技术领域
本发明属于酵素生产技术领域，具体涉及一种山楂益生菌酵素及其制备方法。
背景技术
酵素指通过微生物对水果蔬菜发酵，提取的一种含生物活性成分的液体。上述生物活性成分包括酶但是不限于酶，包括活性抗氧化成分、生物质化素等，来自发酵参与菌和用于发酵的食材。
合理制作的酵素，所萃取的植物活性物质都是来自于食材，且发酵参与菌更是人体微生态系统的组成部分。因此，酵素的副作用几乎为零，强大的功效，极小的副作用，近年来一直呈爆炸性增长趋势。
山楂核果类水果，核质硬，果肉薄，味微酸涩，果可生吃或作果脯果糕，干制后可入药，是中国特有的药果兼用树种，具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药，对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效。
市场上山楂产品较为单一，但是由于山楂果体成熟期比较集中，且难以保存，限制了其应用。山楂现有的进一步开发有山楂红酒(CN104877859A)、山楂果醋(CN107439878A)、山楂饮料(CN107467432A)、山楂酵素(CN105852090A)，但这些产品对原料中营养物质成分的提取不够充分。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山楂益生菌酵素及其制备方法，解决了传统山楂应用途径窄的问题。
本发明所采用的技术方案为：
一种山楂益生菌酵素的制备方法，包括以下步骤：
S1将新鲜山楂500-700kg、山药200-300kg、山茱萸100-200kg、赤砂糖50kg加入发酵设备中；
S2向发酵设备中继续加入酵母菌5-10g和发酵乳杆菌10-25g进行初发酵，发酵时间为5-7个月；初发酵结束后加入植物乳杆菌10-15g、鼠李糖乳杆菌10-15g进行第二次发酵，发酵时间7-9个月；第二次发酵结束后加入嗜酸乳杆菌5-10g继续第三次发酵7-9个月；
S3三阶段发酵结束后，检测pH稳定在2.8-3.5之间，酒精度＜0.5％时，发酵完成；
S4将发酵完成的发酵液进行过滤；
S5静置纯化：将过滤后的发酵液静置纯化，当酒精度＜0.5％、乳酸菌总数≥1×106CFU/ml时纯化完成，得到山楂益生菌酵素原液。
所述S2中初发酵、第二次发酵和第三次发酵时，隔绝空气进行厌氧发酵。
发酵设备为发酵桶。
采用以上制备方法制得的山楂益生菌酵素。
山楂益生菌酵素原液进行灌装得到终产品。
灌装条件：控制室内洁净度达到10万级规定要求，车间工人进入车间前必须洗手、更衣、消毒，严格按灌装机及旋盖机的操作规程进行操作，在灌装进行中随时检查灌装量，封口质量等环节，确保产品符合标准技术要求。在灌装前后将设备及管道进行彻底清洗和消毒；灌装为瓶装，瓶及瓶盖清洗：瓶子先用纯净水翻转冲洗，再用洁净压缩空气吹干，盖子用消毒柜进行消毒处理，保证达到无菌要求。
优选以下技术方案：在S2中，专用发酵桶为850个，每个发酵桶容量1200升(每次加入原料总量1000kg左右)，电子称2台，每发酵桶装料量1吨，发酵温度为常温，车间密封，保持洁净，常温发酵，发酵时间为24个月。
在S5中，静置纯化罐为50个，每个静置纯化罐容量为30吨，使用材质为食品级塑料材质。
灌装时，灌装机的型号为TD-8，灌装机的数量为2套；旋盖机的型号TD-SP1，旋盖机的数量为2套，灌装速度为2000瓶/小时，瓶器为30ml玻璃瓶。
瓶及瓶盖清洗时，理瓶器2台；全自动翻转冲瓶机2台，全自动翻转冲瓶机的型号为CP-15；消毒柜1台，消毒柜的型号为ZTP-390。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果是：
本发明以山楂、山药、山茱萸为主要原料，原料的营养成分在科学合理的搭配上更加丰富，制备过程中不添加水，充分保障了酵素中的营养物质及活性物质含量、浓度，在益生菌的发酵作用下，同时严格控制益生菌的种类、用量以及发酵时长，保证原料的发酵更加充分、深度，发酵过程分为三个阶段且根据不同阶段的特性分别加入不同的菌种，使发酵具有层次更加合理；特别是二次发酵阶段，自然发酵，不再增加糖源，最终使得原料中的营养物质、活性物质、抗氧化物质能够完全释放分解出来，改善了现有酵素采用原材料加水发酵或果汁发酵的制作方式所导致的酵素发酵效率低，活性物质、营养成分含量低，以及保健效果不显著等技术问题。最终得到一种口感良好、营养丰富、健脾开胃、消食化滞的山楂益生菌酵素，增加了山楂益生菌酵素营养价值。
本发明制得的山楂益生菌酵素不含任何食品添加剂，安全健康，无毒副作用，可放心享用，适宜于各类人群；解决了传统山楂应用途径窄、产品形态单一问题。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中原料加入发酵桶之前经过清洗、吹干、紫外消毒、粉碎。
实施例1：一种山楂益生菌酵素的制备方法，包括以下步骤：
S1将新鲜山楂650kg、山药200kg、山茱萸100kg、赤砂糖50kg加入发酵桶中；
S2向发酵桶中继续加入酵母菌10g和发酵乳杆菌25g进行初发酵，发酵时间为6个月；初发酵结束后加入植物乳杆菌15g、鼠李糖乳杆菌15g进行第二次发酵，发酵时间8个月；第二次发酵结束后加入嗜酸乳杆菌10g继续第三次发酵8个月；
初发酵、第二次发酵和第三次发酵时，发酵桶覆膜，隔绝空气进行厌氧发酵
S3三阶段发酵结束后，检测pH稳定在2.8-3.5之间，酒精度＜0.5％时，发酵完成；
S4将发酵完成的发酵液进行过滤；
S5静置纯化：将过滤后的发酵液静置纯化，当酒精度＜0.5％、乳酸菌总数≥1×106CFU/ml时纯化完成，得到山楂益生菌酵素原液。
实施例2：一种山楂益生菌酵素的制备方法，包括以下步骤：
S1将新鲜山楂700kg、山药200kg、山茱萸100kg、赤砂糖50kg加入发酵桶中；
S2向发酵桶中继续加入酵母菌5g和发酵乳杆菌25g进行初发酵，发酵时间为5个月；初发酵结束后加入植物乳杆菌10g、鼠李糖乳杆菌15g进行第二次发酵，发酵时间9个月；第二次发酵结束后加入嗜酸乳杆菌5g继续第三次发酵7个月；
初发酵、第二次发酵和第三次发酵时，发酵桶覆膜，隔绝空气进行厌氧发酵
S3三阶段发酵结束后，检测pH稳定在2.8-3.5之间，酒精度＜0.5％时，发酵完成；
S4将发酵完成的发酵液进行过滤；
S5静置纯化：将过滤后的发酵液静置纯化，当酒精度＜0.5％、乳酸菌总数≥1×106CFU/ml时纯化完成，得到山楂益生菌酵素原液。
实施例3：一种山楂益生菌酵素的制备方法，包括以下步骤：
S1将新鲜山楂500kg、山药300kg、山茱萸200kg、赤砂糖50kg加入发酵桶中；
S2向发酵桶中继续加入酵母菌10g和发酵乳杆菌10g进行初发酵，发酵时间为7个月；初发酵结束后加入植物乳杆菌15g、鼠李糖乳杆菌10g进行第二次发酵，发酵时间7个月；第二次发酵结束后加入嗜酸乳杆菌8g继续第三次发酵9个月；
初发酵、第二次发酵和第三次发酵时，发酵桶覆膜，隔绝空气进行厌氧发酵
S3三阶段发酵结束后，检测pH稳定在2.8-3.5之间，酒精度＜0.5％时，发酵完成；
S4将发酵完成的发酵液进行过滤；
S5静置纯化：将过滤后的发酵液静置纯化，当酒精度＜0.5％、乳酸菌总数≥1×106CFU/ml时纯化完成，得到山楂益生菌酵素原液。
实施例4：一种山楂益生菌酵素的制备方法，包括以下步骤：
S1将新鲜山楂600kg、山药250kg、山茱萸150kg、赤砂糖50kg加入发酵桶中；
S2向发酵桶中继续加入酵母菌8g和发酵乳杆菌20g进行初发酵，发酵时间为6个月；初发酵结束后加入植物乳杆菌12g、鼠李糖乳杆菌12g进行第二次发酵，发酵时间8个月；第二次发酵结束后加入嗜酸乳杆菌8g继续第三次发酵8个月；
初发酵、第二次发酵和第三次发酵时，发酵桶覆膜，隔绝空气进行厌氧发酵S3三阶段发酵结束后，检测pH稳定在2.8-3.5之间，酒精度＜0.5％时，发酵完成；
S4将发酵完成的发酵液进行过滤；
S5静置纯化：将过滤后的发酵液静置纯化，当酒精度＜0.5％、乳酸菌总数≥1×106CFU/ml时纯化完成，得到山楂益生菌酵素原液。
实施例1-4得到山楂益生菌酵素原液后，需按国标GB/T31121检测微生物指标、重金属指标达标，其他指标达到行业标准T/CBFIA08003-2016，然后山楂益生菌酵素原液经专用管道输送至灌装车间，灌装得到山楂益生菌酵素成品。
效果实验：对实施例1-4中制得的山楂益生菌酵素的消食化滞功效验证
实验对象：健康SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20g)
实验试剂与仪器
羧甲基纤维素；营养性半固体糊(自制)：取5g羧甲基纤维素溶于100ml蒸馏水中，分别加入奶粉8g、白糖4g、淀粉4g，2ml碳素墨水及蒸馏水，配成半固体糊150ml，置于冰箱中冷藏保存，使用前2h取出，恢复室温；Rat GAD Elisa试剂盒；Rat SS Elisa试剂盒；Rat SP Elisa试剂盒；电子天平；低速离心机；吸收光酶标仪。其它：莫沙必利；甘蓝；精炼猪油；
实验建模
采用饮食失节+力竭游泳方法建立功能性消化不良脾虚大鼠模型，通过观察样品对大鼠胃排空率验证消食化滞的功效。
建模：双日自由进食水，喂饲精炼猪油(1.5ml/100g)1次，单日禁食不禁水，喂饲甘蓝10-15g/只，以达到饮食不节；并在单日将大鼠置于盛有温水(水温22±1℃)，水深50cm的塑胶桶中游泳至力竭(大鼠水中旋转、运动协调性明显下降，水淹没鼻尖，身体下沉，至再次浮出水面超过10s，连续3次)1次，以达到劳倦过度，共25d。大鼠出现活动减少、倦卧少动、扎堆、眯眼、拱背、反应迟钝、皮毛干枯欠光泽，捉拿时反抗无力，进食减少、渐见体型瘦弱、体重下降或增长缓慢，软便或便溏，造模成功。
分组及处理
大鼠适应性饲养一周后，随机分为空白对照组、模型对照组、莫沙必利组和实验组1-4，每组15只。空白对照组为正常饲养大鼠，其它各组均为建模成功后的功能性消化不良脾虚大鼠；空白对照组及模型对照组每天定时给予灌胃7.2ml/(kg.d)生理盐水；实验组1-4组每天定时给予灌胃7.2ml/(kg.d)实施例1-4中制得的山楂益生菌酵素样品；持续灌胃1周，灌胃条件、饲养条件相同。
观察指标及方法：
胃排空率测定:末次给样后不禁水，24h后给予半固体糊2ml灌胃，1h后硫酸妥钠(40ml/kg)腹腔内注射麻醉，迅速打开腹腔，立即结扎贲门和幽门，剪取胃，称胃全质量，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后，擦拭干后称胃净质量。
按公式：胃排空率＝1-[(胃全质量-胃净质量)/灌胃质量]×100％
统计学处理数据均以表示，采用单因素方差分析，用SPSS 20.0软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
各组大鼠胃排空率比较
组别 只数(只) 胃排空率(％) 空白对照组 15 70.68±12.37 模型对照组 15 46.98±16.57** 莫沙利必组 15 67.16±13.95# 实验组1 15 60.58±17.10## 实验组2 15 60.44±15.92## 实验组3 15 59.89±16.32## 实验组4 15 60.21±17.03##
注：**与空白对照组比较，P＜0.01；##与模型对照组比较，P＜0.05；#与模型对照组比较P＜0.01
与空白对照组比较，模型对照组胃排空率显著降低(P＜0.01)，验证了功能性消化不良脾虚大鼠模型建立成功；莫沙必利组、实验组1-4组与模型对照组比较，胃排空率均显著高于模型对照组，其中莫沙利必组与模型对照组相比P＜0.01，实验组1-4组模型对照组相比P＜0.05；证明了实施例1-4所制得的山楂益生菌酵素均有显著的消食化滞功效，其中以实施例1所制得的山楂益生菌酵素效果最为显著。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。