刺五加有效物质组合物及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610523896.0 (22)申请日 2016.07.05 (71)申请人 哈尔滨珍宝制药有限公司 地址 150060 黑龙江省哈尔滨市开发区哈 平路集中区烟台一路8号 (72)发明人 方同华 徐秀杰 王维龙 周广红 贾文娟 王博 (74)专利代理机构 北京精金石专利代理事务所 (普通合伙) 11470 代理人 刘晔 (51)Int.Cl. A61K 31/7048(2006.01) A61K 31/7034(2006.01) A61K 31/353(2006.01) A。

2、61K 31/216(2006.01) A61K 31/37(2006.01) A61K 31/192(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 刺五加有效物质组合物及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种刺五加有效物质的组合物 及其制备方法， 本发明的刺五加有效组分包括原 儿茶素、 刺五加苷B、 绿原酸、 刺五加苷E、 异嗪皮 啶、 5-咖啡酰奎宁酸、 4-咖啡酰奎宁酸、 咖啡酸等 等， 其制备方法为将刺五加提取液通过液相色谱 分离， 以甲酸溶液和乙腈为流动相， 线性洗脱梯 度， 浓缩干燥后得到有效组分。 权利要求书2页 说明书9页 CN 106176790。

3、 A 2016.12.07 CN 106176790 A 1.一种刺五加有效物质的组合物， 其特征在于包含原儿茶素、 刺五加苷B、 绿原酸、 刺五 加苷E、 异嗪皮啶、 5-咖啡酰奎宁酸、 4-咖啡酰奎宁酸、 咖啡酸。 2.如权利要求1所述的组合物， 其特征在于组合物制备方法为取刺五加提取液浓缩后 上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分离条件为色谱柱Ultmate XB-C18 (250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性 洗脱梯度， 柱温为18-25， 流速为0.8ml/mi， 收集洗脱液， 浓缩干燥后得到。

4、有效组分； 洗脱过程中流动相梯度如下： 3.如权利要求1或2所述的组合物， 其特征在于包含重量比为原儿茶素4-5份、 刺五加苷 B 22-24份、 绿原酸50-52份、 刺五加苷E 25-26份、 异嗪皮啶3-3.5份、 5-咖啡酰奎宁酸11-15 份、 4-咖啡酰奎宁酸10-12份、 咖啡酸7-9份。 4.如权利要求1或2所述的组合物， 其特征在于包含重量比为原儿茶素4份、 刺五加苷B 23份、 绿原酸51份、 刺五加苷E 25份、 异嗪皮啶3.5份、 5-咖啡酰奎宁酸12份、 4-咖啡酰奎宁 酸11份、 咖啡酸8份。 5.一种制备如权利要求1或2的组合物的方法， 其特征在于取刺五加提取液浓。

5、缩后上样 于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm 4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯 度， 柱温为18-25， 流速为0.8ml/mi， 收集洗脱液， 浓缩干燥后得到有效组分； 洗脱过程中流动相梯度如下： 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106176790 A 2 6.含权利要求1或2所述的刺五加有效物质组合物的制剂， 其特征在于， 所述制剂由刺 五加有效物质组合物组成， 或由刺五加组合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。 7.根据权利要求6所述。

6、的制剂， 其特征在于， 所述制剂为注射液、 冻干粉针剂、 片剂、 颗 粒剂、 胶囊剂、 糖浆剂或合剂。 8.权利要求1或2所述的刺五加有效物质的组合物或权利要求6或7任一项所述的制剂 在制备治降血糖药物中的应用。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106176790 A 3 刺五加有效物质组合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药提取物， 具体地涉及一种从刺五加中提取的有效物质组合物 及其制备方法。 背景技术 0002 刺五加(Radix Acanthopanacis Senticosl)为五加科五加属植物的根、 根茎及 茎， 主要分布在中国东北部、 俄罗斯远东地区、 。

7、日本北海道及朝鲜等地。 始见于东汉 神农本 草经 ， 别名为五加参、 老虎钌自、 刺拐棒。本草纲目 记载刺五加能 “补力益精， 明目下气” ， 能 “补五劳七伤， 久服轻身耐老” ， 具有益气健脾， 补肾安神之功效。 0003 刺五加主要化学成分有苯丙素类(木脂素类、 香豆素类、 苯丙酸类)、 三萜类、 黄酮 类、 另有含氮化合物、 多糖、 脂肪酸及其酯类、 氨基酸、 微量元素以及挥发性成分等。 0004 刺五加总苷具有7种型式， 其主要活性成分为刺五加苷B、 刺五加苷E： 刺五加苷B又 称紫丁香苷(Syringin)， 相对含量最多， 也是刺五加中的主要药效成分之一， 具有抗疲劳、 增强免疫。

8、力、 护肝和释放乙酰胆碱， 增加胰岛素分泌， 防辐射等作用； 刺五加苷E具有缓解压 力、 抗焦虑、 抗应激、 抗溃疡和抗疲劳等作用。 刺五加能调节机体新陈代谢的功能， 提高机体 对有害刺激因子的非特异性抵抗力， 能增强垂体-肾上腺皮质系统的功能， 提高机体的适应 性和耐受性， 减低体内外多种致病因子对机体的损害， 对中枢神经系统即有兴奋作用又有 抑制作用。 0005 近年来由于其在临床上广泛的应用所引起的不良反应时有报道。 其不良反应类型 主要有过敏反应、 过敏性休克、 全身性过敏反应等， 临床主要表现为头晕、 头痛、 胸闷、 呼吸 困难、 血压下降、 烦躁， 部分患者伴有皮疹、 全身瘙痒、 。

9、发热、 寒战、 鼻塞、 流涕等。 造成上述不 良反应的原因主要是目前刺五加制品中含有的杂质多、 有效物质成分及含量少， 并且含有 致敏物质。 0006 本方提供一种刺五加有效物质组合物及其制备方法能有效解决上述问题。 发明内容 0007 本发明目的在于提供一种刺五加有效物质的组合物及该组合物的制备方法， 使用 该方法制备获得的刺五加有效物质组合物有效成分含量高， 杂质含量少， 质量稳定。 0008 本发明创造所述的刺五加有效物质的组合物， 包含原儿茶素、 刺五加苷B、 绿原酸、 刺五加苷E、 异嗪皮啶、 5-咖啡酰奎宁酸、 4-咖啡酰奎宁酸、 咖啡酸。 0009 进一步地， 所述的刺五加有效物。

10、质的组合物包含重量比为原儿茶素4-5份、 刺五加 苷B 22-24份、 绿原酸50-52份、 刺五加苷E 25-26份、 异嗪皮啶3-3.5份、 5-咖啡酰奎宁酸11- 15份、 4-咖啡酰奎宁酸10-12份、 咖啡酸7-9份。 0010 更进一步地， 所述的刺五加有效物质的组合物包含重量比为原儿茶素4份、 刺五加 苷B 23份、 绿原酸51份、 刺五加苷E 25份、 异嗪皮啶3.5份、 5-咖啡酰奎宁酸12份、 4-咖啡酰 奎宁酸11份、 咖啡酸8份。 说 明 书 1/9 页 4 CN 106176790 A 4 0011 本发明创造所述的刺五加有效物质的组合物， 制备方法为取刺五加提取液适。

11、当浓 缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分离条件为色谱柱Ultmate XB- C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为18-25， 流速为0.8ml/mi， 收集洗脱液， 浓缩干燥后得到有效组分； 0012 洗脱过程中流动相梯度如下： 0013 0014 本发明还提供一种制备上述刺五加有效物质的组合物的方法， 如下： 0015 取刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分离 条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.。

12、， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为流 动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为18-25， 流速为0.8ml/mi， 收集洗脱液， 浓 缩干燥后得到有效组分； 洗脱过程中流动相梯度如下： 0016 0017 0018 将上述含有刺五加有效物质的组合物制备成制剂， 所述制剂由刺五加有效物质组 说 明 书 2/9 页 5 CN 106176790 A 5 合物组成， 或由刺五加组合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。 0019 所述制剂为注射液、 冻干粉针剂、 片剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 糖浆剂或合剂。 0020 上述刺五加有效物质的组合物制剂， 可应用于制备治降血糖药物。

13、中。 0021 本技术方案和现有技术相比其优势在于： 0022 1、 本发明的提取分离工艺中使用了液相色谱分离， 能有效地除去糖、 蛋白质、 氨基 酸等杂质， 提高有效成分的含量， 能快速准确的得到有效成分。 0023 2、 本发明提供的刺五加有效组分化学成分及其含量明确， 在药理研究上更易于阐 明其作用机制， 在生产中更易于药物的质量控制。 0024 3、 本发明提供技术方案制备所得刺五加有效物质组合物中的有效物质成分及含 量高， 该组合具有显著的降糖作用， 明显优于现有技术所制备的产品。 0025 4、 本发明提供技术方案制备所得刺五加有效物质组合物制备所的注射剂在过敏 反应中安全性更高于。

14、市售刺五加注射剂。 0026 5、 本发明提供的方法， 和现有技术相比不仅能显著提高终产物产品质量， 获得较 高有效成分含量的组合物， 还具有操作简单、 反应周期短、 安全高效的优点可进行工业化生 产。 具体实施方式 0027 除非另有定义， 本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域 普通技术人员通常理解的含义相同。 通常， 本发明使用的命名及实验操作方法都是本领域 公知的或常用的， 若未特别指明， 本发明实施例中所用的试验试剂及材料均可市售获得。 为 了使本发明所解决的技术问题、 技术方案及有益效果更加清楚明白， 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步的说明。 0028 实施。

15、例1： 0029 取26g刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分 离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为 流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为18， 流速为0.8ml/min， 在0-145分钟时 间段内收集洗脱液， 浓缩干燥后得刺五加有效组分组合物4.06g； 0030 洗脱过程中流动相梯度如下： 0031 说 明 书 3/9 页 6 CN 106176790 A 6 0032 0033 实施例2： 0034 取25g刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相。

16、色谱进行分离， 制备色谱的分 离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为 流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为25， 流速为0.8ml/min， 在0-145分钟时 间段内收集洗脱液， 浓缩干燥后得刺五加有效组分组合物3.91g； 0035 洗脱过程中流动相梯度如下： 0036 0037 实施例3： 0038 取26g刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分 离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.。

17、5甲酸溶液为 流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为20， 流速为0.8ml/min， 在0-145分钟时 间段内收集洗脱液， 浓缩干燥后得刺五加有效组分组合物4.12g； 0039 洗脱过程中流动相梯度如下： 说 明 书 4/9 页 7 CN 106176790 A 7 0040 0041 实施例4： 0042 取25g刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分 离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为 流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为20， 流。

18、速为0.8ml/min， 在0-145分钟时 间段内收集洗脱液， 浓缩干燥后得刺五加有效组分组合物4.03g； 0043 洗脱过程中流动相梯度如下： 0044 0045 实施例5： 0046 取25g刺五加提取液浓缩后上样于制备柱， 通过液相色谱进行分离， 制备色谱的分 离条件为色谱柱Ultmate XB-C18(250mm4.6mm i.d.， 5 m)， C18预柱； 以0.5甲酸溶液为 流动相A， 以乙腈为流动相B， 线性洗脱梯度， 柱温为20， 流速为0.8ml/min， 在0-145分钟时 间段内收集洗脱液， 浓缩干燥后得刺五加有效组分组合物4.05g； 说 明 书 5/9 页 8 。

19、CN 106176790 A 8 0047 洗脱过程中流动相梯度如下： 0048 0049 实施例6： 有效成分含量的测定 0050 测定仪器与试药 0051 Agilent 1100高效液相色谱仪， 配置四元梯度泵、 在线脱气机、 自动进样器、 柱温 箱、 VWD检测器和Agilent Chemstation工作站； MILLIPORE超纯水制备仪； Mettler AE-240 电子天平； KQ-250型超声波清洗器； Minispin小型高速离心机。 0052 对照品原儿茶酸(纯度99 .23 )、 刺五加苷B(纯度98 .93 )、 绿原酸(纯度 99.05)、 刺五加苷E(纯度98.。

20、85)、 异嗪皮啶(纯度99.34)、 5-咖啡酰奎宁酸(纯度 99.12)、 4-咖啡酰奎宁酸(纯度98.74)、 咖啡酸(纯度98.96)， 均购于市售。 0053 混合对照品溶液配制： 取上述原儿茶酸、 刺五加苷B、 绿原酸、 刺五加苷E、 异嗪皮 啶、 5-咖啡酰奎宁酸、 4-咖啡酰奎宁酸、 咖啡酸的对照品适量， 精密称定， 加50甲醇制成每 1ml含原儿茶酸187 g、 刺五加苷B 303 g、 绿原酸547 g、 刺五加苷E 723 g、 异嗪皮啶102 g、 5-咖啡酰奎宁酸547 g、 4-咖啡酰奎宁酸547 g、 咖啡酸192 g 0054 乙腈、 甲醇为色谱纯； Milli。

21、-Q纯化水； 冰醋酸为色谱纯。 0055 检测组： 按本技术方案实施例1-5所述， 制备获得的组合物， 编号分别为检测组1- 5； 检测组溶液配制： 0056 称取本效组分， 用甲醇溶液溶解在容量瓶中， 稀释至刻度摇匀即可。 0057 对比组： 按照专利文献公开号CN102579532中实施例1-4刺五加组合物制备方法部 分所述， 制备获得的组合物， 编号分别为对比组1-4。 0058 对比组溶液配制： 称取本效组分， 用甲醇溶液溶解在容量瓶中， 稀释至刻度摇匀即 可。 0059 色谱条件： 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6250mm， 5 m)； 流动相： 乙腈 (。

22、A)-0.5醋酸溶液(B)， 梯度洗脱(0-10min， 10A-10A； 10-20min， 10A-13.5A； 20- 70min， 13.5A-15.5A)； 流速： 0.6ml/min； 柱温： 24； 检测波长： 270nm(0-51min)、 345nm (51min-70min)； 进样量： 20 L。 说 明 书 6/9 页 9 CN 106176790 A 9 0060 含量检测结果如下： 0061 0062 结果显示： 与对比组1-4组相比， 本发明提供的刺五加组合物检测组1-5中的原儿 茶酸、 刺五加苷B、 绿原酸、 刺五加苷E、 异嗪皮啶、 5-咖啡酰奎宁酸、 4-咖。

23、啡酰奎宁酸、 咖啡酸 的有效物质成分及含量均大大增加。 0063 实施例7： 对四氧嘧啶所致小鼠血糖升高的影响 0064 实验动物： 昆明种小鼠， 体重18-22g， 雌雄各半。 0065 实验试剂： 四氧嘧啶， 购自Sigma公司。 0066 实验分组： 空白对照组、 模型组、 实施例1-5组、 对比例1-2组。 0067 对比例组： 按照专利文献公开号CN102579532中实施例1-2刺五加组合物制备方法 部分所述， 制备获得的组合物， 编号分别为对比组1-2。 0068 实验方法 0069 模型制备： 将四氧嘧啶用生理盐水配成2水溶液(现用现配)。 0070 取昆明种小鼠， 雌雄各半，。

24、 按四氧嘧啶溶液50mg/kg的剂量， 对禁食12小时后的小 鼠进行尾静脉注射。 连续饲养3天后， 禁食12小时， 眼眶采血， 分离血清， 测定空腹血糖， 以血 糖大于14mmol/l作为糖尿病模型小鼠。 0071 分组给药： 取糖尿病模型小鼠80只， 雌雄各半， 随机分为8组， 每组10只， 分别为实 施例1-5组、 对比例1-2组和模型组； 另取重量相近正常昆明种小鼠10， 雌雄各半， 作为空白 对照组。 0072 实施例1-5组、 对比例1-2组分别灌胃给予实施例1-5的刺五加组合物、 对比例1-2 的提取物， 剂量均为1.0g生药量/kg， 模型组和空白对照组分别按照15ml/kg体重。

25、灌胃给予 同体积的生理盐水。 连续灌胃15天， 每天观察小鼠外貌特征的改变。 0073 试验结束后对试验动物禁食12小时， 眼眶静脉丛采血， 测定空腹血糖。 0074 统计学处理： 进行组间t检验。 0075 实验结果： 1、 一般观察： 在试验结束后， 四氧嘧啶模型组动物有明显多饮、 多尿、 体 型消瘦、 毛发失去光泽、 蜷卧弓背没精神等现象。 而空白对照组动物精神状况良好， 毛发光 说 明 书 7/9 页 10 CN 106176790 A 10 泽， 生长发育正常。 实施例1-4组动物外貌特征得到显著改善， 对比例1-2组动物外貌特征有 所改善。 0076 2、 血糖值的改变： 对四氧嘧。

26、啶所致小鼠血糖升高的影响， 见下表： 0077 组别血糖值 空白对照组6.780.52 模型组21.231.31 实施例1组12.640.71 实施例2组13.560.68 实施例3组12.710.65 实施例4组13.420.75 实施例5组13.220.67 对比例1组19.320.81 对比例2组18.520.84 0078 实施例组与模型组相比， #P0.05， #P0.01； 与对比例1组相比， P0.05， 与对 比例2组相比， P0.05。 0079 结果显示： 实施例1-5组血糖浓度与四氧嘧啶模型组比较有极显著差异(p 0.01)， 对比例1-2组与四氧嘧啶模型组比较有显著差异。

27、(p0.05)。 实施例1-5组血糖浓度 与对比例1-2组比较有显著性差异(p0.05)。 结果表明， 本发明制备的刺五加组合物具有 显著的降糖作用， 效果优于公开号CN102579532中实施例产品。 0080 实施例8： 过敏试验对比研究 0081 取实施例1-5所得刺五加有效组分组合物， 制备刺五加注射液。 0082 注射液制备方法： 0083 取实施例3制备所得刺五加有效组分组合物， 加注射用水使溶解， 用40的NaOH溶 液调pH值至5.5， 搅拌均匀后加热， 加入0.2的活性炭， 煮沸吸附15分钟， 冷却至50以下 用40的NaOH溶液调pH值至5.7， 补加新鲜注射用水至含生药5。

28、g/ml。 经0.45 m滤膜过滤至 澄清， 灌装， 115高压灭菌40分钟。 冷冻， 缓化后冷藏20天， 常温放置3.5个月。 经0.65 m滤 芯过滤， 加注射用水至含生药5g/ml， 调pH值至5.0， 加入活性炭脱色， 过滤， 调pH值至5.0， 补 加注射用水至含生药5g/ml， 分别经0.45 m、 0.22 m滤芯精滤， 灌封， 115下30分钟灭菌， 即 得， 分别编号实验组。 0084 对比组： 市售刺五加注射液， 编号对比组。 0085 方法： 取体重250-300g豚鼠24只， 随机分为四组， 每组6只。 0086 阴性对照组： 腹腔注射0.9氯化钠注射液； 0087 阳。

29、性对照组： 腹腔注射5新鲜蛋清溶液。 0088 试验A组： 腹腔注射实验组样品； 0089 试验B组： 腹腔注射对比组市售刺五加注射液。 0090 给药剂量均为0.5ml/只。 隔日一次， 共三次。 首次给药后14天， 21天， 每组随机取2 只， 试验A组和B组分别由耳缘静脉注射实验组样品和对比组市售刺五加注射液； 阴性对照 组注射0.9氯化钠注射液， 阳性对照组注射5新鲜蛋清溶液。 给药剂量均为1.0ml/只。 给 说 明 书 8/9 页 11 CN 106176790 A 11 药后立即观察动物有无喷嚏、 搔鼻、 干咳或咳嗽、 颤抖、 竖毛、 抽搐、 呼吸困难、 大小便失禁、 休克和死亡。

30、的过敏反应， 观察时间为15分钟。 过敏反映分级主要分为0-4级， 其反应症状分 别如下： 0091 0级过敏反映症状： 无明显反应； 0092 1级过敏反映症状： 具有轻微抓鼻、 颤抖或竖毛； 0093 2级过敏反映症状： 有几次咳嗽， 有抓鼻颤抖或竖毛； 0094 3级过敏反映症状： 多次或连续咳嗽， 伴有呼吸困难或痉挛、 抽搐； 0095 4级过敏反映症状： 痉挛、 抽搐、 大小便失禁、 休克、 死亡； 0096 结果判断准则： 如两次豚鼠均无明显反应， 认为受试药物过敏试验合格， 反映级数 达2级以上(包括2级)时， 认为受试药物过敏反映不合格。 0097 试验结果： 注射0.9氯化钠。

31、注射液的阴性对照组的豚鼠过敏反应级数均为0， 无 过敏反应； 注射5蛋清的阳性对照组豚鼠出现喷嚏、 搔鼻、 干呕或咳嗽、 抽搐、 颤抖、 呼吸困 难、 大小便失禁、 休克等过敏反应， 且皆于15min内死亡， 过敏反应级数为4级， 试验条件成 立。 注射实验组样品试验A组的6只豚鼠均无过敏反应， 过敏反应级数均为0。 注射对比组市 售刺五加注射液的试验B组的6只豚鼠中有2只豚鼠出现轻微抓鼻、 竖毛现象， 过敏反应级数 为1。 表明实验组样品的安全性高于市售刺五加注射液。 0098 同时使用实施例2-5制备所得的刺五加有效组分组合物， 制备刺五加注射液， 和市 售刺五加注射液进行本实施例的试验， 从实验结果中得出同样的结论。 0099 应当说明的是， 虽然本发明以较佳实施例揭露如上， 然其并非用以限定本发明， 任 何熟习此项技艺者， 在不脱离本发明的精神和范围内， 所作的任何修改、 等同替换和改进 等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 9/9 页 12 CN 106176790 A 12 。