mg： 30mg： 34mg。 0017 所述步骤(3)中-PGA超纯水溶液的浓度为1mg/mL； AOT的DCM溶液的浓度为 33.5mg/mL； PVA的超纯水溶液的浓度为20。

17、mg/mL。 0018 所述步骤(4)中搅拌的时间为12h。 0019 所述步骤(4)中除去有机溶剂采用蒸发的方式。 0020 所述步骤(4)中洗涤为：用超纯水离心洗涤三次(6000rpm， 10min)。 0021 所述步骤(4)中负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶应用于CT成像造影剂。 0022 本发明所制备的负载Au纳米颗粒的-PGA纳米水凝胶是由-PGA与(Au0)200- PEINH2-mPEG的静电相互作用和化学作用交联而成。本发明先利用NaBH4还原法合成PEI稳定的Au纳米颗粒，然后将其加入到经EDC活化和双乳化的-PGA溶液中，发生交联反应形成负载Au纳米颗粒的-P。

18、GA纳米水凝胶。本发明操作简单，易于分离，原料来源广泛。制备的 -PGA纳米水凝胶粒径分布均匀， X射线衰减性能较好、造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性和细胞相容性，易于被肿瘤细胞吞噬。肿瘤成像结果显示，本发明制备的负载Au 纳米颗粒的-PGA纳米水凝胶具有显著的造影效果，在CT成像造影剂领域有潜在的应用价说明书 2/7 页 4 CN 105664183 A 4 值。 0023 本发明以NaBH4还原法合成的PEI稳定的Au纳米颗粒为交联剂合成-PGA纳米水凝胶，构建了负载Au纳米颗粒的-PGA水凝胶用作CT成像造影剂，其表面丰富的羧基可以进一步修饰。

19、功能化试剂，为本发明的进一步深入研究开发提供了很大的空间。 0024 本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外吸收光谱分析(UV-Vis)、 X射线衍射分析(XRD)、傅里叶转换红外光谱分析(FTIR)、热重分析(TGA)、透射电子显微镜 (TEM)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)和X射线衰减性能等手段表征制备的负载Au纳米颗粒的-PGA纳米水凝胶。然后利用MTT细胞活力来评价纳米水凝胶的细胞毒性，并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌；随后评价了肿瘤细胞对该纳米水凝胶的吞噬能力。最后进行体外细胞、裸鼠体内肿瘤模型的CT成像实。

20、验，考察-PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的体内外CT成像效果。 0025 有益效果 0026 (1)本发明采用还原法合成的(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒作为交联剂制备 -PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶用于CT成像造影剂，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛价廉，生物可降解，具有良好的发展前景； 0027 (2)本发明制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶粒径分布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性和细胞相容性，对生物体无不良影响； X射线衰减性能好，造影效果显著。

21、，该纳米水凝胶表面拥有大量的活性基团可用于进一步的修饰和深入开发，在CT 成像诊断领域有潜在的应用价值。附图说明 0028 图1为实施例2中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶水溶液在不同储存时间的水动力学直径变化； 0029 图2为实施例2中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米颗粒的UV-Vis图谱； 0030 图3为实施例2中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米颗粒的XRD图谱； 0031 图4为实施例2中-PGA/。

22、(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶、 (Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米颗粒和-PGA的FTIR图谱； 0032 图5为实施例2中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米颗粒的TGA分析曲线； 0033 图6为实施例2中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的TEM图片； 0034 图7为实施例3中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶在不同Au浓度下的 CT成像图片(a)及-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶(1)和碘海醇(2)的。

23、CT值随 Au/I元素浓度变化的线性关系图(b)； 0035 图8为实施例4中HeLa细胞经本发明实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2- mPEG纳米水凝胶处理24h后的MTT细胞活力分析结果(Au浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2和 0.4mM)； 0036 图9为为实施例4中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的对HeLa细胞处说明书 3/7 页 5 CN 105664183 A 5 理24h后(Au浓度0(a)、 0.025(b)、 0.05(c)、 0.1(d)、 0.2(e)和0.4(f)mM)的细胞相差形貌图片； 00。

24、37 图10为实施例5中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)-PGA 纳米颗粒的HeLa细胞吞噬量随Au浓度的变化关系(Au浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2和 0.4mM)； 0038 图11为实施例6中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶对细胞处理后的细胞CT成像图片(a)和体外细胞CT值随Au浓度变化的关系图(b)； 0039 图12为实施例7中-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶PBS溶液(Au 0.5M,0.1mL)后在不同时间点下体内HeLa肿瘤模型的CT成像图片(a)及其信号值图片。

25、(b)。具体实施方式 0040 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0041 实施例1 0042 (1)将240mg mPEG-COOH(Mw2kDa)溶解在10mL DMSO中，加入230mg EDC(溶于5mL DMSO)搅拌2h以活化COOH；加入140mg NHS(溶于5mL DMSO)继续搅拌1h。之后将100mg PEI (Mw25kDa)溶于20mL 。

26、DMSO并加入到上述溶液继续搅拌3天，最后以截留分子量8000- 14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到PEINH2-mPEG粉末； (2)取上述制备的100mg PEINH2-mPEG溶于100mL超纯水中，加入12.7mL HAuCl4溶液(10mg/mL)，搅拌0.5h。之后向其中加入冰浴处理的58.2mg NaBH4(溶于5ml超纯水)溶液，继续搅拌2h，最后以截留分子量 8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到的(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒粉末； (3)取20mg-PGA溶于2mL超纯水中，加入30mg EDC活化2h。

27、，加入34mg NHS继续活化1h；再加入26mg NaHCO3继续反应0.5h，以降低PEI表面氨基与-PGA表面羧基的静电作用；然后将上述溶液逐滴加入到溶有134mg AOT的DCM溶液中(4mL)，搅拌10min，形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴加入到30mL含有600mg PVA(醇解度88， Mw20-30kDa)的超纯水溶液中，搅拌15min，形成W/O/W的聚合物乳液； (4)将制备的33.4mg(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒溶于5mL超纯水中，并逐滴加入到上述步骤制备的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌12h，蒸发除去有机溶。

28、剂，然后用超纯水离心洗涤三次(6000rpm， 10min)，即得到负载Au纳米颗粒的 -PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶。 0043 实施例2 0044 取实施例1中制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶，将其用超纯水稀释至适当浓度后，用于测表面电势和水动力直径。 Zeta电势测定结果表明-PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的表面电势为-13.10.32mV，从而有效避免了 (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒表面氨基产生的细胞毒性，也证明了-PGA和(Au0)200- PEINH2-m。

29、PEG的成功交联。 -PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶水动力学直径为 210.86.35nm，粒径分布均一，且水动力直径能长时间保持几乎不变(参见图1)，从而说明实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶具有良好的胶体稳定性。通过说明书 4/7 页 6 CN 105664183 A 6 测定实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)200-PEINH2- mPEG纳米颗粒的UV-Vis图谱(参见图2)，结果表明：所制备的水凝胶在520nm处出现明显的吸收峰，表明在形成纳。

30、米水凝胶之后Au纳米颗粒的紫外吸收峰位并未发生位移。接着通过测定实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的XRD图谱(参见图3)，结果表明：所制备的水凝胶的衍射峰在位点111、 200、 220、 311和222处，与Au结晶结构的标准衍射峰位点非常吻合。衍射峰峰型尖锐，说明反应制得了晶型良好的Au纳米颗粒。然后测定了实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的FTIR图谱(参见图4)表明：在1377cm-1和1737cm-1处吸收峰明显变化。这说明(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米颗粒很好。

31、的交联了-PGA，形成纳米水凝胶。之后对实施例1中制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2- mPEG纳米水凝胶进行了TGA分析(参见图5)，结果表明纳米水凝胶中-PGA的含量为 8.24。最后通过TEM观察实施例1中制备-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的形貌(参见图6)，结果表明所形成的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的形貌呈球形，尺寸较均匀，凝胶直径大小约为108.619.14nm，没有明显的团聚现象。 0045 实施例3 0046 通过ICP-OES测试法测定实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PE。

32、INH2-mPEG纳米水凝胶中Au元素的含量。分别配制Au浓度为0.005、 0.01、 0.02和0.04mM的-PGA/(Au0)200- PEINH2-mPEG纳米水凝胶水溶液2mL，通过CT成像分析仪测定材料在不同Au浓度下的CT 成像图片。通过配制相同I浓度的医用碘海醇溶液作为对比，来证明-PGA/(Au0)200- PEINH2-mPEG纳米水凝胶用于CT成像的优越性。 0047 通过实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的CT成像图片 (参见图7a)可以看出所制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的CT图像。

33、随着 Au浓度的增加逐渐变亮。不同浓度样品的CT成像可以看出-PGA/(Au0)200-PEINH2- mPEG纳米水凝胶具有良好的体外成像效果。通过比较相同Au/I元素浓度的-PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和碘海醇CT成像信号值(参见图7b)可以看出， - PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的X射线衰减性能要好于医用碘海醇试剂。因此，本发明所制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶可以作为CT分子影像学诊断中的优良造影剂。 0048 实施例4 0049 通过MTT细胞活力实验测定HeLa细胞的活力来评价。

34、实施例1制备的-PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的细胞相容性。配制不同Au浓度的实施例1制备的- PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的PBS溶液。收集对数生长期HeLa细胞，按照 10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，加入200 L DMEM培养基，细胞培养板置于 CO2浓度为5和温度为37的环境中培养24h。弃掉培养基后，每孔更换180 LDMEM培养基，并分别添加20 L不同浓度的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(Au浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2 和0.4mM)和纯PBS(对照组)，。

35、每种浓度设定5个平行样。将细胞培养板继续放置在5CO2， 37 继续孵育24h。倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，每孔加入20 L MTT溶液，避光环境下37恒温培养4h。按顺序每孔吸取上层培养液100 L于96孔板中，在MK3型酶标仪上检测各孔在激发波长490nm处的吸收值，吸收值的大小可以反映活细胞的数量(参见图8)。结果显示，与PBS对照组相比， -PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶在试验浓度范围内说明书 5/7 页 7 CN 105664183 A 7 对HeLa细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在90以上，说明-PGA/(。

36、Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米水凝胶具有良好的细胞相容性，可以安全地应用于生物体内CT成像。同时，本发明通过相差显微镜观察法进一步验证了-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶对细胞形貌的影响(参见图9)。相差显微镜图片显示，不同Au浓度-PGA/(Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米水凝胶(Au浓度0、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2和0.4mM)在37下与细胞共培养24h 后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说明了-PGA/(Au0)200-PEINH2- mPEG纳米水凝胶具有良好的细胞相容性。 005。

37、0 实施例5 0051 一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬，才能更好的应用于肿瘤的 CT成像。本发明中用-PGA稳定的Au纳米颗粒(Au0)-PGA)作为对比材料来验证纳米水凝胶相对于单个纳米颗粒更易被肿瘤细胞吞噬的特点。 0052 配制不同浓度的实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶和 (Au0)-PGA纳米颗粒的PBS溶液，将HeLa细胞接种在6孔细胞培养板上(接种密度为每孔 30万)，加2mL DMEM培养基，细胞培养板置于CO2浓度为5和温度为37的环境中培养12h。之后每孔更换1800 L DMEM培养基，并分别添加20。

38、0 L不同浓度的-PGA/(Au0)200-PEI NH2-mPEG纳米水凝胶和(Au0)-PGA纳米颗粒的PBS溶液(Au浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2 和0.4mM)，在5CO2， 37条件下共培养6h，以PBS培养作为空白对照组。 PBS清洗细胞3遍之后，用王水(盐酸/硝酸；体积比3:1)消化，然后利用ICP-OES测量细胞吞噬的Au浓度。图10结果显示，相对于单个的(Au0)-PGA纳米颗粒，经-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶处理的细胞的Au吞噬量呈现明显差异。这一结果说明-PGA/(Au0)200-PEINH2- 。

39、mPEG纳米水凝胶易于被肿瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。 0053 实施例6 0054 在体内实验之前，评价了实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的细胞CT成像效果，配制不同浓度的实施例1制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG 纳米水凝胶水溶液，将HeLa细胞接种在6孔细胞培养板上(接种密度为每孔30万)，加 2mLDMEM培养基，细胞培养板置于CO2浓度为5和温度为37的环境中培养12h。之后每孔更换1800 L DMEM培养基，并分别添加200 L不同浓度的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG。

40、纳米水凝胶的PBS溶液(Au浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2和0.4mM)，并且以PBS处理的细胞作为对照组，在培养6h结束后细胞用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心，最后分散在0.2mL戊二醛 (2.5)溶液中，用CT成像仪测各细胞样品的CT成像图片(参见图11)。在图11a中， -PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶处理后的HeLa细胞随着Au浓度的增加，其图片亮度明显增加。图11b是细胞经过不同浓度的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶处理后的CT成像值，从图中明显看出，随着Au浓度的增加，细胞。

41、的CT成像值逐渐升高。这些结果说明制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶具有很好的细胞CT成像效果。 0055 实施例7 0056 在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射实施例1制备的-PGA/ (Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶的PBS溶液(Au0.5M,0.1mL)来评价肿瘤部位CT 成像效果(参见图12a)。与注射前的对照小鼠相比较，在注射纳米水凝胶之后，裸鼠肿瘤逐渐变亮，在注射后2h时，裸鼠的肿瘤部位变得最亮，说明-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG 说明书 6/7 页 8 CN 1056641。

42、83 A 8 纳米水凝胶易成功富集在肿瘤部位，具有明显的CT肿瘤诊断效果。在注射后4h，裸鼠肿瘤部位明暗程度逐渐恢复。说明此时纳米水凝胶随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去。图12b 是相应注射时间的肿瘤CT信号值变化，在注射后2h，裸鼠肿瘤部位信号值达到最高，之后开始逐渐恢复，这与图12a的结果一致，说明纳米水凝胶逐渐从肿瘤部位代谢出去。肿瘤CT成像结果说明本发明制备的-PGA/(Au0)200-PEINH2-mPEG纳米水凝胶可以应用于体内肿瘤CT成像诊断的造影剂。 0057 对比例1 0058 取10mg-PGA溶于50mL超纯水中，加入5.1mL HAuC。

43、l4溶液(10mg/mL)，搅拌0.5h；之后向其中加入冰浴处理的14mg NaBH4(溶于5ml超纯水)溶液，继续搅拌2h，最后以截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到的(Au0)-PGA纳米颗粒粉。 (利用-聚谷氨酸稳定的Au纳米颗粒检测三价铬离子的方法。中国发明专利，公开号： CN103471889A；公开日期： 2013.12.25)。说明书 7/7 页 9 CN 105664183 A 9 图1 图2 说明书附图 1/7 页 10 CN 105664183 A 10 图3 图4 说明书附图 2/7 页 11 CN 105664183 A 11 图5 图6 说明书附图 3/7 页 12 CN 105664183 A 12 图7 图8 说明书附图 4/7 页 13 CN 105664183 A 13 图9 图10 说明书附图 5/7 页 14 CN 105664183 A 14 图11 说明书附图 6/7 页 15 CN 105664183 A 15 图12 说明书附图 7/7 页 16 CN 105664183 A 16 。

摘要
申请专利号：	CN201610068698.X	申请日：	20160129
公开号：	CN105664183A	公开日：	20160615
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A61K49/04	主分类号：	A61K49/04
申请人：	东华大学,上海市第十人民医院
发明人：	史向阳,朱建志,孙文杰,周本青,周一伟,彭琛
地址：	201620 上海市松江区松江新城人民北路2999号
优先权：	CN201610068698A
专利代理机构：	上海泰能知识产权代理事务所	代理人：	黄志达
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内容摘要

本发明涉及一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，包括：将PEI溶液加入到活化的mPEG-COOH的溶液中，得PEI·NH2-mPEG，溶于超纯水后加入氯金酸，搅拌，加入硼氢化钠水溶液，得(Au0)200-PEI·NH2-mPEG；向活化的γ-PGA溶液中加入碳酸氢钠，然后加入到AOT的DCM溶液中，得W/O乳液，加入到PVA的溶液中，得W/O/W聚合物乳液；将(Au0)200-PEI·NH2-mPEG的超纯水溶液逐滴加入到聚合物乳液中，搅拌即得。本发明工艺简单，成本低廉；制备的水凝X射线衰减性能较好，造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和生物相容性。

权利要求书

1.一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，包括：(1)将PEI的DMSO溶液加入到经过EDC和NHS活化的mPEG-COOH的DMSO溶液中，搅拌2-5天，透析，冻干，得到PEI·NH-mPEG；(2)将HAuCl溶液加入到步骤(1)中的PEI·NH-mPEG的超纯水溶液中，搅拌，然后加入冰浴处理的NaBH水溶液，继续搅拌1-2h，透析，冻干，得到(Au)-PEI·NH-mPEG纳米颗粒；(3)向经过EDC和NHS活化的γ-PGA超纯水溶液中加入NaHCO反应，将反应结束后的溶液加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌，形成W/O乳液；然后将W/O乳液加入到PVA的超纯水溶液中，搅拌，形成W/O/W的聚合物乳液；(4)将步骤(2)中(Au)-PEI·NH-mPEG的超纯水溶液加入到步骤(3)的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌，除去有机溶剂，离心洗涤，得到γ-PGA/[(Au)-PEI·NH-mPEG]，即负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶。 2.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中mPEG-COOH、和PEI的质量比为240：100；EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h；mPEG-COOH、EDC和NHS的质量比为240：230：140。 3.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中透析为截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天。 4.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)HAuCl溶液加入到PEI·NH-mPEG的超纯水溶液后，搅拌的时间为0.5h。 5.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEI·NH-mPEG、HAuCl和NaBH的质量为100：127：58.2；PEI·NH-mPEG的超纯水溶液的浓度为1mg/mL。 6.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中γ-PGA与NaHCO的质量比为1：1.3；γ-PGA超纯水溶液、AOT的DCM溶液和PVA超纯水溶液的体积比为1：2：15；EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌1-2h；γ-PGA、EDC和NHS的质量比为20mg：30mg：34mg。 7.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中γ-PGA超纯水溶液的浓度为1mg/mL；AOT的DCM溶液的浓度为33.5mg/mL；PVA的超纯水溶液的浓度为20mg/mL。 8.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中γ-PGA和(Au)-PEI·NH-mPEG的质量比为1：1.67。 9.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌的时间为12h。 10.根据权利要求1所述的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶应用于CT成像造影剂。

说明书

技术领域

本发明属于水凝胶的制备领域，特别涉及一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法。

背景技术

计算机断层扫描(CT)成像由于其高空间分辨率、深层穿透能力、简便的图像后处理技术和较低成本等特点，已经成为了临床上应用最广泛的诊断检测技术之一。为了获得更高分辨率的CT图像，CT成像造影剂应运而生。目前临床上常用的CT成像造影剂主要为含碘(I) 造影剂，如碘海醇(iohexol)，碘普胺(iopromide)，碘帕醇(iopamidol)等。但是此类造影剂成像效率不是很高，因此为了获得更好的成像效果往往需要大剂量注射，故而对肾脏副作用也较明显。因此为了获得更好的CT成像效果，需要开发新型CT造影剂。金(Au)纳米颗粒作为一种新型的CT成像造影剂，在CT成像方面具有传统造影剂无可比拟的优势。Au 的原子序数更高，X射线衰减系数更大，故而可以减少Au纳米颗粒造影剂的使用量来获得相同的成像效果。此外，Au的化学惰性在人体内不会释放有毒离子，使Au纳米颗粒造影剂在CT成像造影剂方面具有更独特的优势。

近年来纳米技术的出现极大地推动了Au纳米颗粒在CT成像造影剂方面的发展，制备出的Au纳米颗粒具有形貌尺寸可控、表面易修饰等特点。前期研究采用硼氢化钠(NaBH4)还原法制备聚乙烯亚胺(PEI)稳定的Au纳米颗粒的结果表明，通过还原法制备的Au纳米颗粒尺寸较小，粒径较为均匀，并且表现出较好的X射线衰减性能，且其表面存在大量的氨基活性基团，可以作为修饰位点进行进一步的修饰(一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，公开号：CN104288788A，公开日期：2015.01.21)。

在诸多纳米颗粒的修饰方法中，纳米水凝胶具有独特的优势。相比于单个纳米颗粒，纳米凝胶具有良好的胶体稳定性，生物相容性、高负载能力、易于合成、尺寸可控、易于多功能化等特点。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然多聚氨基酸，具有优良的水溶性和生物相容性，是一种优良的环保型高分子材料，目前已广泛应用于纳米水凝胶的制备。根据之前报道的纳米水凝胶具有更好的柔性和流动性易被肿瘤细胞吞噬的特点，以及纳米颗粒形成团簇结构可能会产生协同效应增强材料的X射线衰减能力的优势。

检索国内外文献发现，尚没有关于以NaBH4还原法合成的PEI稳定的Au纳米颗粒为交联剂制备γ-PGA水凝胶作为CT成像造影剂研究的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛；制备的γ-PGA纳米水凝胶能稳定地分散于水溶液中，粒径分布均匀，X射线衰减性能较高、造影效果显著，具有良好的医用前景。

本发明的一种负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶中的制备方法，包括：

(1)将PEI的DMSO溶液加入到经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC 和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化的羧甲基化甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH的二甲基亚砜 DMSO溶液中，搅拌2-5天，透析，冻干，得到PEI·NH2-mPEG粉末；其中，mPEG-COOH、和PEI的质量比为240：100；

(2)将氯金酸HAuCl4溶液加入到步骤(1)中的PEI·NH2-mPEG的超纯水溶液中，搅拌 0.5h，然后加入冰浴处理的NaBH4水溶液，继续搅拌1-2h，透析，冻干，得到 (Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒粉末；其中，PEI·NH2-mPEG、HAuCl4和NaBH4的质量为 100：127：58.2；

(3)向经过EDC和NHS活化的γ-PGA超纯水溶液中加入NaHCO3反应0.5h，以降低 PEI表面氨基与γ-PGA表面羧基的静电作用；将反应结束后的溶液加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌10min，形成W/O乳液；然后将W/O乳液逐滴加入到PVA的超纯水溶液中，搅拌15min，形成W/O/W的聚合物乳液；其中，γ-PGA与NaHCO3的质量比为1：1.3；γ-PGA超纯水溶液、AOT的DCM溶液和PVA超纯水溶液的体积比为1： 2：15；

(4)将步骤(2)中(Au0)200-PEI·NH2-mPEG的超纯水溶液逐滴加入到步骤(3)的W/O/W 的聚合物乳液中，搅拌，除去有机溶剂，离心洗涤，得到γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]，即负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶；其中，γ-PGA和(Au0)200-PEI·NH2-mPEG的质量比为1： 1.67。

所述步骤(1)中EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌 1-2h；mPEG-COOH、EDC和NHS的质量比为240：230：140。

所述步骤(1)和步骤(2)中透析为截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天。

所述步骤(2)HAuCl4溶液加入到PEI·NH2-mPEG的超纯水溶液后，搅拌的时间为0.5h。

所述步骤(2)中PEI·NH2-mPEG的超纯水溶液的浓度为1mg/mL。

所述步骤(3)中EDC和NHS活化为：加入EDC搅拌1-2h；然后加入NHS继续搅拌 1-2h；γ-PGA、EDC和NHS的质量比为20mg：30mg：34mg。

所述步骤(3)中γ-PGA超纯水溶液的浓度为1mg/mL；AOT的DCM溶液的浓度为33.5 mg/mL；PVA的超纯水溶液的浓度为20mg/mL。

所述步骤(4)中搅拌的时间为12h。

所述步骤(4)中除去有机溶剂采用蒸发的方式。

所述步骤(4)中洗涤为：用超纯水离心洗涤三次(6000rpm，10min)。

所述步骤(4)中负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶应用于CT成像造影剂。

本发明所制备的负载Au纳米颗粒的γ-PGA纳米水凝胶是由γ-PGA与(Au0)200- PEI·NH2-mPEG的静电相互作用和化学作用交联而成。本发明先利用NaBH4还原法合成PEI 稳定的Au纳米颗粒，然后将其加入到经EDC活化和双乳化的γ-PGA溶液中，发生交联反应形成负载Au纳米颗粒的γ-PGA纳米水凝胶。本发明操作简单，易于分离，原料来源广泛。制备的γ-PGA纳米水凝胶粒径分布均匀，X射线衰减性能较好、造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性和细胞相容性，易于被肿瘤细胞吞噬。肿瘤成像结果显示，本发明制备的负载Au纳米颗粒的γ-PGA纳米水凝胶具有显著的造影效果，在CT成像造影剂领域有潜在的应用价值。

本发明以NaBH4还原法合成的PEI稳定的Au纳米颗粒为交联剂合成γ-PGA纳米水凝胶，构建了负载Au纳米颗粒的γ-PGA水凝胶用作CT成像造影剂，其表面丰富的羧基可以进一步修饰功能化试剂，为本发明的进一步深入研究开发提供了很大的空间。

本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外吸收光谱分析(UV-Vis)、X射线衍射分析(XRD)、傅里叶转换红外光谱分析(FTIR)、热重分析(TGA)、透射电子显微镜 (TEM)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)和X射线衰减性能等手段表征制备的负载Au纳米颗粒的γ-PGA纳米水凝胶。然后利用MTT细胞活力来评价纳米水凝胶的细胞毒性，并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌；随后评价了肿瘤细胞对该纳米水凝胶的吞噬能力。最后进行体外细胞、裸鼠体内肿瘤模型的CT成像实验，考察 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的体内外CT成像效果。

有益效果

(1)本发明采用还原法合成的(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒作为交联剂制备 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶用于CT成像造影剂，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛价廉，生物可降解，具有良好的发展前景；

(2)本发明制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶粒径分布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性和细胞相容性，对生物体无不良影响；X射线衰减性能好，造影效果显著，该纳米水凝胶表面拥有大量的活性基团可用于进一步的修饰和深入开发，在CT成像诊断领域有潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶水溶液在不同储存时间的水动力学直径变化；

图2为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒的UV-Vis图谱；

图3为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒的XRD图谱；

图4为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶、(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒和γ-PGA的FTIR图谱；

图5为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒的TGA分析曲线；

图6为实施例2中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的TEM图片；

图7为实施例3中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶在不同Au浓度下的CT成像图片(a)及γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶(1)和碘海醇(2)的CT值随Au/I 元素浓度变化的线性关系图(b)；

图8为实施例4中HeLa细胞经本发明实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶处理24h后的MTT细胞活力分析结果(Au浓度为0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)；

图9为为实施例4中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的对HeLa细胞处理24h后 (Au浓度0(a)、0.025(b)、0.05(c)、0.1(d)、0.2(e)和0.4(f)mM)的细胞相差形貌图片；

图10为实施例5中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)-γ-PGA纳米颗粒的 HeLa细胞吞噬量随Au浓度的变化关系(Au浓度为0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)；

图11为实施例6中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶对细胞处理后的细胞CT成像图片(a)和体外细胞CT值随Au浓度变化的关系图(b)；

图12为实施例7中γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶PBS溶液([Au]＝0.5M,0.1 mL)后在不同时间点下体内HeLa肿瘤模型的CT成像图片(a)及其信号值图片(b)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将240mgmPEG-COOH(Mw＝2kDa)溶解在10mLDMSO中，加入230mgEDC (溶于5mLDMSO)搅拌2h以活化COOH；加入140mgNHS(溶于5mLDMSO)继续搅拌1h。之后将100mgPEI(Mw＝25kDa)溶于20mLDMSO并加入到上述溶液继续搅拌3天，最后以截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到PEI·NH2-mPEG粉末；(2)取上述制备的100mgPEI·NH2-mPEG溶于100mL超纯水中，加入12.7mLHAuCl4溶液(10mg/mL)，搅拌0.5h。之后向其中加入冰浴处理的58.2mgNaBH4(溶于5ml超纯水)溶液，继续搅拌2h，最后以截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到的(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒粉末；(3)取20mgγ-PGA溶于2mL超纯水中，加入30mgEDC活化2h，加入34mgNHS继续活化1h；再加入26mgNaHCO3继续反应0.5 h，以降低PEI表面氨基与γ-PGA表面羧基的静电作用；然后将上述溶液逐滴加入到溶有134 mgAOT的DCM溶液中(4mL)，搅拌10min，形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴加入到30mL含有600mgPVA(醇解度88％，Mw＝20-30kDa)的超纯水溶液中，搅拌15min，形成W/O/W的聚合物乳液；(4)将制备的33.4mg(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒溶于5mL 超纯水中，并逐滴加入到上述步骤制备的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌12h，蒸发除去有机溶剂，然后用超纯水离心洗涤三次(6000rpm，10min)，即得到负载Au纳米颗粒的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶。

实施例2

取实施例1中制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶，将其用超纯水稀释至适当浓度后，用于测表面电势和水动力直径。Zeta电势测定结果表明γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的表面电势为-13.1±0.32mV，从而有效避免了(Au0)200- PEI·NH2-mPEG纳米颗粒表面氨基产生的细胞毒性，也证明了γ-PGA和(Au0)200-PEI·NH2- mPEG的成功交联。γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶水动力学直径为210.8± 6.35nm，粒径分布均一，且水动力直径能长时间保持几乎不变(参见图1)，从而说明实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶具有良好的胶体稳定性。通过测定实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)200-PEI·NH2-mPEG纳米颗粒的UV-Vis图谱(参见图2)，结果表明：所制备的水凝胶在520nm处出现明显的吸收峰，表明在形成纳米水凝胶之后Au纳米颗粒的紫外吸收峰位并未发生位移。接着通过测定实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的XRD图谱(参见图3)，结果表明：所制备的水凝胶的衍射峰在位点111、200、220、311和222处，与Au结晶结构的标准衍射峰位点非常吻合。衍射峰峰型尖锐，说明反应制得了晶型良好的Au纳米颗粒。然后测定了实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的FTIR图谱 (参见图4)表明：在1377cm-1和1737cm-1处吸收峰明显变化。这说明(Au0)200-PEI·NH2- mPEG纳米颗粒很好的交联了γ-PGA，形成纳米水凝胶。之后对实施例1中制备的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶进行了TGA分析(参见图5)，结果表明纳米水凝胶中γ-PGA的含量为8.24％。最后通过TEM观察实施例1中制备γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的形貌(参见图6)，结果表明所形成的γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的形貌呈球形，尺寸较均匀，凝胶直径大小约为108.6±19.14 nm，没有明显的团聚现象。

实施例3

通过ICP-OES测试法测定实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶中Au元素的含量。分别配制Au浓度为0.005、0.01、0.02和0.04mM的γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶水溶液2mL，通过CT成像分析仪测定材料在不同Au浓度下的CT成像图片。通过配制相同I浓度的医用碘海醇溶液作为对比，来证明γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶用于CT成像的优越性。

通过实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的CT成像图片(参见图7a)可以看出所制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的CT图像随着Au 浓度的增加逐渐变亮。不同浓度样品的CT成像可以看出γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG] 纳米水凝胶具有良好的体外成像效果。通过比较相同Au/I元素浓度的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和碘海醇CT成像信号值(参见图7b)可以看出，γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的X射线衰减性能要好于医用碘海醇试剂。因此，本发明所制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶可以作为CT分子影像学诊断中的优良造影剂。

实施例4

通过MTT细胞活力实验测定HeLa细胞的活力来评价实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的细胞相容性。配制不同Au浓度的实施例1制备的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的PBS溶液。收集对数生长期HeLa细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，加入200μLDMEM培养基，细胞培养板置于CO2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养24h。弃掉培养基后，每孔更换180μL DMEM培养基，并分别添加20μL不同浓度的γ-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(Au浓度为 0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)和纯PBS(对照组)，每种浓度设定5个平行样。将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24h。倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3 遍，每孔加入20μLMTT溶液，避光环境下37℃恒温培养4h。按顺序每孔吸取上层培养液100μL于96孔板中，在MK3型酶标仪上检测各孔在激发波长490nm处的吸收值，吸收值的大小可以反映活细胞的数量(参见图8)。结果显示，与PBS对照组相比， γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶在试验浓度范围内对HeLa细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在90％以上，说明γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶具有良好的细胞相容性，可以安全地应用于生物体内CT成像。同时，本发明通过相差显微镜观察法进一步验证了γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶对细胞形貌的影响(参见图 9)。相差显微镜图片显示，不同Au浓度γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶(Au 浓度0、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)在37℃下与细胞共培养24h后，细胞形貌与 PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说明了γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶具有良好的细胞相容性。

实施例5

一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬，才能更好的应用于肿瘤的CT成像。本发明中用γ-PGA稳定的Au纳米颗粒((Au0)-γ-PGA)作为对比材料来验证纳米水凝胶相对于单个纳米颗粒更易被肿瘤细胞吞噬的特点。

配制不同浓度的实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和 (Au0)-γ-PGA纳米颗粒的PBS溶液，将HeLa细胞接种在6孔细胞培养板上(接种密度为每孔30万)，加2mLDMEM培养基，细胞培养板置于CO2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养12h。之后每孔更换1800μLDMEM培养基，并分别添加200μL不同浓度的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶和(Au0)-γ-PGA纳米颗粒的PBS溶液(Au浓度为 0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)，在5％CO2，37℃条件下共培养6h，以PBS培养作为空白对照组。PBS清洗细胞3遍之后，用王水(盐酸/硝酸；体积比3:1)消化，然后利用ICP-OES 测量细胞吞噬的Au浓度。图10结果显示，相对于单个的(Au0)-γ-PGA纳米颗粒，经 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶处理的细胞的Au吞噬量呈现明显差异。这一结果说明γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶易于被肿瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。

实施例6

在体内实验之前，评价了实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的细胞CT成像效果，配制不同浓度的实施例1制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶水溶液，将HeLa细胞接种在6孔细胞培养板上(接种密度为每孔30万)，加2mL DMEM培养基，细胞培养板置于CO2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养12h。之后每孔更换1800μLDMEM培养基，并分别添加200μL不同浓度的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2- mPEG]纳米水凝胶的PBS溶液(Au浓度为0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM)，并且以PBS 处理的细胞作为对照组，在培养6h结束后细胞用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心，最后分散在0.2mL戊二醛(2.5％)溶液中，用CT成像仪测各细胞样品的CT成像图片(参见图11)。在图11a中，γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶处理后的HeLa细胞随着Au浓度的增加，其图片亮度明显增加。图11b是细胞经过不同浓度的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶处理后的CT成像值，从图中明显看出，随着 Au浓度的增加，细胞的CT成像值逐渐升高。这些结果说明制备的γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶具有很好的细胞CT成像效果。

实施例7

在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射实施例1制备的 γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶的PBS溶液([Au]＝0.5M,0.1mL))来评价肿瘤部位CT成像效果(参见图12a)。与注射前的对照小鼠相比较，在注射纳米水凝胶之后，裸鼠肿瘤逐渐变亮，在注射后2h时，裸鼠的肿瘤部位变得最亮，说明γ-PGA/[(Au0)200- PEI·NH2-mPEG]纳米水凝胶易成功富集在肿瘤部位，具有明显的CT肿瘤诊断效果。在注射后4h，裸鼠肿瘤部位明暗程度逐渐恢复。说明此时纳米水凝胶随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去。图12b是相应注射时间的肿瘤CT信号值变化，在注射后2h，裸鼠肿瘤部位信号值达到最高，之后开始逐渐恢复，这与图12a的结果一致，说明纳米水凝胶逐渐从肿瘤部位代谢出去。肿瘤CT成像结果说明本发明制备的γ-PGA/[(Au0)200-PEI·NH2-mPEG] 纳米水凝胶可以应用于体内肿瘤CT成像诊断的造影剂。

对比例1

取10mgγ-PGA溶于50mL超纯水中，加入5.1mLHAuCl4溶液(10mg/mL)，搅拌0.5h；之后向其中加入冰浴处理的14mgNaBH4(溶于5ml超纯水)溶液，继续搅拌2h，最后以截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3天，冻干后得到的(Au0)-γ-PGA纳米颗粒粉。 (利用γ-聚谷氨酸稳定的Au纳米颗粒检测三价铬离子的方法。中国发明专利，公开号： CN103471889A；公开日期：2013.12.25)。