1.引言
为在包括人宿主在内的哺乳动物体内刺激抗原特异性免疫而进行基 因免疫接种，是本公开的核心所在。本说明书公开了向宿主靶细胞，如 抗原呈递细胞的胞质传输颗粒多核苷酸。这些颗粒多核苷酸编码可接近 靶细胞胞质的抗原性蛋白质或抗原性蛋白质片段。抗原基因的表达导致 抗原特异性免疫反应，其包括但不只限于对抗原特异性细胞毒性T淋巴 细胞的(CTL)的诱导作用。抗原接近胞质得以通过内源性MHC I途 径在膜上呈递抗原肽。通过内源性MHC I途径的膜呈递可刺激对抗原特 异性CTL的诱导作用。然后被诱导的抗原特异性CTL可导向并破坏受 抗原表达影响的宿主细胞，例如赘生性细胞或病毒感染的细胞。 2.发明背景
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是抗肿瘤或病毒感染的有效人体免疫反 应的关键性成分。细胞毒性T淋巴细胞通过识别由MHC I分子呈递于被 感染靶细胞之表面上的抗原肽来破坏赘生细胞或病毒感染细胞。这些抗 原肽是存在于被感染细胞之胞质溶胶中的外源蛋白质的降解产物，其中 通过内源性MHC I加工途径被加工并呈递给CTL。
虽然MHC I分子识别外来蛋白质可能足以由CTL来识别和破坏被 感染的靶细胞，但要从T淋巴细胞前体诱导抗原特异性CTL还需有其他 一些信号。专化的抗原呈递细胞(APC)可以提供CTL介导免疫的诱 导期所需要的抗原-MHC I配体和辅助信号。APC的一般性特征包括 MHC I和II表达，对APC-淋巴细胞相互作用特别重要的各种粘附分 子的表达，以及共刺激分子如CD 80和CD 86的表达。APC的例子包 括巨噬细胞和树状细胞(包括皮肤的表皮朗汉氏细胞、皮肤的树状细胞， 以及淋巴结和和脾中的树状细胞)。
用被杀死的肿瘤细胞、病毒感染细胞或蛋白质成分进行体内免疫接 种，以诱导抗原特异性CTL反应的努力一般都没有成功，推测其原因是 细胞外液中的蛋白质不能进入胞质溶胶并接近MHC I呈递途径。
基因免疫法具有几个有吸引力的特征。包括逆转录病毒或腺病毒介 导的基因转移以及直接注射裸DNA在内的几种体内基因转移方法导致 了转基因表达(有关评述参见Krishnaw等，1995，自然医学(Nature Med.)1：521-522和Pardoll等，1995，免疫(Immunity)3：165-169)。
Williams等人(1991，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)88：2726-2730)的研究显示，在生物轰击(biobalistic)递 送萤火虫萤光素酶基因后导致蛋白质萤光素酶在完整表皮细胞中的表 达。这些研究中没有致力于CTL反应，也没有考虑定向产生细胞介导之 免疫反应的特异性宿主细胞。
Tang等人(1992，自然(Nature)356：152-154)利用生物轰击 (biobalistic)装置产生对外源蛋白质的体液反应。将处于CMV启动子或β -肌动蛋白启动子控制下的hGH编码基因传送到小鼠的表皮组织。检测 小鼠体内在对此免疫过程的反应中产生的抗hGH抗体。Tang等人并没 有公开引导细胞介导之免疫途径的基因免疫接种。Tang等人没有公开 或提示直接导向APC细胞的基因免疫接种。
Fynan等人(1993，美国国家科学院学报90：11478-11482)使用 编码流感病毒血凝素糖蛋白的质粒DNA构建体进一步证实了Tang等人 的发现。Fynan等人将借助基因枪向表皮递送DNA包被的金颗粒所产 生的体液反应与其他机制作了比较，并发现使用生物轰击(biobalistic)装 置1)产生对致死性流感病毒攻击的95％保护作用，2)是DNA免疫接种 的最为有效的途径，证明其实质上比粘膜、肌肉内或静脉内给药更为有 效，而且3)DNA需要量比盐水接种少250至2500倍。Fynan等人没有 公开或提示直接导向APC细胞以进行基因免疫接种。没有提及CTL介 导的免疫。
Liu及其同事(Montgomery等，1993，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol.)12：777-783；Ulmer等，1993，科学(Science).259：1745- 1749；Donnelly等，1995，自然医学1：583-587)已证明非定向的非特异 性肌肉内注射裸DNA可诱导抗病毒蛋白质的抗原特异性CTL反应及抗 病毒攻击的保护性免疫。这些研究并没有公开为进行基因免疫接种向 APC定向传输遗传材料。
Sun等人(1995，美国国家科学院学报92：2889-2893)利用生物轰击 (biobalistic)装置在小鼠体内产生抗肿瘤反应。作者直接向小鼠体内 肿瘤部位运送了表达IL-6的质粒构建体。IL-6的表达提供了一种 形式的非特异性定向于肿瘤的细胞因子基因疗法。没有提出针对肿瘤的 抗原特异性免疫。Sun等人没有公开或提示为基因免疫接种而直接靶向 APC细胞。
Kundig等人(1995，科学，268：1343-1346)证明，蛋白质抗原定位于 淋巴器官上对于体内诱导抗原特异性CTL反应是很关键的。但没有研究 基因免疫接种。
Kovacsovics-Bankowski和Rock(1995，科学267：243-246)证明通 常不能通过MHC I内源途径呈递的蛋白质抗原的吞噬体至胞质溶胶途 径。作者推测吞噬体中内在化的颗粒形式的蛋白质事实上能够进入MHC I呈递所需的胞质途径。但该研究没有指明功能上完整的遗传材料通过吞 噬体至胞质途径进行胞质溶胶的能力。
Falo等人(1995，自然医学1：649-653)证明直接向动物体内递送颗 粒蛋白质抗原可在小鼠体内产生抗原特异性CTL介导的抗肿瘤免疫，从 而为支持体内的吞噬体至胞质途径提供了依据。他们证明，如果以颗粒 形式给药，将蛋白质直接注射到动物体内，其可特异地进入APC的吞噬 体至胞质途径。但此文没有详细说明基因免疫接种方法。没有指出体内 给予的遗体材料通过该途径功能完整性地进入APC或其他类型细胞胞质 的能力。
Pardoll和Beckerleg(1995，免疫3：165-169)最近评述了裸DNA疫 苗的免疫学。他们强调指出进一步研究确定目前未知的DNA免疫接种机 制的重要性。具体地说，他们的结论是：“阐明裸DNA激活免疫反应的 机制是很重要的。只有通过这些研究，才能引入灵活的修饰，以使之在 质和量上发挥最大功能”。
尽管上述参考文献中记载了许多研究成果，但仍需要发展能针对宿 主内特定细胞类型，以刺激抗原特异性CTL介导的免疫，并反过来促进 直接破坏宿主内特异性赘生细胞或病毒感染细胞的基因免疫接种方法。 本发明注意并满足了这一需要。 3.发明概要
本发明涉及对哺乳动物宿主的治疗或预防性基因免疫接种，该方法 包括向哺乳动物体内的靶细胞传输编码抗原性蛋白质的DNA片段，在宿 主细胞内表达重组的DNA片段，以及继后由该宿主细胞呈递抗原肽，从 而刺激细胞介导的免疫或体液免疫，或两者。
本发明进一步涉及对哺乳动物宿主的治疗或预防性基因免疫接种， 其包括向哺乳动物宿主体内的特异性靶细胞传送编码抗原性蛋白质或其 生物学活性片段的DNA序列。从该DNA片段表达的抗原性肽是对被感 染细胞特异的，并继后刺激抗原特异性CTL产生，从而促进被感染细胞 如赘生细胞和病毒感染之细胞的破坏。
本发明还涉及用颗粒多核苷酸进行基因免疫并接种哺乳动物宿主， 然后向靶细胞的胞质溶胶内传送这些基于颗粒的转基因多核苷酸。一旦 进入靶细胞之内，颗粒多核苷酸即表达某种蛋白质或其生物学活性片 段，从而产生适当的抗原肽片段，并通过内源性MHC I途径呈递到靶细 胞膜上。通过MHC I途径适当地呈递目的抗原肽可刺激CTL产生并进 而促进赘生细胞或病毒感染细胞等细胞的破坏。
因此，本发明还涉及治疗或预防性基因免疫接种哺乳动物的体内方 法，该方法包括产生一个表达抗原蛋白质或抗原蛋白质片段的DNA片 段，将此DNA片段分布于产生颗粒多核苷酸的颗粒表面上，用所说的颗 粒多核苷酸接种哺乳动物宿主并将此颗粒多核苷酸传送到哺乳动物靶细 胞的胞质中，从而通过MHC I途径使所表达的抗原蛋白质或抗原蛋白质 片段呈递于所说靶细胞的膜表面上。
本发明中优选的哺乳动物宿主是人。
本说明书公开的各实施方案中，优选的是感兴趣的DNA片段表达 1)肿瘤排斥抗原或抗原性蛋白质片段，或2)病毒抗原或抗原性蛋白质片 段。可在本发明中利用的人TRA例子包括但不只限于MAGE-1、 MAGE3、Melan-A、gp100、p53、CEA和HER2/neu。可用于本 发明的病毒抗原的例子包括但不只限于HIV gp120、HIV gp160、流感 病毒核蛋白和乙型肝炎表面抗原。
本发明中优选的靶细胞是APC，而APC靶细胞的优选定位或迁移 部位是人宿主的淋巴组织。
在本发明的一个实施方案中，利用微粒轰击装置用颗粒多核苷酸免 疫哺乳动物。具体地说，按生物轰击方法用颗粒多寡苷酸接种以免疫哺 乳动物宿主，从而使颗粒多核苷酸进入至少适当数目宿主细胞的胞质 中。在生物学有效水平上表达转基因多核苷酸，以使抗原肽片段呈递于 内源性MHC I途径并展现于宿主细胞的膜表面上。被导入抗原的内源性 宿主膜呈递促进抗原特异性CTL的诱导生成，后者进入哺乳动物宿主特 别是人宿主的循环，以破坏赘生细胞或病毒感染的细胞。
在本发明的一个特定实施方案中，经微粒轰击接种法用颗粒多核苷 酸免疫哺乳动物宿主特别是人，是通过使颗粒多核苷酸作为非特异性发 射物轰击的直接结果以发射物途径进入至少适当数目宿主细胞，包括 APC的胞质。当轰击皮肤时，可被轰击到的皮肤的APC包括但不只限于 表皮朗汉氏细胞、角质细胞或皮肤树状细胞。当轰击淋巴组织时，可被 轰击的淋巴组织包括但不只限于驻留的树状细胞、巨噬细胞、基质细胞、 T淋巴细胞或B淋巴细胞。
在本发明的另一个实施方案中，以直接注射法例如皮下注射、表皮 注射、真皮注射、淋巴注射和静脉内注射，用颗粒多核苷酸免疫哺乳动 物宿主。颗粒多核苷酸进入宿主细胞并以生物学上有效的水平表达，以 将抗原性肽片段呈递于内源性MHC I途径并展现于宿主细胞的膜表面 上。内源性靶细胞膜呈递可促进对抗原特异性CTL的诱导作用，后者循 环于整个哺乳动物宿主，较好是人宿主，以破坏赘生细胞或病毒感染的 细胞。
在一特别优选的实施方案中，经皮下注射将颗粒多聚苷酸传送到人 宿主体内，通过吞噬体向胞质溶胶途径导向APC，并由APC以生物学 有效水平表达之。本发明公开了通过皮下接种途径直接注射，向APC定 向传送颗粒多核苷酸并在淋巴组织中进行抗原表达。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，经皮下注射直接导向 APC来递送编码肿瘤排斥抗原(TRA)或其生物学活性片段的颗粒多核 苷酸。以这种方式直接递送TRA颗粒多聚苷酸可使肿瘤特异性抗原肽最 大程度地进入I类途径，并且还避免大量颗粒在非APC细胞内转位。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，经皮下注射直接导向 APC来递送编码病毒抗原或其生物学活性片段的颗粒多核苷酸。以这种 方式直接递送编码病毒抗原的颗粒多核苷酸可使病毒特异性抗原肽最大 可能地进入I类途径，而且可避免大量颗粒抗原在非APC细胞内转位。
本领域技术人员将会了解到，由各种材料组成的颗粒包括但不只限 于金、铁和合成塑料，可接近用于本发明中导向APC的吞噬体至胞质途 径。
在本发明的另一个实施方案中，经注射，包括但不限于皮下注射、 表皮注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射，用已与颗粒多核苷酸 共保温后于体外装载抗原的同源APC免疫哺乳动物宿主。颗粒多核苷酸 例如可经微粒轰击或通过吞噬体至胞质途径在体外进入APC。具体地 说，用颗粒多核苷酸转染的APC免疫哺乳动物宿主。这样颗粒多核苷酸 即于体外特异地进入APC，然后可将此APC注射到宿主体内。在由APC 摄入后，在生物学有效水平上表达该转基因多核苷酸，从而抗原性肽片 段通过内源性MHC I途径加工和呈递，并展现于APC的膜表面上。在 注射这些APC后，抗原的内源性APC细胞膜呈递即在注射部位或淋巴 组织中促进对抗原特异性APC的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL 本身又在整个哺乳动物宿主特别是人宿主体内循环，以破坏赘生细胞或 病毒感染的细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经注射例如皮下注射、表皮注射、 真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射，用已于体外被颗粒多核苷酸转染 的同系APC免疫哺乳动物宿主。具体地说，用颗粒多核苷酸转化的APC 免疫哺乳动物宿主，以使颗粒多核苷酸于体外进入APC，然后再将此 APC注射到宿主内。例如可以微粒轰击法或经吞噬体至胞质途径使颗粒 多核苷酸于体外进入APC中。于体外用编码抗原的多核苷酸和/或编码一 种或多种能增加APC抗原呈递功能之效力的分子的多核苷酸转染 APC。这样的分子包括但不只限于细胞因子和共刺激分子。细胞因子的 例子包括但不只限于IL-12、IL-2和IL-4。共刺激分子的例子 包括但不只限于CD 80和CD 86。在进入APC后，编码转基因抗原的 多核苷酸在生物学有效水平上被表达，这样即过通过内源性MHC I途径 加工并呈递抗原性肽片段并使之展现在APC的膜表面上。在注射这些 APC后，抗原的内源APC细胞膜呈递即促进对注射部位或淋巴组织中抗 原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL本身在哺乳动物 宿主特别是人宿主全身循环，以破坏赘生细胞或病毒感染的细胞。在进 入APC后，转基因细胞因子和/或共刺激因子编码多核苷酸得以在生物学 有效水平上被表达，以致使APC的抗原呈递功能在注射部位或在淋巴组 织中造成抗原特异性反应。
本领域技术人员也会知道，可使多核苷酸沉积到由各种材料如金、 铁及合成塑料组成的颗粒上。
本领域技术人员还会知道，可利用各种重组载体产生以颗粒形式应 用的转基因序列。主要由于易于操作，故以DNA质粒载体作为优选载体。
本领域技术人员还会知道，可从包括但不只限于骨髓和外周血的各 种宿主组织中得到APC，并且可在体外操纵所说的APC后将其导入所 说的宿主中。
本发明的一个目的是提供抗赘生细胞的治疗或预防性基因免疫接种 法。
本发明的另一个目的是提供抗病毒感染的治疗或预防性基因免疫接 种法。
本发明的再一个目的是提供向参予产生CTL反应的宿主免疫细胞 内定向导入编码肿瘤排斥抗原基因的颗粒多核苷酸，以对哺乳动物宿 主，最好是人宿主进行基因免疫接种的方法。
本发明的再一个目的是提供向定位于哺乳动物，特别是人宿主淋巴 组织内或能够通向宿主淋巴组织的宿主抗原呈递细胞定向导入编码肿瘤 排斥抗原基因的颗粒多核苷酸，以便产生CTL反应的基因免疫接种方 法。
本发明的再一个目的是提供向参予产生抗特异性病毒感染之CTL 反应的哺乳动物特别是人宿主体内定向导入编码病毒基因的颗粒多核苷 酸，以对所说的宿主进行基因免疫接种的方法。
本发明的再一个目的是提供向定位于哺乳动物特别是人宿主淋巴组 织的宿主抗原呈递细胞内导入编码病毒基因的颗粒多核苷酸，以便在所 说宿主中产生CTL反应的基因免疫接种方法。 4.附图简要说明
图1显示经转染肿瘤细胞系MO4和EG7进行卵白蛋白的功能性呈 递。在有(空心符号)或没有(实心符号)所加入的已述外源OVA肽 SIINFEKL(10ng/ml)(Rock等，1990，免疫学杂志45：804-811)存在条件 下，用T细胞杂交瘤RF33.70(抗OVA+Kb)和指定数目的被转染(方 框)或未被转染(圆圈)的肿瘤细胞制备微量培养物。保温18小时后， 收获上清并使用指示细胞系HT2(Rock等，1990，免疫学杂志145：804- 811)检测IL-2。(A)B16和OVA转染的亚克隆MO4。(B)EL4 和OVA转染的EL4亚克隆EG7。在试验培养物中存在外源性SIINFEKL 时没有明显提高OVA转染之肿瘤的OVA呈递。
图2显示B16衍生之黑素瘤MO4的OVA表达没有明显地影响肿 瘤攻击后的体内肿瘤生长或宿主存活率。用MO4(圆圈)或B16(方 框)(5×104/小鼠，两侧中腹部皮下注射)攻击小鼠。每周3次估测肿 瘤大小(图2A)并以平均肿瘤面积(平方厘米数)给出结果，直到每组 中出现第一只动物死亡为止。以存活动物的百分数表示存活率(图2B)。 所有实验均每组5只小鼠，并且至少重复3次。处死将垂死的小鼠。
图3显示经皮肤递送OVA编码DNA进行免疫接种以诱导OVA特 异性的CTL介导的保护作用，阻止表达OVA的黑素瘤MO4所致的致 死性攻击。分析体外刺激的OVA免疫(如实施例第7部分所述的遗传免 疫)小鼠之脾细胞对抗OVA转染之淋巴瘤EG7(实心方块)或未被转 染之亲本EL4(空三角)的溶细胞功能(A)。将效应细胞群体单单与 补体(空方框)，或与抗CD4+(黑三角)、CD8+(空心圈)或Thyl.2+(实心圆圈)淋巴细胞的单克隆抗体和补体一起保温，然后分析抗EG7 靶的细胞溶解活性(B)。在C-F中，小鼠用OVA(实心方块)或 LacZ(空心方块)遗传0免疫，并于7天后加强免疫。最后一次免疫(0 天)后7天用B16黑素瘤(D)，或表达OVA的亚克隆MO4(C) 攻击各组被免疫的小鼠。或者，将被免疫的小鼠分成2组，其中一组在 最后一次免疫后7和9天腹腔注射抗CD8 mAb以排除CD8+淋巴细胞。 于最后一次免疫(0天)后10天用MO4攻击完整的(E)和CD8+耗 尽的(F)小鼠。以存活动物(C-F)的百分数记录存活率。第60 天仍存活的动物没有肿瘤生长的征象。所有实验都是每组5只小鼠，并 至少重复3次。按照动物关怀指南杀死垂死的小鼠。
图4显示抗原呈递细胞内在化和表达颗粒多核苷酸，并且通过MHC I类限制加工途径加工并呈递被表达的抗原。经排除淋巴细胞中的骨髓细 胞并在加有10％FCS、L-谷氨酰胺、抗生素和2-ME的RPMI 1640 中，于24孔平板内以106个细胞/孔的密度培养过夜准备树状细胞。于第 1天以2.5×105细胞/孔的密度将细胞重新铺敷在含GM-CSF(103U/ml， Sigma，St.Louis，MO)和小鼠rIL-4(103U/ml，Genzyml，Cambridge，MA) 的培养基中，并于第8天收获松散粘附的细胞。经流式细胞计数分析， 表明这些树状细胞表达了CD45、CD44、CD11b(Mac-1)、CD18、 CD80、CD86和I类和II类MHC抗原。在减少血清培养基(Optimen， Gibco，Grand Island，NY)中，加或不加OVA肽(20ng/ml)+β2-微 球蛋白(β2-M，10μl/ml，Sigma)的情况下将树状细胞37℃脉冲2 小时。然后彻底洗细胞，重悬于PBS中并照射(2000rad)之，然后注 射到首次用于实验的小鼠体内。使用铁微粒(实心方块)或金微粒(空 心圈)作为颗粒基质或使用OVA蛋白(2mg/ml)(黑方块)将指定数 目的骨髓衍生的树状APC与按实施例第7部分中所述方法制备的编码 OVA的颗粒多核苷酸(50μl/ml/106细胞，7mg/ml颗粒)共培养24小 时，洗涤，然后将指定数目的APC在微量培养物中与T细胞杂交瘤RF 33.70(抗OVA+Kb)共培养。保温18小时后，收获上清并使用指示 细胞系HT2检测IL-2(Rock等，1990，免疫学杂志145：804-811)。
图5显示经生物轰击(biobalistic)或皮下注射给药进行颗粒多核 苷酸免疫接种的比较。免疫每组5只C57B1/6小鼠，第7天进行加强免 疫，然后于加强免疫后第7天在每侧胁腹部皮内注射5×105个MO5肿 瘤细胞以攻击之。免疫材料包括：(A)按实施例第7节所述方法制备 的并经生物轰击(biobalistic)给药运送的编码β-Gal的颗粒多核苷 酸；(b)按实施例第7节所述方法制备并经生物轰击(biobalistic)传送的编 码OVA的颗粒多核苷酸；(c)经皮下注射传送的编码OVA的过量无颗粒 多核苷酸；或(D)按实施例第7节所述方法制备的但经皮下注射给药 的等量编码OVA的颗粒多核苷酸。所给数据为肿瘤细胞攻击后50天每 组中无肿瘤动物的百分数。
图6显示用已与编码OVA的颗粒多核苷酸共保温的APC免疫接种 后，可保护动物免于遭受表达OVA之黑素瘤MO5的攻击；每组5只 C57B1/6小鼠按图5中所述一次皮下免疫，然后在免疫后第10天在每侧 胁腹部皮内注射5×105个MO5肿瘤细胞以攻击动物。免疫用材料包括： (空心方块)每两侧后肢注射编码无关抗原β-半乳糖苷酶的颗粒多核苷 酸(100μl浓度7mg/ml的颗粒溶液(颗粒W/V PBS))；(空心圆圈)市售 的pAc-neo-OVA(每后肢100μl，含有大约等量的DNA/动物)；或(实 心方块)每后肢5×104个骨髓衍生的树状细胞/100μl水溶液(按实施例 7所述方法制备)。存活率以存活动物的百分比表示。所有实验都包括每 组5只动物。按照动物关怀指南杀死垂死的小鼠。 5.发明的详细描述
本文所用的术语“哺乳动物宿主”包括动物界的各成员，其中包括 但不只限于人。
本文所用的术语“DNA片段”可包括任何核苷酸序列，为DNA或 RNA，它含有适当的编码区和调节序列，使靶细胞表达通过内源MHC I 类途径进行细胞膜呈递的抗原蛋白质或抗原性蛋白片段。
本文所用的术语“颗粒多核苷酸”可以指从包括但不只限于金、铁 或合成塑料的材料制得的颗粒，其中颗粒包含一定量的如上文所定义的 DNA片段。
本发明涉及对哺乳动物宿主的治疗或预防性基因免疫接种，其包括 向哺乳动物宿主体内的靶细胞运送一种DNA片段，该DNA片段在靶细 胞中表达，然后在靶细胞中呈递重组抗原性肽，以刺激细胞介导的免疫， 体液免疫，或两者。
本发明涉及对哺乳动物宿主的治疗或预防性基因免疫接种，其包括 向哺乳动物宿主体内的特异性靶细胞运送编码某种蛋白质或其生物学活 性片段的DNA片段。从此DNA序列表达的抗原肽是对被感染的细胞例 如赘生细胞或病毒感染细胞特异的。刺激抗原特异性CTL的产生，从而 促使靶细胞如赘生细胞和病毒感染细胞的破坏。
本发明公开了治疗或防止肿瘤或病毒感染的基因免疫接种方法。细 胞毒性T细胞是抗肿瘤和病毒感染之免疫反应的重要成分。细胞毒性T 细胞通过识别由MHC I类分子呈现于肿瘤靶细胞表面上的抗原性肽杀死 赘生细胞或病毒感染的细胞。这些衍生于肿瘤抗原的肽由被感染的细胞 合成并在胞质中被降解。用被杀死的肿瘤细胞或蛋白质成分免疫接种以 诱导体内肿瘤特异性CTL反应的努力一般均未获得成功，推测可能是由 于细胞外液中的蛋白质不能进入胞质并接近MHC I类呈递途径。
本发明的一个特定实施方案涉及用含有编码目的蛋白质之DNA片 段的颗粒进行基因免疫接种。这种含有DNA片段的颗粒本说明中通篇称 为“颗粒多核苷酸”。最好经给予颗粒形式的例如包被的小球或金颗粒 形式的DNA片段或目的蛋白质来完成向体内细胞的运送。向靶细胞内进 行胞质运送后即表达该蛋白质或其生物学活性片段。被表达的对被感染 细胞特异的蛋白质或蛋白质片段为产生通过内源MHC I类途径向T淋巴 细胞呈递所需的抗原肽提供了底物。通过MHC I类途径适当地呈递目的 抗原肽可刺激CTL的产生并进而促成被染细胞的破坏。
本发明是基于这样的一个前提，即表达肿瘤排斥抗原(TRA)或 病毒抗原或其活性部分的DNA片段可定向于特异的细胞，从而促成最终 实现CTL介导之保护性肿瘤免疫过程的级联反应。为此目的，本发明公 开了用呈颗粒形式的编码抗原蛋白质的DNA构建体转染靶宿主细胞以 诱导CTL介导的免疫。在细胞内产生免疫性蛋白质，因而有机会进入 MHC I类限制的呈递途径。产生天然加工的抗原表位，并且被转染的细 胞可连续几天产生免疫性蛋白质，可能更有利于发挥更强烈的免疫原性 刺激作用。
在本发明的一个特定实施方案中，借助微粒轰击装置用颗粒多核苷 酸免疫哺乳动物宿主，以使颗粒多核苷酸作为非特异性发射物轰击的直 接结果，按发射物路径进入宿主细胞之至少一个成员的胞质中。当轰击 皮肤时，可受轰击的皮肤的APC包括但不只限于表皮朗汉氏细胞、角质 细胞或皮肤树状细胞。当轰击淋巴组织时，可受轰击的淋巴组织的APC 包括但不只限于驻留的树状细胞、巨噬细胞、基质细胞、T淋巴细胞或β 淋巴细胞。在生物学有效水平上表达转基因多核苷酸，以使抗原肽受到 加工，通过内源MHC I类途径呈递并展现于APC细胞的膜表面上。抗 原的内源APC细胞膜呈递可在轰击部位，或在从被轰击细胞运输到淋巴 组织之后促成对抗原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL 本身在哺乳动物宿主特别是人宿主体内循环，以破坏赘生细胞或病毒感 染的细胞。
可借助生物轰击(biobalistic)转送方法用颗粒多核苷酸免疫哺乳 动物宿主，使颗粒多核苷酸通过吞噬体至胞质途径特异地进入宿主细胞 (包括APC)。颗粒多核苷酸在被轰击部位(皮肤或淋巴组织)或在运 输到淋巴组织后通过吞噬体至胞质途径进入宿主细胞。因此，颗粒多核 苷酸可通过颗粒的直接运输进入淋巴组织，然后再由淋巴组织中的细胞 摄入，或者经运输已摄入了颗粒多核苷酸的宿主细胞至淋巴组织而进入 淋巴组织。在被宿主细胞摄入之后，转基因多核苷酸即以生物学有效水 平被表达，以便加工和通过内源MHC I类途径呈递抗原肽，并将其展现 于宿主APC的膜表面上。抗原的内源性APC细胞膜呈递促成在轰击部 位或在淋巴组织中对抗原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性 CTL本身在整个哺乳动物宿主特别是人宿主体内循环，以破坏赘生细胞 或病毒感染的细胞。
在本发明的另一个实施方案中，通过包括但不只限于皮下注射、表 皮注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射在内的直接注射法用颗粒 多核苷酸免疫哺乳动物宿主。颗粒多核苷酸进入宿主细胞并以生物学有 效水平表达之，从而将抗原肽片段呈递于内源MHC I类途径并展现在宿 主细胞的膜表面上。内源靶细胞膜呈递可促成对抗原特异性CTL的诱导 作用，后者在哺乳动物特别是人宿主全身循环，以破坏赘生细胞或病毒 感染的细胞。
可用颗粒多核苷酸免疫哺乳动物宿主以使颗粒多核苷酸通过吞噬体 至胞质途径特异地进入宿主细胞包括APC内。颗粒多核苷酸在注射部位 或在运输到淋巴组织后通过吞噬体至胞质途径进入宿主细胞。因此，可 将颗粒直接运输到淋巴组织然后由淋巴组织中的细胞摄入，或者将已摄 入了颗粒的宿主细胞运输到淋巴组织使颗粒多核苷酸进入淋巴组织。在 被宿主细胞摄入之后，转基因多核苷酸得以在生物学有效水平上表达， 从而使抗原肽通过内源MHC I类途径受到加工和呈递，并展现于宿主 APC的膜表面上。抗原的内源APC细胞膜呈递促成对注射部位或淋巴组 织中的抗原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL本身进 入整体哺乳动物特别是人宿主循环，以破坏赘生细胞或病毒感染的细 胞。
在本发明的另一个实施方案中，以包括但不只限于皮下注射、表皮 注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的直接注射方法用颗粒多核 苷酸免疫哺乳动物宿主。设计颗粒多核苷酸组合物，使其包括优先靶向 APC吞噬途径的的特异性分子(包括但不只限于甘露糖受体介导的途 径，或Fc受体介导的途径)，或有利于颗粒接近胞质的特异性分子(包 括但不只限于内体膜融合蛋白，如病毒HA蛋白或李斯特菌溶胞素蛋 白)。颗粒多核苷酸在注射部位或运输到淋巴组织之后通过吞噬体至胞 质途径进入宿主细胞。因此，可将颗粒直接运输到淋巴组织然后由淋巴 组织中的细胞摄入之，或者将已摄入了颗粒多核苷酸的宿主细胞运输到 淋巴组织以使颗粒多核苷酸进入淋巴组织。在由细胞摄入之后，转基因 多核苷酸以生物学有效水平被表达，从而使抗原肽片段通过内源MHC I 类途径被加工和呈递，并展现于宿主APC的膜表面上。抗原的内源APC 细胞膜呈递促成对抗原特异性CTL在注射部位或淋巴组织中的诱导。被 诱导的抗原特异性CTL本身循环于哺乳动物特别是人宿主的全身，以破 坏赘生细胞或病毒感染的细胞。
使用实施例部分6中详述的小鼠黑素瘤模型在几个方面举例说明本 发明。简单地说，以小鼠模型研究抗原特异性肿瘤免疫的主要限制是缺 乏I类MHC限制的CTL所识别的确定的肿瘤抗原。由于除了宿主对 TRA没有耐受性外，TRA与细胞合成的所有其他蛋白没有根本差异， 所以肿瘤合成的外来蛋白质都应有肿瘤抗原的功能。经将卵白蛋白 (OVA)基因转染到C57B1/6衍生的黑素瘤B16中，用具有确定的外 源合成TRA的小鼠肿瘤模型举例说明本发明的肿瘤免疫接种方法。该系 统因下述几个原因而具有吸引力：(1)B16黑素瘤是已经过深入研究 的小鼠肿瘤，(2)已充分鉴定了该肿瘤的体内生长特性和转移特征， (3)已充分确定了卵白蛋白的结构。已知道C57B1/6小鼠体内OVA 的细胞内加工和呈递。特别是已知道与I类的MHC Kb相关联而呈递的 经过加工的肽的结构。还知道使用T-T杂交瘤33.70A1抗OVA-Kb来检测与H2-Kb相关的卵白蛋白肽〔SIINFEKL〕的功能性表达 (Kovacovics-Bankowski等，1993，美国科学院学报90：4942-4946)。 也已详细描述过估计该系统中体内诱导OVA特异性CTL的技术 (Moore等，1988，细胞54：77-785)。
本发明的一个实施方案是使用生物轰击(biobalistic)装置用目的 颗粒多核苷酸进行免疫接种。具体地说，以生物轰击(biobalistic)方法用 颗粒多核苷酸免疫哺乳动物宿主，以致使颗粒多核苷酸运送促成在被转 染的细胞内发生一系列生物学过程，从而引发对抗致死性肿瘤攻击的保 护性免疫。本发明使用生物轰击(biobalistic)装置进行皮肤抗原运送，借 以从几个方面举例说明本发明。首先，导入编码外来蛋白质β-Gal的 颗粒多核苷酸导致β-Gal蛋白质在表皮和引流淋巴结中的表达。其次， OVA免疫接种导致对OVA特异性CTL的诱导。第三，使用OVA-B16 模型所作的研究显示，OVA免疫的动物受到对抗表达OVA的肿瘤攻击 的保护作用，而且这种保护作用是抗原特异性的和依赖于CTL的。此外， 这种保护作用的机制超出了通过生物轰击(biobalistic)装置全身性皮肤递 送的范围。相反，特异性导向吞噬性APC和/或淋巴组织中的抗原表达才 是诱导从前体产生抗原特异性CTL的重要因素。因此根据本发明的一个 优选实施方案，靶细胞是吞噬性APC，特别是定位在淋巴组织内的，或 可以运输到淋巴组织的APC。
在本发明的另一个实施方案中，经包括但不只限于皮下注射、表皮 注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的直接注射法用颗粒多核苷 酸免疫哺乳动物。转基因多核苷酸在生物学有效水平上得以表达，以致 通过内源MHC I类途径加工和呈递抗原性肽，并使之展现于靶细胞的膜 表面上。内源APC细胞膜呈递促成对抗原特异性CTL的诱导作用，后 者又循环于哺乳动物特别是人宿主全身，以破坏赘生细胞或病毒感染的 细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，经直接注射法用颗粒多核苷酸免 疫的哺乳动物宿主靶细胞是吞噬性APC。转基因多核苷酸在生物学有效 水平上被表达，以使抗原肽片段呈递于内源MHC I类途径并展现于APC 细胞的膜表面上。APC细胞膜呈递促成对抗原特异性CTL的诱导作 用，后者又进行哺乳动物特别是人宿主的全身循环，以破坏赘生细胞或 病毒感染的细胞。
在一优选实施方案中，经皮下注射将颗粒多核苷酸递送到人宿主体 内。本发明公开了直接注射颗粒多核苷酸复合物导致向吞噬性APC的定 向递送和淋巴组织中的基因表达。正是这种通过皮下注射来向吞噬性 APC中定向递送和/或在淋巴组织中进行基因表达才导致从原有前体产 生抗原特异性CTL的优势诱导作用。
因此，本发明的中心是进入APC并由之表达的编码蛋白质或其生物 学活性片段的DNA片段。在APC胞质内表达感兴趣的抗原并进入MHC I类途径，使APC得以促成对抗原特异性CTL的诱导作用。本公开中给 出的数据支持这一新的论点，即诱导这种抗原特异性CTL的最有效方式 是将遗传材料直接转移到淋巴组织中的APC内，或者能够运输到淋巴组 织的APC内。
在本发明的另一个实施方案中，经包括但不只限于皮下注射、表皮 注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的注射方法，用已在体外用 颗粒多核苷酸进行了抗原负载的同源APC免疫哺乳动物宿主。具体地 说，即用颗粒多核苷酸转染的APC免疫哺乳动物宿主，致使颗粒多核苷 酸在体外进入APC并将此APC注射到宿主体内。在进入APC后，转基 因多核苷酸在生物学有效水平上被表达，以使抗原肽片段被加工和通过 内源MHC I类途径呈递，并展现于APC的膜表面上。在注射这些APC 后，对抗原的内源APC细胞膜呈递即促成对注射部位或淋巴细胞中的抗 原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL本身又循环于哺 乳动物特别是人宿主的全身，以破坏肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
在本发明的另一个特定实施方案中，通过包括但不只限于皮下注 射、表皮注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的注射法，用已在 体外与颗粒多核苷酸共保温进行了抗原负载的同系APC免疫哺乳动物宿 主。具体地说，体外与颗粒多核苷酸共保温以转染同系APC，从而使颗 粒多核苷酸通过吞噬体至胞质途径进入APC。用颗粒多核苷酸转染的 APC免疫哺乳动物宿主，即颗粒多核苷酸通过吞噬体至胞质途径特异地 进入APC，然后再将此APC注射到宿主体内。进入APC之后，转基因 多核苷酸在生物学有效水平上被表达，以致抗原肽片段通过内源MHC I 类途径被加工和呈递，并显示于APC的膜表面上。在注射这样的APC 后，对抗原的内源APC细胞膜呈递即促成注射部位或淋巴组织中的抗原 特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL本身又进入哺乳动 物特别是人宿主的全身循环，以破坏赘生细胞或病毒感染的细胞。
在本发明的另一个特定实施方案中，经包括但不只限于皮下注射、 表皮注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的注射方法，用已在体 外用颗粒多核苷酸进行了抗原负载的同系APC免疫哺乳动物宿主。具体 地说，在体外经用颗粒多核苷酸微粒轰击APC来转染同系APC。在轰 击到APC中之后，转基因多核苷酸在生物学有效水平上被表达，以使抗 原性肽被加工并通过内源MHC I类途径被呈递，然后显示于APC的膜 表面上。在注射这样的APC后，对抗原的内源APC细胞膜呈递可促成 对注射部位或淋巴组织中之抗原特异性CTL的诱导作用，被诱导的抗原 特异性CTL本身又通过哺乳动物特别是人宿主体内循环，以破坏赘生细 胞或病毒感染的细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经包括但不只限于皮下注射、表皮 注射、真皮肤注射、淋巴注射和静脉内注射的注射方法，用已在体外用 颗粒多核苷酸转染的同系APC免疫哺乳动物宿主。具体地说，用颗粒多 核苷酸转染的APC免疫哺乳动物宿主，即使颗粒多核苷酸于体外进入 APC并将此APC注射到宿主体内。通过微粒轰击或吞噬体至胞质途径使 颗粒多核苷酸于体外进入APC。在体外用编码抗原的多核苷酸和/或编码 某种能增加APC之抗原呈递功能效率的分子的多核苷酸转染APC，所 说的分子包括但不只限于IL-12、IL-2和/或IL-4等细胞因子分 子，和/或CD80和/或CD86等共刺激分子。当进入APC之后，编码转 基因抗原的多核苷酸在生物学有效水平上被表达，从而使抗原性肽通过 内源MHC I类途径被加工和呈递，并出现在APC的膜表面上。在注射 这样的APC之后，对抗原的内源APC细胞膜呈递便促成对注射部位或 淋巴组织中的抗原特异性CTL的诱导作用。被诱导的抗原特异性CTL 本身又循环于哺乳动物特别是人宿主的全身，以破坏赘生细胞或病毒感 染的细胞。在进入APC后，编码转基因细胞因子和/或共刺激分子的多核 苷酸在生物学有效水平上得到表达，以发挥APC的抗原呈递功能，从而 诱导注射部位或淋巴组织中的抗原特异性免疫反应。
将选择的TRA或病毒抗原掺入到本说明书所公开的系统中是本领 域普通技术人员的技能范围内。目前可利用的TRA包括但不只限于 MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、酪 氨酸酶、Melan-A(MART-1)、gp100(pme117)、gp75(TRP1)、CEA (癌胚抗原)，以及从HPV、HBV和EBV病毒衍生的肿瘤抗原，肿瘤 相关癌基因/肿瘤抑制基因突变编码的抗原如p53、p16、RAS、 HER2/neu、C-ABL及多态内皮粘蛋白抗原(有关综述参见Maeurer 等，1996，临床免疫学原理和实践一书中的肿瘤疫苗部分，R.Rich编辑， Mosby出版社，Chpt.123：1904-1918；Van den Eynde等，1995，实验医 学杂志(J.Exp.Med.)182：689-698)。病毒抗原的例子包括但不只限 于流感核蛋白(Donnelly等，1995，自然医学1：583-587)、HIV gp120、 HIV gp160和乙型肝炎表面抗原(参见Pardoll和Beckerleg，免疫，1995， 3：165-169)。
本领域普通技术人员都知道，可在用于与选择的颗粒结合的重组载 体构建中使用已知上调转基因DNA序列表达的任何真核启动子和/或增 强子序列，以便产生本发明的颗粒多核苷酸。这样的启动子片段包括但 不只限于巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、 鼠白血病病毒(MLV)启动子、β肌动蛋白启动子，以及已知在靶细胞 中有活性的任何细胞特异性启动子或增强子序列。
为此目的，本发明的一个优选实施方案是结合了DNA的颗粒的应 用，以将编码肿瘤或病毒抗原的DNA特异地递送到淋巴组织中的APC 中，或能够运输到淋巴组织内的APC中，从而促进抗原接近MHC I类 途径，从而允许APC刺激诱导抗原特异性CTL。然后这些CTL便循环 于宿主全身并破坏赘生细胞或病毒感染的细胞。
实施例第6部分、实施例第7部分和实施例第8部分中举例描述了 基于利用皮下注射以启动淋巴结APC中特异性反应这一优选方法的肿瘤 免疫。
下述实施例旨在举例说明本发明，而不是限制本发明。 6.实施例：OVA/B16遗传鼠肿瘤模型
使用OVA/B16鼠模型得到了举例说明本发明的实施例第7和8部 分中公开的数据。OVA/B16鼠系统有吸引力的几个原因是：(1)B16 黑素瘤是已深入研究了的鼠肿瘤，(2)已充分鉴定了该肿瘤细胞系的 体内生长特性和转移特征，并且(3)卵白蛋白具有充分确定的结构。 OVA在C57B1/6小鼠中的细胞内加工和呈递是已知的。特别是已知道被 加工的肽的结构，其与MHC I类Kb相关联呈递。也已知道使用T-T 杂交瘤33.70.A1抗OVA-Kb检测卵白蛋白肽[SIINFEKL]与H2-Kb相关的功能性表达(Kovacovics-Bankowski等，1993，美国科学院学报 90：4942-4946)。也已详细描述了估测在该系统中体内诱导OVA特异性 CTL的技术(Moore等，1988，细胞54：777-785)。
小鼠和细胞系。5-8周龄雌性C57BL/6小鼠购自Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME。EL4是C57BL/6T淋巴细胞，EG7 是鸡卵白蛋白(OVA)转染的EL4的亚克隆(Moore等，1988，细胞 54：777-785)。C57BL/6衍生的鼠黑素瘤B16(Fidler等，1976，癌症研 究(Cancer Res.)36：3160-3165)得自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。MO4是按已述方法用pAc-Nco-OVA质粒转染B16而构 建的(Falo等，1995，自然医学1：649-653；Moore等，1988，细胞 54：777-785)。单克隆抗体是从杂交瘤GK1.5(抗CD4，ATCC TIB- 207)、2.43(在Balb/c nu/nu小鼠中经腹腔注射GKf1.5细胞(3× 106)和IFA(0.5ml/小鼠)而产生抗CD8抗体)制备的。
用OVA转染B16黑素瘤细胞后，选择并分离被转染的B16黑素瘤 亚克隆MO4。如根据OVA肽(SIINFEKL)在RF33.70细胞上的呈递 所检测的，亲本黑素瘤B16和OVA转染子在细胞表面上表达相似水平的 功能性Kb(图1)。相反，MO4/5而不是B16能够在没有外源加入的 肽存在下刺激杂交瘤(图1)。这表明了转染抗原的内源性产生、加工 及呈递。重要的是，由MO4内源表达OVA没有明显地改变肿瘤的体内 免疫原性(图2)。B16和MO4在初次用于实验的小鼠体内的肿瘤生 长速率(图2A)差不多，宿主存活率也是如此(图2B)。 7.实施例：通过生物轰击给药进行基因免疫
外来蛋白质表达的定位-免疫后24或48小时收获组织标本(皮肤 或引流淋巴结)，在PBS中洗涤并于4℃下在溶于PBS中的2％甲醛- 0.2％戊二醛中固定。用PBS彻底洗固定的标本，然后于37℃在X-gal 染色溶液(溶于PBS的1mg/ml X-gal，5mM氰铁酸钾、5mM氰亚铁酸 盐、2mM MgCl2)中保温18小时。将染色的组织作石蜡切片并用0.1 ％核坚牢红复染。
基因免疫-将50mg 0.95μm金珠粒与100μl0.1M亚精胺合并并超 声处理5秒钟以制备DNA包被的金颗粒。在旋动的同时相继加入132μg 质粒DNA和200μl CaCl2。使该混合物在室温下沉淀5-10分钟。离心 颗粒(10,000rpm，30秒)并在冷乙醇中洗3次，然后重新悬浮于7ml 乙醇中达到7mg金/ml的终浓度。将此溶液加样于Tefzel管(Agracetus) 中并静止5分钟。除去乙醇并以20rpm旋转30秒使颗粒贴附于管侧壁 上，然后在N2气下干燥。将衬有颗粒的干燥管切割成0.5英寸节段，并 在石蜡密封的小瓶中用干燥剂保存备用。使用Accell基因发射装置，以 300psi发射压力向剃毛的腹部区域轰击两次(每次0.5mg金颗粒＝0.5 英寸管长)以对动物进行疫苗接种。用pAc-Neo-OVA质粒(Moore等， 1988，细胞54：777-785)或含有处于CMV启动子控制下之lacZ基因的 pIEglacZ质粒(由Nadia Jouroud提供)免疫动物。对于涉及皮下注射 颗粒多核苷酸的实验(图5)，按上述方法制备DNA包被的颗粒并皮下 注射等量的DNA。对于某些动物(图5)，皮下注射过量的游离质粒 DNA。在两侧中肋腹部以100μl体积的PBS皮下注射给药。为了体外转 染APC(图4)，使用等重量Biomag氧化铁颗粒或金颗粒作为颗粒基 质同样地制备DNA颗粒。
对于涉及皮下注射颗粒多核苷酸的实验(图5和6)，按上述方法 制备DNA包被的颗粒并注射等量的或附图说明中指定量的DNA。对于 某些动物(图5和6)，皮下注射过量的游离质粒DNA。在两侧后腿以 100μl的PBS皮下注射给药。
为了体外转染APC(图4和6)，同样使用等重量的Biomag氧化 铁颗粒(铁颗粒)或金颗粒作为颗粒基质按上述方法完全同样地制备DNA 颗粒。按附图简要说明中描述的方法从骨髓得到树状APC，不同的是不 加IL-4的组织培养基中与25μl浓度为7mg/ml的颗粒多核苷酸溶液(颗 粒重/PBS体积)37℃保温18小时。按附图简要说明中描述的方法制 备并注射抗原脉冲的树状细胞。简单地说，排除淋巴细胞中的骨髓细胞 并在加有10％FCS、L-谷氨酰胺、抗生素和2-ME的RPMI 1640 培养基中，于24孔平板中以106细胞/孔的密度培养过夜。第1天将细胞 以2.5×105细胞/孔的密度铺敷在含CM-CSF(103U/ml，Sigma，St. Louis，MO)和鼠rIL-4(103U/ml，Genzyme，Cambridge，MA)的平 板中并于第8天收获松散粘附的细胞。经流式细胞计数分析，表明这些 树状细胞表达了CD45、CD44、CD11b(Mac-1)、CD18、CD80、 CD86和I类与II类MHC抗原。在有或没有OVA肽(20ng/ml)+β2 微球蛋白(人β2-M，10μl/ml，Sigma)的减少血清培养基(Optimen， Gibco，Grand Island，NY)中将树状细胞37℃脉冲2小时。然后彻底洗 细胞，重新悬浮于PBS中并照射(2000rad)，然后注射到首次用于实 验的小鼠体内。
细胞毒性试验-按以前描述的作了很小改动的方法(Falo等，1995， 自然医学1：649-653)再刺激被免疫动物的脾细胞。简单地说，免疫接 种后1周，经与照射的(20,000rad)EG7细胞(10×106)共培养以 再次刺激脾细胞(30×106)。5天后收获效应细胞，并在圆底微孔板 (200μl)中以指出的效应细胞-靶细胞比例与2×104个51Cr标记的 靶细胞培养。在有些情况下使用mAb加补体以排除效应细胞中的T细胞 亚群，然后按已述方法(Rock等，1993，免疫学杂志150：1244-1251)进 行检测。37℃培养4小时后，从三次重复的微量培养物中收集100μl上 清，计数并按已述方法(Falo等，1995，自然医学1：649-653)计算特异 性释放的百分率。结果作为三份培养的平均值给出。三份重复培养物的 SEM总是少于均值的15％。
保护试验-按已述方法用所指出的抗原基因构建体免疫C57BL/6 小鼠。用肿瘤攻击动物并按上述方法估计肿瘤存活率。简单地说，最后 一次免疫(0天)后七天，在两侧中胁腹部以被试动物的50％致死剂量 (LD50)或第4部分中指出的肿瘤细胞数2次皮内注射黑素瘤细胞(2 ×104)，以攻击OVA免疫的或lacZ免疫的动物。根据存活动物的百分 数记录存活率。在PBS中将注射用的黑素瘤细胞洗3次。用锥虫兰排斥 法检查被注射细胞可见95％以上是活的。所有实验每组均包括5只小鼠 并至少重复3次。按照Pittsburgh大学医学中心的动物关怀指南杀死垂 死的小鼠。在某些实验中，排除动物的CD8+细胞。为此可如前所述在 免疫后第7和9天腹腔内注射CD8mAb(2.43)，然后在第10天用肿瘤细 胞攻击(Falo等，1995，自然医学1：649-653)。
估测生物轰击免疫接种诱导抗原特异性CTL的能力。用总共至多 2.64μgOVA编码DNA以2次重叠脉冲传送到腹部皮肤内，以免疫初次 用于实验的C57B1/6小鼠，并于7天后进行同样的加强免疫。经过体外 再刺激的这些小鼠的脾细胞裂解表达OVA的同系小鼠胸腺瘤EG7细 胞，但不裂解未转染的亲本肿瘤EL4细胞(图3A)。因此，靶细胞溶 胞作用是抗原特异性的，依赖于肿瘤靶的OVA表达。使用mAb排除效 应细胞群体中的T细胞亚群证明，溶胞作用依赖于具有I类MHC限制 性CTL效应细胞特征的Thy1+，CD8+亚群(图3B)。
在按上述免疫并加强免疫各组小鼠后7天，于远离免疫部位皮内注 射MO4黑素瘤细胞攻击动物，以确定生物轰击免疫接种法诱导保护性肿 瘤免疫的能力。OVA免疫的小鼠可阻止致死性肿瘤攻击，而对照组小鼠 (以相似方法免疫的，但使用lacZ报导基因)的肿瘤则进行性生长，并 在第60天时有60％动物致死(图3C)。OVA免疫的小鼠没有免于遭 受未转染的亲本黑素瘤B16的改击(图3D)，表明保护性免疫是抗原 特异性的，依赖于肿瘤靶的OVA表达。我们通过于肿瘤攻击前重复腹腔 内注射抗CD8mAb排除已免疫动物或对照组(lacZ免疫的)动物的CD8+效应细胞，以估测CD8+效应细胞对这种保护性肿瘤免疫的贡献(Falo 等，1995，自然医学1：649-653)。虽然OVA免疫的动物可免于遭受MO4 的攻击，但经过免疫的排除了CD8+T细胞的动物的存活率却相似于排 除或没有排除T细胞的对照组动物的存活率(图3E-F)。因此，CD8+T细胞对该模型中经基因免疫接种而诱导的保护性肿瘤免疫是必不可 少的。
支持所提出的肿瘤免疫机理的其他证据包括，证明在生物轰击传送 lacZ构建体后表皮中的β-半乳糖苷酶表达，并且令人感兴趣的是，在 引流淋巴结内的分立区域中发生特异性表达。因为这些淋巴结远离免疫 接种部位，所以淋巴结表达不大可能是直接物理轰击的结果。在DNA传 送后24小时在被免疫皮肤的表皮和皮层细胞(未染色的)中金颗粒占优 势，并且在48小时于表皮角质细胞内有lacZ表达。在引流淋巴结内也 有分立区域的特异性染色。经同样处理的无关DNA免疫的小鼠标本则没 有显示lacZ表达。这一观察结果促使我们进行进一步分析，如实施例第 8部中所述。 8.实施例：经皮下给药进行基因免疫接种
经皮下给予颗粒多核苷酸以诱导肿瘤免疫的材料和方法如实施例部 分6和实施例部分7中所述。
该数据证明经体内皮下注射颗粒多核苷酸特异地导向淋巴组织中吞 噬性APC或能够运输到淋巴组织的APC的能力。
通过直接皮下注射或生物轰击给予用包括pAc-Neo-OVA在内的颗 粒多核苷酸而免疫的各组小鼠，都得有等同的抗肿瘤攻击的能力(图5)。 与实施例部分7中所述的发现相符，用编码无关抗原的颗粒多核苷酸(例 如pIEglacZ)免疫并不能提供保护作用(图5)。皮下注射没有颗粒的 pAc-Neo-OVA不能提供对抗相关肿瘤攻击的保护作用(图5)。这些数 据表明，皮下注射颗粒多核苷酸至少如生物轰击颗粒运送一样有效。此 外，因为皮下注射并不导致将多核苷酸颗粒直接物理微弹轰击到个别宿 主细胞的胞质中，所以多核苷酸的表达很可能需要由具有吞噬/胞吞能力 的宿主细胞主动摄入所说的多核苷酸。皮下注射没有颗粒的pAc-Neo- OVA也不提供保护作用这一观察结果，也意味着颗粒运送/吞噬的转导机 制。通过吞噬进行颗粒转导暗示转基因表达优先靶向具有吞噬能力的细 胞，包括APC。
支持所提出的这一机制的其他证据是，观察到APC(骨髓衍生的树 状细胞)在体外与编码卵白蛋白的颗粒多核苷酸(按实施例7中所述制 备的)(pAc-Neo-OVA)共培养，可刺激OVA(SIINFEKL+Kb) 特异性T细胞杂交瘤RF33.70产生IL-2(图4)。这些数据证明，这 些APC能功能性表达卵白蛋白基因并产生卵白蛋白肽-Kb复合物。刺 激的效力与用2mg/ml可溶性OVA蛋白质脉冲的APC观察到的效力差 不多。使用金或铁作为颗粒基质，颗粒多核苷酸在该检测法中是有效的。 因此，颗粒多核苷酸在体外与吞噬性APC一起保温导致被转染抗原的内 源性产生、加工及呈递。这些观察证明，颗粒多核苷酸可被APC摄入并 表达，而且相应的蛋白质可得以功能性呈递，以诱导抗原特异性免疫反 应。
再者，如图6中所示，已按上述方法与编码抗原OVA的颗粒多核 苷酸体外保温的抗原呈递细胞，在本例中为皮下注射的骨髓衍生的树状 细胞，能够诱导抗表达抗原基因之肿瘤细胞的保护性免疫。在给出的例 子中，一次投用105个受照射的已转染的树状细胞/动物(每后肢(双侧)5 ×104个细胞)诱导了完全的抗肿瘤攻击的保护作用。因此，体内投用的 树状细胞APC-其在体外负载了肽时是抗原特异性CTL和保护性肿瘤 免疫的强有力刺激物-至少有与经与颗粒多核苷酸共保温而负载了抗原 时相似的免疫原性。
将这些结果放在一起考虑，总地表明皮下给予颗粒多核苷酸具有向 吞噬性APC定向运送抗原的优点，潜在性地增加基因免疫的效率而降低 不需要有害效应，其中包括但不只限于诱导耐受性或因转染正常的非 APC宿主细胞所致的突变。