发明领域
本发明涉及免疫学和免疫刺激领域。尤其是，本发明涉及免 疫刺激核糖核酸，所述免疫刺激核糖核酸的同系物，以及应用所 述免疫刺激核糖核酸及其同系物的方法。本发明的组合物和方法 可用于诱导通过Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体8(TLR8) 的信号传导。
发明背景
免疫反应从概念上可以分为先天性免疫和获得性免疫。先天 性免疫包括对感染性微生物或外源大分子表达的特定类分子共 有的病原体相关的分子模式(PAMP)的识别。
Toll样受体(TLR)是一类高度保守的多肽家族，在哺乳动 物的先天性免疫中具有重要的作用。现在已经鉴别出了十个家族 成员，分别是TLR1-TLR10。不同TLR的细胞质内区域由Toll- 白介素1(IL-1)受体(TIR)区域表征。Medzhitov R et al.(1998) Mol Cell 2：253-8.TLR对微生物侵入的识别引发了信号级联的激 活，这种信号级联在果蝇和哺乳动物中在进化上都是保守的。含 有TIR区域的适应子蛋白MyD88可以与TLR结合，可以向TLR 补充IL-1受体相关激酶(IRAK)以及肿瘤坏死因子(TNF)受 体相关因子6(TRAF6)。依赖于MyD88的信号传导途径可以导 致NF-kB转录因子和c-Jun NH2末端激酶(JnK)有丝分裂素激 活的蛋白激酶(MAPK)的活化，导致免疫激活中的关键步骤以 及炎性细胞因子的产生。其综述参见Aderem A et al.(2000) Nature 406：782-87。
虽然已有关于许多特定TLR配体的报道，然而仍然有许多 TLR的配体尚未识别。TLR2的配体包括肽聚糖和脂蛋白。 Yoshimura A et al.(1999)J Immunol 163：1-5；Yoshimura A et al. (1999)J Immunol 163：1-5；Aliprantis AO et al.(1999)Science 285：736-9.来源于病毒的双链RNA(dsRNA)和poly I：C，一种 dsRNA的合成类似物都是TLR3的配体。Alexopoulou L et al. (2001)Nature 413：732-8.脂多糖(LPS)是一种TLR4的配体。 Poltorak A et al.(1998)Science 282：2085-8；Hoshino K et al.(1999) J Immunol 162：3749-52。细菌鞭毛蛋白是一种TLR5的配体。 Hayashi F et al.(2001)Nature 410：1099-1103。已有报道表明肽聚 糖不仅是TLR2的也是TLR6的配体。Ozinsky A et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97：13766-71；Takeuchi O et al.(2001)Int Immunol 13：933-40.已有报道表明细菌DNA(CpG DNA)是 TLR9的配体。Hemmi H et al.(2000)Nature 408：740-5；Bauer S et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，9237-42.上面列出的TLR 配体包括天然配体，即自然界发现的TLR配体如传染性微生物 表达的分子。
TLR1，TLR7，TLR8和TLR10的天然配体尚不知道，虽然 最近有报道表明低分子量的合成化合物，咪唑并喹诺酮中的咪喹 莫特(R-837)和resiquimod(R-848)是TLR7的配体。Hemmi H et al.(2002)Nat Immunol 3：196-200。
发明简述
本发明部分基于发明人对特定免疫刺激RNA和RNA样(下 文中通称为“RNA”)分子的新发现。发明人认为本发明的免疫 刺激RNA分子的碱基序列包括至少一个鸟嘌呤(G)和至少一个 尿嘧啶(U)，其中任选地，至少一个G可以是G的的变体或同 系物和/或至少一个U可以独立地是U的变体或同系物。令人惊 讶地是，本发明的免疫刺激RNA分子可以是单链的或者是至少 部分双链的。而且本发明的免疫刺激RNA分子不需要CpG就可 以行使其免疫刺激作用。不受任何特定理论或机制的限制，发明 人认为本发明的免疫刺激RNA分子通过依赖于MyD88的途径， 很有可能是通过TLR进行信号传导。而且不受任何特定理论或 机制的限制，发明人认为本发明的免疫刺激RNA分子可与 TLR8，TLR7或一些其他尚未识别的TLR相互作用并通过它们 进行信号传导。
发明人还认为本发明的免疫刺激RNA分子代表了一类自然 界中发现的可以诱导免疫反应的RNA分子。不受任何特定理论 或机制的限制，发明人认为相应的这类自然界中发现的RNA分 子存在于核糖体RNA(rRNA)，转移RNA(tRNA)，信使RNA (mRNA)，和病毒RNA(vRNA)中。从这个意义上说本发明的 免疫刺激RNA可以是5-40个核苷酸长。这样的短RNA分子不 属于可用于转染树突状细胞以诱导对癌症抗原的免疫反应的全 长信使RNA。参见，例如，Boczkowski D et al.(1996)J Exp Med 184：465-72；Mitchell DA et al.(2000)Curr Opin Mol Ther 2：176-81。
本发明还发现本发明的免疫刺激RNA分子可与特定的能提 高RNA稳定性，促进RNA分子在本地聚集，和/或促进RNA分 子向细胞的内体室中运输的试剂组合使用。特别是，本发明发现 从这个意义上来说特定的脂类和/或脂质体是非常有用的。例如， 特定的阳离子脂，特别是包括N-[1-(2，3二油酰基氧)-丙 基]-N，N，N-三甲基铵硫酸二甲酯(DOTAP)，与本发明的免疫刺 激RNA分子组合使用更为有效。在另一个实施例中，胆固醇的 一部分与RNA，例如RNA的3’端之间的共价结合，可以提高该 RNA的免疫刺激效果，甚至是在没有阳离子脂的条件下。
本发明还提供了与本发明的免疫刺激RNA分子相关的组合 物和方法。所述组合物和方法可用于，尤其是，在体内、体外和 离体条件下激活免疫细胞；治疗感染；治疗癌症；制备药物组合 物；识别免疫刺激RNA的靶受体；筛选并表征其它的免疫刺激 化合物。而且，与本发明的免疫刺激RNA分子相关的组合物和 方法可以与其它免疫刺激组合物相关的其它免疫刺激组合物和 方法结合使用。
本发明的一个方面提供了一种免疫刺激组合物。根据本发明 的免疫刺激组合物包括一种分离的5-40个核苷酸长的RNA寡聚 物，其碱基序列具有至少一个鸟嘌呤(G)和至少一个尿嘧啶(U)， 以及可任选的一种阳离子脂。所述RNA寡聚物可以是天然来源 的或者是非天然来源的。天然来源的RNA寡聚物在一个实施方 案中可以是来源于原核生物RNA，在另一个实施方案中可以是 来源于真核生物RNA。此外，天然来源的RNA寡聚物可以包括 一部分核糖体RNA。非天然来源的RNA寡聚物可以包括在细胞 外合成的RNA分子，例如，使用本领域已知的化学方法合成的。 在一个实施方案中，RNA寡聚物可以包括天然来源的RNA寡聚 物的衍生物。
在一个实施方案中，分离的RNA寡聚物是如下所定义的富 含G，U的RNA。
在一个实施方案中，含有G，U的免疫刺激RNA是一种至 少5个核苷酸长的分离的RNA分子，其中包含碱基序列 5’-RURGY-3’，其中R表示嘌呤，U表示尿嘧啶，G表示鸟嘌呤， Y表示嘧啶。在一个实施方案中，含有G，U的免疫刺激RNA 是一种至少5个核苷酸长的分离的RNA分子，其中包含碱基序 列5’-GUAGU-3’，其中A表示腺嘌呤。在一个实施方案中，含 有G，U的免疫刺激RNA是一种分离的RNA分子，其中包含碱 基序列5’-GUAGUGU-3’。
在一个实施方案中，含有G，U的免疫刺激RNA是一种至 少5个核苷酸长的分离的RNA分子，其中包含碱基序列 5’-GUUGB-3’，其中B表示U，G或C。
在一个实施方案中，含有G，U的免疫刺激RNA是一种至 少5个核苷酸长的分离的RNA分子，其中包含碱基序列 5’-GUGUG-3’。
在其它实施方案中，所述分离的RNA分子可以包含多个任 意前述序列，任意前述序列的组合，或者包含多个任意前述序列 的任意前述序列的组合。所述多个序列和组合可以直接连接或者 它们也可以间接连接，即通过插入核苷或序列连接。在一个实施 方案中，插入连接核苷是G；在一个实施方案中，插入连接核苷 是U。
在一个实施方案中，所述碱基序列包括5’-GUGUUUAC-3’。
在另一个实施方案中，所述碱基序列包括 5’-GUAGGCAC-3’。在一个实施方案中，所述碱基序列是 5’-GUAGGCAC-3’。
在另一个实施方案中，所述碱基序列包括 5’-CUAGGCAC-3’。 在一个实施方案中，所述碱基序列是 5’-CUAGGCAC-3’。
在另一个实施方案中，所述碱基序列包括 5’-CUCGGCAC-3’。在一个实施方案中，所述碱基序列是 5’-CUCGGCAC-3’。
在一个实施方案中所述寡聚物是5-12个核苷酸长，在一个实 施方案中所述寡聚物是8-12个核苷酸长。
根据本发明，在一个实施方案中所述碱基序列不含有CpG二 核苷酸。因此在此实施方案中所述免疫刺激RNA不是CpG核酸。
根据本发明，在特定的实施方案中，所述RNA寡聚物的碱 基序列至少是部分自身互补的。在一个实施方案中，自身互补的 程度至少是50％。自身互补的程度可以提高到100％。因此例如， 在不同的实施方案中所述至少部分自身互补的碱基序列可以是 至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或者 100％自身互补。互补碱基对包括鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)，腺嘌呤 -尿嘧啶(A-U)，腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)，以及鸟嘌呤-尿嘧啶 (G-U)。G-U“不稳定”碱基对在核糖体RNA和RNA逆转录病 毒中相当常见，它比传统的G-C，A-T或A-U之间的Watson-Crick 碱基对更为不稳定。部分自身互补的序列可以包括一部分或多个 部分的自身互补序列。在一个涉及部分自身互补序列的实施方案 中，所述RNA寡聚物可以包含位于并包含该寡聚物每一个末端 的自身互补部分。
根据本发明的一个实施方案，所述寡聚物是复杂寡聚物，即 6-40个核苷酸长的复杂RNA寡聚物，其碱基序列含有至少一个 鸟嘌呤(G)和至少一个尿嘧啶(U)。复杂寡聚物可以，但不是 必须，包含与另一个序列至少部分互补的序列。在一个实施方案 中，复杂寡聚物包括一个具有第一种碱基序列的寡聚物和一个具 有第二种碱基序列的寡聚物，其中第一种碱基序列和第二种碱基 序列至少50％互补。因此例如，在不同的实施方案中，所述至少 部分互补的碱基序列可以是至少50％，至少60％，至少70％， 至少80％，至少90％，或者100％自身互补。如上所述，互补碱 基对包括鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)，腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)，腺嘌呤 -胸腺嘧啶(A-T)，以及鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)。部分互补序列可 以包含一个或多个部分的互补序列。在一个涉及部分互补序列的 实施方案中，所述RNA寡聚物可以包含一个位于并包含该寡聚 物至少一个末端的互补部分。
在一个实施方案中，所述寡聚物是包含其碱基序列含有 5’-GUGUUUAC-3’的寡聚物和其碱基序列含有 5’-GUAGGCAC-3’的寡聚物的复杂寡聚物。在一个实施方案中， 所述寡聚物是包含其碱基序列为5’-GUGUUUAC-3’的寡聚物和 其碱基序列为5’-GUAGGCAC-3’的寡聚物的复杂寡聚物。
进一步根据本发明，在不同的实施方案中，所述寡聚物包括 非天然的骨架连接，修饰的碱基，修饰的糖，或其任意组合。非 天然的骨架连接可以是稳定的连接，即一种与磷酸二酯键相比相 对更能抵抗RNA酶或核酸酶降解的连接。在一个实施方案中， 非天然的骨架连接是硫逐磷酸酯连接。所述寡聚物可以包括一个 非天然骨架连接或复杂非天然骨架连接，其中每一个的选择都独 立于其它选择。修饰的碱基可以是修饰的G、U、A或C，包括 本发明的碱基序列中的至少一个G和至少一个U。在一些实施方 案中，修饰的碱基可以选自7-去氮杂鸟嘌呤核苷，8-氮杂鸟嘌呤 核苷，5-甲基尿嘧啶，和假尿嘧啶。所述寡聚物可以包括一个修 饰的碱基或者复杂修饰碱基，其中每一个的选择都独立于其它选 择。修饰的糖可以是甲基化糖，阿拉伯糖。寡聚物可以包含一个 修饰的糖或者复杂修饰糖，其中每一个的选择都独立于其它选 择。
在一个实施方案中，所述阳离子脂是N-[1-(2，3二油酰基氧)- 丙基]-N，N，N-三甲基铵硫酸二甲酯(DOTAP)。DOTAP可以将 RNA寡聚物转运到细胞内，并且可以特异地运输到内体室中， 在其中它可以以依赖于pH值的方式释放RNA寡聚物。一旦进入 到内体室中，RNA就可以和特定的细胞内Toll样受体分子(TLR) 相互作用，引发TLR介导的信号转导途径，产生免疫反应。其 它具有类似性质的试剂，包括可以运输到内体室中的的试剂，可 以代替DOTAP或者与DOTAP一同加入。
在一个实施方案中，所述免疫刺激组合物进一步包括抗原。 在一个实施方案中所述抗原是变态反应原。在一个实施方案中所 述抗原是癌抗原。在一个实施方案中所述抗原是微生物抗原。
而且根据本发明，本发明的另一个实施方案是一种药物组合 物。所述药物组合物包括一种本发明的免疫刺激组合物和一种药 学可接受的载体。还提供了制备所述药物组合物的方法。这种方 法包括使一种本发明的药物组合物与一种药学可接受的载体接 触。所述药物组合物可以配制成方便使用的剂量单位。
本发明的另一个方面提供了一种激活免疫细胞的方法。所述 方法包括使免疫细胞与有效量的能诱导免疫细胞激活的上述免 疫刺激组合物接触。在一个实施方案中，免疫细胞的激活包括免 疫细胞分泌细胞因子。在一个实施方案中，所述细胞因子选自下 组：白介素6(IL-6)，白介素12(IL-12)，干扰素(IFN)，肿瘤 坏死因子(TNF)。在一个实施方案中，所述免疫细胞的激活包 括趋化因子的分泌。在一个实施方案中，所述分泌的趋化因子是 干扰素-γ-诱导蛋白10(IP-10)。在一个实施方案中，所述免疫细 胞的激活包括免疫细胞表达共刺激/辅助分子。在一个实施方案中 所述共刺激/辅助分子选自下组：细胞间粘附分子(ICAM，例如 CD54)，白细胞功能相关抗原(LFA，例如CD58)，B7(CD80， CD86)和CD40。
根据本发明的一个方面，在一个实施方案中，所述免疫细胞 的激活包括依赖于MyD88的信号转导途径的激活。MyD88是一 种可以和不同的Toll样受体(TLR)分子的Toll/白介素-1受体 (TIR)域相互作用，并且参与能最终导致核因子кB(NF-кB) 的激活的信号转导途径的适应子分子。因此在一个实施方案中依 赖于MyD88的信号转导途径是与TLR相关的。更特别地，在一 个实施方案中，TLR是TLR8。在一个实施方案中TLR是TLR7。
根据本发明，在一个实施方案中，所述免疫细胞是人免疫细 胞。在一个实施方案中所述免疫细胞是骨髓树突状细胞。
本发明中在一个实施方案中所述接触发生在体外。在另一个 实施方案中所述接触发生在体内。
本发明的另一个方面提供了一种在患者中诱导免疫反应的 方法。本发明的方法包括给患者施用有效量的能在患者中诱导免 疫反应的本发明的免疫刺激组，合物。应当注意的是，本发明的 方法不包括给患者施用抗原。在一个实施方案中所述患者是人。 在一个实施方案中，所述患者患有癌症或者具有患癌症的危险。 在一个实施方案中，所述患者被选自下组的物质感染或者具有感 染该物质的危险：病毒，细菌，真菌和寄生虫。在一个特定的实 施方案中，患者被病毒感染或具有被病毒感染的危险。应当注意 的是本发明的方法可以用于治疗达到有效的或希望的免疫反的 能力受到抑制的患者。例如，患者由于感染，癌症，急性或慢性 疾病如肾或肝功能不全，外科手术，以及暴露于免疫抑制剂如化 学疗法，放射线，特定的药物之下，或者类似的情况而造成免疫 系统受到抑制。在一个实施方案中，所述患者患有变态反应或哮 喘或者具有其患病危险。这样的患者有可能暴露于与患者体内的 变态反应或哮喘有关的变态反应原之中或者具有暴露危险。
本发明的另一个方面提供了在患者中诱导免疫反应的方法。 本发明的方法包括给患者施用抗原，并且给患者施用有效量的可 以诱导对此抗原的免疫反应的本发明的免疫刺激组合物。应当注 意的是，所述抗原可以在本发明的免疫刺激组合物之前，之后或 与之同时给药。另外，所述抗原和免疫刺激化合物都可以给患者 施用多于一次。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原是一种变态反应原。 在本发明的一个实施方案中所述抗原是一种癌抗原。在一个实施 方案中所述癌抗原可以是分离自患者的癌抗原。在另一个实施方 案中所述抗原是一种微生物抗原。所述微生物抗原可以是一种病 毒、细菌、真菌或者寄生虫抗原。
本发明的另一个方面进一步提供了一种在患者中诱导免疫 反应的方法。本发明的方法包括分离患者的树突状细胞，使该树 突状细胞在离体与本发明的免疫刺激组合物接触，使该树突状细 胞在离体与抗原接触，给患者施用接触过的树突状细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原是一种变态反应原。 在本发明的一个实施方案中所述抗原是一种癌抗原。在一个实施 方案中所述癌抗原可以是分离自患者的癌抗原。在另一个实施方 案中所述抗原是一种微生物抗原。所述微生物抗原可以是一种病 毒、细菌、真菌或者寄生虫抗原。
刺激一种TLR引起的免疫反应可以通过刺激另一个TLR而 被改变，提高或者增强，这种组合的免疫刺激效果可能是相互协 同的。例如，TLR9可以对细菌DNA起反应，更通常的是指CpG DNA。TLR9接触它的天然配体(或任何TLR9配体)所引起的 免疫反应都可以通过选择性地使TLR7与一种TLR7配体接触， 或者选择性地使TLR8与一种TLR8配体接触，或者同时进行两 者而被改变，提高或者增强。同样地，TLR7接触TLR7配体引 起的免疫反应可以通过选择性地使TLR8与一种TLR8配体接触， 或者选择性地使TLR9与CpG DNA(或者任何合适的TLR9配体) 接触，或者同时进行两者而被改变，提高或者增强。在另一个实 施例中，TLR8接触TLR8配体引起的免疫反应可以通过选择性 地使TLR7与一种TLR7配体接触，或者选择性地使TLR9与CpG DNA(或者任何合适的TLR9配体)接触，或者同时进行两者而 被改变，提高或者增强。
本发明是部分基于发明人对TLR7和TLR8的天然配体的新 发现。虽然特定的TLR具有来源于微生物的天然存在的配体， 但是从未没有描述过TLR7和TLR8的天然配体。特定的合成小 分子，咪唑并喹诺酮化合物是TLR7的配体，但是这样的化合物 与本发明的天然配体不同。Hemmi H et al.(2002)Nat Immunol 3：196-200。
分离的TLR7和TLR8的配体可以用作组合物，可以诱导， 提高并且增强免疫反应。TLR7和TLR8的天然配体可用于制备 能够诱导，提高并增强免疫反应的新的组合物。除此之外，TLR7 和TLR8的天然配体可用于选择性地诱导TLR7和TLR8介导的 信号传递，以及选择性地诱导TLR7和TLR8介导的免疫反应。 而且，TLR7和TLR8的天然配体可用于设计和实施识别和选择 免疫刺激化合物的筛选检测。
本发明还部分基于本发明关于人嗜中性粒细胞丰富表达 TLR8的新发现。这种发现非常重要，因为嗜中性粒细胞通常是 应答感染病原的第一种细胞，因此也是初始引起反应的细胞。我 们相信激活的嗜中性粒细胞分泌趋化因子和细胞因子，它们依次 是补充树突状细胞的工具。到达激活的嗜中性粒细胞位置处的表 达TLR9的树突状细胞被激活，从而增强了免疫反应。
本发明还部分基于对在免疫系统的不同细胞中不同TLR的 差异表达的认识，所述TLR包括TLR7，TLR8和TLR9。就TLR7， TLR8和TLR9而言，这种差别在人中具有特别的重要性。由这 些TLR中的任何一个的刺激引起的免疫反应都可以通过另一个 TLR的刺激而提高或增强，这种组合的免疫刺激效果可能是具有 协同作用的。例如，TLR9可以对细菌DNA产生反应，更通常的 是指CpG DNA。由TLR9接触它的天然配体(或任何TLR9配体) 所引起的免疫反应都可以通过选择性地使TLR7与它的天然配体 (或任何合适的TLR7配体)接触，或者选择性地使TLR8与它 的天然配体(或者任何合适的TLR8配体)接触，或者同时进行 两者而得到提高或者增强。同样地，由TLR7接触它的天然配体 (或者任何TLR7配体)引起的免疫反应可以通过选择性地使 TLR8与它的天然配体(或任何合适的TLR8配体)接触，或者 选择性地使TLR9与CpG DNA(或者任何合适的TLR9配体)接 触，或者同时进行两者而得到提高或者增强。在另一个实施例中， 由TLR8接触它的天然配体(或任何合适的TLR8配体)引起的 免疫反应可以通过选择性地使TLR7与它的天然配体(或任何合 适的TLR7配体)接触，或者选择性地使TLR9与CpG DNA(或 者任何合适的TLR9配体)接触，或者同时进行两者而得到提高 或者增强。
本发明的一个方面提供了一种包括有效量的可诱导TLR8信 号传导的TLR8配体以及有效量的可诱导第二种TLR信号传导的 选自下组的第二种TLR的配体的组合物：TLR1，TLR2，TLR3， TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR9和TLR10。在一个实施方案 中，第二种TLR是TLR3。在一种实施方案中，第二种TLR是 TLR7。在一种实施方案中，第二种TLR是TLR9。在一种实施 方案中，TLR8的配体与第二种TLR的配体互相连接。在另一个 实施方案中，所述组合物进一步包括一种药学可接受的载体。
本发明的另一个方面提供了一种包括有效量的可诱导TLR7 信号传导的TLR7配体以及有效量的可诱导第二种TLR信号传导 的选自下组的第二种TLR的配体的组合物：TLR1，TLR2，TLR3， TLR4，TLR5，TLR6，TLR8，TLR9和TLR10。在一个实施方案 中，第二种TLR是TLR3。在一种实施方案中，第二种TLR是 TLR8。在一种实施方案中，第二种TLR是TLR9。在一种实施 方案中，TLR7的配体与第二种TLR的配体互相连接。在另一个 实施方案中，所述组合物进一步包括一种药学可接受的载体。
本发明的另一个方面提供了一种含有DNA∶RNA结合体的组 合物，其中结合体中的DNA包括一种可有效刺激TLR9信号传 导的免疫刺激基序，其中结合体中的RNA包括可有效刺激 TLR3，TLR7，TLR8或其任意组合的信号传导的RNA。在一个 实施例中，可有效刺激TLR9信号传导的免疫刺激基序是一种 CpG基序。在另一个实施方案中，可有效刺激TLR9信号传导的 免疫刺激基序是poly-dT。在另一个实施方案中，可有效刺激 TLR9信号传导的免疫刺激基序是poly-dG。在一个实施方案中， 所述结合体包含一种嵌合DNA∶RNA骨架。在一个实施方案中所 述嵌合骨架在DNA和RNA之间含有切割位点。在一个实施方案 中，所述结合体包括一种双链DNA∶RNA异源双链核酸分子。在 另一个实施方案中，所述组合物进一步包括一种药学可接受的载 体。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR8信号传导的方 法。该方法包括使TLR8与有效量的能刺激TLR8信号传导的分 离RNA接触。在一个实施方案中，所述RNA是双链RNA。在 一个实施方案中，所述RNA是核糖体RNA。在一个实施方案中 所述RNA是转移RNA。在一个实施方案中，所述RNA是信使 RNA。在一个实施方案中，所述RNA是病毒RNA。在一个实施 方案中，所述RNA是富含G，U的RNA。在一个实施方案中， 所述RNA基本由G和U组成。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR8信号传导的方 法。该方法包括使TLR8与一种有效量的能刺激TLR8信号传导 的基本由G和U组成的核苷混合物接触，其中G和U的比例在 1G∶50U到10G∶1U之间。在一个实施方案中，所述核苷是核 糖核苷。在一个实施方案中，所述核苷含有核糖核苷和脱氧核糖 核苷的混合物。在一个实施方案中G是选自下组的鸟嘌呤衍生 物：8-溴代鸟嘌呤核苷，8-氧代鸟嘌呤核苷，8-巯基鸟嘌呤核苷， 7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物，次 黄嘌呤核苷和水粉蕈素。
本发明还提供了一种刺激TLR8信号传导的方法。该方法包 括使TLR8与核糖核苷氧钒基复合物的混合物接触。在一个实施 方案中，所述混合物含有鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR8信号传导的方 法。该方法包括使TLR8与有效量的能刺激TLR8信号传导的分 离的含有选自下组序列的富含G，U的寡核苷酸接触：UUGUGG， UGGUUG，GUGUGU和GGGUUU。在一个实施方案中，所述 寡核苷酸是寡核糖核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是 7-50个碱基长的。在一个实施方案中，所述寡核苷酸是12-24个 碱基长。在一个实施方案中，所述寡核苷酸具有序列 5’-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3’(SEQ ID NO：1)。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR8信号传导的方 法。该方法包括使TLR8与有效量的能刺激TLR8信号传导的含 有至少一个G-U碱基对的至少部分双链的核酸分子接触。
本发明的另一个方面提供了一种增强TLR8-介导的免疫反应 的方法。所述方法包括使TLR8与有效量的TLR8配体接触以诱 导TLR8介导的免疫反应，并且使一种除TLR8以外的TLR与有 效量的所述除TLR8以外的TLR的配体接触，以诱导由所述除 TLR8以外的TLR介导的免疫反应。
本发明的另一个方面提供了一种在患者中增强TLR8介导的 免疫反应的方法。所述方法包括给需要免疫反应的患者施用有效 量的TLR8配体以诱导TLR8介导的免疫反应，并且给患者施用 有效量的除TLR8以外的TLR的配体以诱导所述除TLR8以外的 TLR介导的免疫反应。在一个实施方案中，所述除TLR8以外的 TLR是TLR9。在一个实施方案中，TLR9的配体是一种CpG核 酸。在一个实施方案中所述CpG核酸具有稳定的骨架。在一个 实施方案中，TLR8的配体和TLR9的配体是结合体。在一个实 施方案中，所述结合体含有一个双链DNA∶RNA异源双链核酸分 子。在一个实施方案中，所述结合体含有一个嵌合DNA∶RNA骨 架。在一个实施方案中所述嵌合骨架在DNA和RNA之间含有一 个切割位点。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR7信号传导的方 法。该方法包括使TLR7与一种有效量的能刺激TLR7信号传导 的分离鸟嘌呤核糖核苷接触。在一个实施方案中鸟嘌呤核糖核苷 是一种选自下组的鸟嘌呤核糖核苷衍生物：8-溴代鸟嘌呤核苷， 8-氧代鸟嘌呤核苷，8-巯基鸟嘌呤核苷，7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤 核苷，鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物，次黄嘌呤核苷和水粉蕈素。 在一个实施方案中，所述鸟嘌呤核糖核苷衍生物是8-氧代鸟嘌呤 核苷。在一个实施方案中，所述鸟嘌呤核苷是核糖核苷。在一个 实施方案中所述鸟嘌呤核苷含有核糖核苷和脱氧核糖核苷的混 合物。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR7信号传导的方 法。该方法包括使TLR7与一种有效量的能刺激TLR7信号传导 的含有末端氧化或卤化鸟嘌呤核苷的分离核酸接触。在一个实施 方案中，所述氧化或卤化鸟嘌呤是8-氧代鸟嘌呤核苷。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR7信号传导的方 法。该方法包括使TLR7与有效量的能刺激TLR7信号传导的分 离RNA接触。在一个实施方案中，所述RNA是双链RNA。在 一个实施方案中，所述RNA是核糖体RNA。在一个实施方案中 所述RNA是转移RNA。在一个实施方案中，所述RNA是信使 RNA。在一个实施方案中，所述RNA是病毒RNA。在一个实施 方案中，所述RNA是富含G的RNA。在一个实施方案中所述 RNA是DNA∶RNA异源双链核酸分子的一部分。在一个实施方 案中，所述RNA基本由鸟嘌呤核糖核苷组成。
本发明的另一个方面提供了一种刺激TLR7信号传导的方 法。该方法包括使TLR7与一种有效量的能刺激TLR7信号传导 的基本由G和U组成的核苷混合物接触，其中G和U的比例在 1G∶50U到10G∶1U之间。
本发明还提供了一种刺激TLR7信号传导的方法。该方法包 括使TLR7与核糖核苷氧钒基复合物的混合物接触。在一个实施 方案中，所述混合物含有鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物。
本发明的一个方面进一步提供了一种增强TLR7-介导的免疫 反应的方法。所述方法包括使TLR7与有效量的TLR7配体接触 以诱导TLR7介导的免疫反应，并且使一种除TLR7以外的TLR 与有效量的所述除TLR7以外的TLR的配体接触，以诱导由所述 除TLR7以外的TLR介导的免疫反应。
本发明的另一个方面提供了一种在患者中增强TLR7介导的 免疫反应的方法。所述方法包括给需要免疫反应的患者施用有效 量的TLR7配体以诱导TLR7介导的免疫反应，并且给患者施用 有效量的除TLR7以外的TLR的配体以诱导所述除TLR7以外的 TLR介导的免疫反应。在一个实施方案中，所述除TLR7以外的 TLR是TLR9。在一个实施方案中，TLR9的配体是一种CpG核 酸。在一个实施方案中所述CpG核酸具有稳定的骨架。在一个 实施方案中，TLR7的配体和TLR9的配体是结合体。在一个实 施方案中，所述结合体含有一个双链DNA∶RNA异源双链核酸分 子。在一个实施方案中，所述结合体含有一个嵌合DNA∶RNA骨 架。在一个实施方案中所述嵌合骨架在DNA和RNA之间含有一 个切割位点。
本发明的另一个方面提供了一种筛选候选免疫刺激化合物 的方法。所述方法包括测量TLR8介导的对RNA参考应答的参 考信号，测量TLR8介导的对候选免疫刺激化合物应答的检测信 号，并且比较TLR8介导的检测信号与TLR8介导的参考信号。
本发明的另一个方面提供了一种筛选候选免疫刺激化合物 的方法，包括测量TLR8介导的对咪唑并喹诺酮参考应答的参考 信号，测量TLR8介导的对候选免疫刺激化合物应答的检测信号， 并且比较TLR8介导的检测信号与TLR8介导的参考信号。
本发明的另一个方面提供了一种筛选候选免疫刺激化合物 的方法。所述方法包括测量TLR7介导的对咪唑并喹诺酮参考应 答的参考信号，测量TLR7介导的对候选免疫刺激化合物应答的 检测信号，并且比较TLR7介导的检测信号与TLR7介导的参考 信号。
在一些实施方案中所述咪唑并喹诺酮是resiquimod(R-848)。
在一些实施方案中所述咪唑并喹诺酮是咪喹莫特(R-837)。
本发明进一步提供了一种筛选候选免疫刺激化合物的方法。 所述方法包括测量TLR7介导的对7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷参 考应答的参考信号，测量TLR7介导的对候选免疫刺激化合物应 答的检测信号，并且比较TLR7介导的检测信号与TLR7介导的 参考信号。
本发明的每个限定都包含了本发明的不同实施方案。因此可 以预见本发明的每个包括任何一个特征或特征组合的限定都包 含在本发明的每一个方面中。
附图简述
图1是人外周血单核细胞(PBMC)对特定刺激，包括选定 的含有G，U的RNA寡聚物应答时分泌IL-12p40的条形图，其 中加入DOTAP或者不加DOTAP(分别表示为“含有脂质体”和 “不含脂质体”)，用特异性酶联免疫检测(ELISA)测定。碱基 序列中出现的小写字母“s”表示硫逐磷酸酯连接。
图2是人PBMC对特定刺激，包括选定的含有G，U的RNA 寡核苷酸应答时分泌TNF-的条形图，其中加入DOTAP或者不 加DOTAP(分别表示为“含有脂质体”和“不含脂质体”)，用 特异性ELISA测定。
图3是人PBMC对不同浓度的选定的含有G，U的RNA寡 核苷酸(其中含有DOTAP)应答时分泌IL-12p40的剂量依赖性 条形图，通过特异性ELISA测定。
图4是人PBMC对与RNA寡聚物GUAGGCAC相关的各种 选定的RNA寡核苷酸(其中含有DOTAP)应答时分泌TNF-α 的序列依赖性条形图，通过特异性ELISA测定。
图5是DOTAP对于人PBMC对不同刺激应答时分泌IL-12 p40的效果，通过特异性ELISA测定。
图6是不同类型的鼠巨噬细胞对各种检测和对照免疫刺激化 合物应答时分泌IL-12p40的四重条形图，通过特异性ELISA测 定。A组是存在IFN-时的野生型巨噬细胞；B组是存在IFN-γ 时的MyD88缺陷型巨噬细胞；C组是J774巨噬细胞系；D组是 RAW264.7巨噬细胞系。
图7是人PBMC与来源于HIV-1的RNA序列共培育时分泌 (A)TNF-和(B)IL-12p40的双重条形图，其中含有或不含 DOTAP。圆圈表示5′-GUAGUGUGUG-3′(SEQ ID NO：2)；三 角表示5′-GUCUGUUGUGUG-3′(SEQ ID NO：3)。空心符号表 示含有DOTAP；实心符号表示含有DOTAP。
图8是TLR之间的显著相关性的图解。
图9是TLR7，TLR8，和TLR9的核酸结合域。
图10是人PBMC对严谨反应因子(SRF)的反应性的条形 图。
图11是人PBMC对核糖核苷氧钒基复合物(RVC)的反应 性的条形图。X代表resiquimod。
图12是人TLR7和人TLR8对单个核糖核苷的反应性的系列 三重条形图。X代表resiquimod。
图13是TLR7和TLR8对两个核糖核苷混合物的反应性的系 列三重条形图。
图14是人PBMC对核糖核苷G和U的混合物的反应的条形 图。
图15是人PBMC对富含G，U的RNA而不是DNA寡核苷 酸的反应的条形图。
图16是人PBMC对氧化性DNA的反应的条形图。
图17是人TLR7和TLR8对氧化性鸟嘌呤核糖核苷的反应的 系列三重条形图。X表示resiquimod。
图18是人TLR7对修饰的鸟嘌呤核糖核苷的反应的双重条形 图。
图19是人CD 123+树突状细胞(CD123+DC)，CD11c+DC， 和嗜中性粒细胞上TLR1-TLR9的差异表达的经校准的凝胶图。
图20是短的单链的含G，U的RNA寡聚物在被人TLR7或 人TLR8的表达质粒稳定转染的HEK-293细胞中诱导NF-кB的 能力的系列图。
发明详述
本发明部分涉及发明人对许多可有效作为免疫刺激化合物 的RNA和RNA相关分子的发现。通过系统性效果识别免疫刺激 化合物旨在识别天然存在的TLR7和TLR8的配体。现在发现了 含有鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)的RNA和RNA样分子，包括 含有G和U的特定序列，具有免疫刺激性，并且可以通过依赖 于MyD88的途径发挥作用，预示着其中可能涉及到TLR。引人 注目的是，一些RNA序列具有病毒RNA的5’未翻译区的高度保 守的结构特征，这些特征对于病毒的复制是很重要的。本发明中 所识别的免疫刺激RNA序列也可以是或者近似于其它RNA，包 括来自于细菌和酵母的tRNA，以及来自于细菌的rRNA，以及有 可能是来自于某些真核生物的rRNA。重要的是，本发明的免疫 刺激RNA除了部分或全部的双链RNA之外还包括单链RNA， 其作用可以被RNA酶处理所抑制。如果所述RNA至少是部分双 链的，在一个实施方案中它可以包含一个茎环结构。如下文中的 详细描述，本发明发现单链的5个核苷酸长的富含G，U的RNA 可以刺激免疫细胞产生大量的细胞因子和趋化因子，包括 TNF-α，IL-6，IL-12，1型干扰素(例如IFN-α)，和IP-10。
令人惊讶的是，发明人发现了特定的含有G，U的RNA分 子和它们的类似物，但不是它们的DNA对应物，具有免疫刺激 效果。值得注意的是，本发明的含有G，U的寡核糖核苷酸可以 比先前描述的可用于制备树突状细胞疫苗的信使RNA显著地 小。参见，例如，Boczkowski D et al.(1996)J Exp Med 184： 465-72；Mitchell DA et al.(2000)Curr Opin Mol Ther 2：176-81. 虽然本发明的含有G，U的RNA分子可以是天然存在的核糖体 RNA和/或病毒RNA那样的，但它们也可以是5-40个核苷酸长。 进一步讲，本发明的含有G，U的寡核糖核苷酸包括至少一个G 和至少一个U。令人惊讶的是，从本发明的含有G，U的寡核糖 核苷酸中去掉G或U都会使其免疫刺激效果消失。所述的至少 一个G和至少一个U可以彼此相邻，也可以被插入核苷或序列 隔开。而且，本发明的含有G，U的免疫刺激RNA分子不需要 CpG二核苷酸。
本发明的一个方面提供了一种免疫刺激组合物。本发明的免 疫刺激组合物包括一种分离的5-40个核苷酸长的RNA寡聚物， 所述寡聚物具有的碱基序列具有至少一个鸟嘌呤(G)和至少一 个尿嘧啶(U)。如下文的进一步详细描述，所述其碱基序列具有 至少一个鸟嘌呤(G)和至少一个尿嘧啶(U)的5-40个核苷酸 长的免疫刺激RNA寡聚物可以制备成可稳定抵抗降解RNA寡聚 物，在如脂质体这样的微粒内部或其表面浓缩，和/或靶定递送到 细胞的内体室中。在一种制备方式中，如下文实施例所述，所述 RNA寡聚物可与阳离子脂DOTAP结合，DOTAP可以协助将含 有G，U的寡核糖核苷酸运送到内体室中。因此，本发明的一方 面是包含其碱基序列具有至少一个G和至少一个U的5-40个核 苷酸长的RNA寡聚物和可任选的阳离子脂的免疫刺激组合物。
本发明的RNA寡聚物可以是天然来源的或是非天然来源的。 天然存在的RNA是通常是特定核糖核苷单元的线性聚合物，每 个核糖核苷单元都由嘌呤或嘧啶碱基以及核糖组成，通过核苷间 的磷酸二酯键连接。其中“线性”是描述RNA的初级结构。通 常RNA可以是单链的或双链的，包括部分双链的。
这里所说的“核苷”指一种与可互换的有机碱相连的单独的 糖分子(例如核糖或脱氧核糖)，其中有机碱是取代的嘧啶(例 如胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例 如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。这里所说的核苷可以是天然存 在的核苷，修饰的核苷或者合成的(人工的)核苷。
术语“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，指多核苷酸(即 含有与磷酸基团和可互换的有机碱相连的糖(例如核糖或脱氧核 糖)的分子，其中有机碱是取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)，胸腺 嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或 鸟嘌呤(G))。这里所说的术语既指寡核糖核苷酸也指寡脱氧核 糖核苷酸。该术语还指多核苷(即多核苷酸去掉磷酸基团)以及 任何其它含有有机碱的聚合物。核酸分子可以从现有的核酸源 (例如基因组或cDNA)获得，但是优选是合成的(例如通过核 酸合成产生)。
术语核酸和寡核苷酸也包括具有取代或修饰的核酸或寡核 苷酸，例如在碱基和/或糖上的取代或修饰。例如，它们包括具有 与除3’端羟基和5’端磷酸基团以外的其它低分子量有机基团共 价结合的骨架糖的核酸。因此修饰的核酸可以包含2’-O-烷基化 核糖基团。除此之外，修饰的核酸还可以用糖如阿拉伯糖取代核 糖。因此所述核酸的骨架组成可以是异质的，可以含有任何可能 的聚合物单元与例如肽核酸(具有氨基酸骨架和核酸碱基)相连 的组合。在一些实施方案中，所述核酸的骨架组分是同质的。核 酸还可以包含取代的嘌呤和嘧啶，例如C-5丙炔修饰的碱基。 Wagner R W et al.(1996)Nat Biotechnol 14：840-4.嘌呤和嘧啶 包括但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧 啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤 以及其它天然或非天然存在的核酸碱基，取代和未取代的芳香族 分子。其它的修饰都是本领域所熟知的。
天然的核苷碱基可以被修饰的核苷碱基取代，其中修饰的核 苷碱基例如可以选自次黄嘌呤；二氢尿嘧啶；假尿嘧啶；2-硫尿 嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5-氨基尿嘧啶；5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶； 5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶；5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶；5-(羟甲基)尿嘧啶； 5-氯代尿嘧啶；5-氟代尿嘧啶；5-溴代尿嘧啶；5-羟基胞嘧啶； 5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶；5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶；5-(C2-C6)-炔基胞 嘧啶；5-氯代胞嘧啶；5-氟代胞嘧啶；5-溴代胞嘧啶；N2-二甲基 鸟嘌呤；2，4-二氨基-嘌呤；8-氮杂嘌呤(包括，特别是8-氮杂鸟 嘌呤)；取代的7-二氮杂嘌呤(包括，特别是7-二氮杂鸟嘌呤)， 包括7-二氮杂-7-取代的和/或7-二氮杂-8-取代的嘌呤；或者其它 天然核苷碱基的修饰。此列表只是举例说明而并非是限制本发 明。
特别地，含有G，U的免疫刺激寡核糖核苷酸的至少一个鸟 嘌呤可以是取代的或修饰的鸟嘌呤例如7-二氮杂鸟嘌呤；8-氮杂 鸟嘌呤；7-二氮杂-7-取代的鸟嘌呤(例如7-二氮杂-7-(C2-C6)炔基 鸟嘌呤)；7-二氮杂-8-取代的鸟嘌呤；次黄嘌呤；2，6-二氨基嘌呤； 2-氨基嘌呤；嘌呤；8-取代的嘌呤例如8-羟基鸟嘌呤；和6-硫代 鸟嘌呤。此列表只是举例说明而并非是限制本发明。
而且，含有G，U的免疫刺激寡核糖核苷酸的至少一个尿嘧 啶碱基可以是取代的或修饰的尿嘧啶例如假尿嘧啶和5-甲基尿 嘧啶。
为了在本发明中使用，本发明的核酸可以使用任何本领域公 知的方法合成。例如β-氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage SL et al. (1981)Tetrahedron Lett 22：1859)；核苷H-膦酸盐方法(Garegg et al.(1986)Tetrahedron Lett 27：4051-4；Froehler et al.(1986)Nucl Acid Res 14：5399-407；Garegg et al.(1986)Tetrahedron Lett 27： 4055-8；Gaffney et al.(1988)Tetrahedron Lett 29：2619-22)。这些方 法可以用市场上可获得的各种自动化核酸合成仪实现。这些核酸 指合成的核酸。可选择地，富含T的和/或TG二核苷酸可以利用 质粒大规模生产(参见Sambrook T et al.，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor laboratory Press，New York，1989)，分离成小份施用或者一次性全部施用。核酸可以用 已知的方法利用现有的核酸序列制备(例如基因组或cDNA)， 例如那些使用限制性酶，核酸外切酶或核酸内切酶。用这种方法 制备的核酸是分离的核酸。分离的核酸通常指那些与所述核酸在 天然状态下相结合的组分分离开的核酸。例如，分离的核酸可以 是从细胞中，从核中，从线粒体中或者从染色质中分离出来的。 术语“核酸”同时包括合成的和分离的核酸。
为了在体内使用，所述核酸可任选地相对可抵抗降解(例如 是稳定的)。在一些实施方案中，只有核酸的特定部分可以任选 地是稳定的。“稳定的核酸分子”指在体内相对可抵抗降解(例 如通过核酸外切酶和内切酶)的核酸分子。稳定性可能依赖于长 度或者二级结构。几十到几百kb长的核酸相对可抵抗体内降解。 对于更短的核酸，二级结构可以使之稳定并增强其效果。例如， 如果核酸的3’端与其上游区域互补，则它可以折回去形成一种茎 环结构，该核苷酸从而变得稳定，并显示出更高的活性。
在本发明的特定实施方案中，所述RNA寡聚物的碱基序列 至少是部分自身互补的。这里所说的自身互补是指这样一种序 列，在合适的排列下，可以形成分子内，或者更典型地，形成分 子间的G-C，A-U和/或G-U不稳定碱基对。在一个实施方案中， 自身互补的程度至少是50％。例如一个具有至少50％自身互补 的8聚体可能含有能形成4，5，6，7，或8个G-C，A-U，和/ 或G-U不稳定碱基对。这样的碱基对可以但不必须包括位于自身 互补RNA寡聚物的任何一端的碱基。核酸稳定性对于RNA寡聚 物很重要，它可以通过形成碱基对或者任何其它合适的方法“夹 住”双链核酸的一端或两端。自身互补的程度取决于寡聚物的排 列，这样的排列可能包括或不包括单个或多个悬空核苷。在其它 实施方案中，自身互补的程度是至少60％，至少70％，至少80 ％，至少90％或者甚至100％。应当注意，双链并不是本发明的 RNA寡聚物的必需条件。
对于不同碱基序列的RNA寡核苷酸之间的分子间碱基对也 是类似。因此在同时使用复杂RNA寡聚物的时候，复杂寡聚物 可以但不必须包括至少与另一个序列部分互补的序列。在一个实 施方案中，复杂寡聚物包括一个具有第一种碱基序列的寡聚物和 一个具有第二种碱基序列的寡聚物，其中第一种碱基序列和第二 种碱基序列至少50％互补。例如，在两个至少50％互补的8聚 体之间可以形成4，5，6，7或8个G-C，A-U，和/或G-U不稳 定碱基对。这样的碱基对可以但不必须包括位于互补RNA寡聚 物的任何一端的碱基。互补的程度取决于寡聚物之间的排列，这 样的排列可以包括或不包含单个或多个悬空核苷。在其它实施方 案中，互补的程度是至少60％，至少70％，至少80％，至少90 ％，或者甚至100％。
可选择地，核酸稳定性可以通过磷酸骨架的修饰获得。本发 明的优选稳定核酸具有修饰的骨架。现已证明核酸骨架的修饰增 强了所述核酸在体内给药时的活性。一类修饰的骨架是磷酸骨架 修饰。免疫刺激核酸在寡核苷酸的5’端含有至少两个硫逐磷酸酯 连接，在3’端含有多个(优选5个)硫逐磷酸酯连接，在某些情 况下，这样可以获得最高活性并且可以保护核酸不被细胞内的核 酸外切和内切酶降解。其它修饰核酸包括磷酸二酯键修饰的核 酸，磷酸二酯键和硫逐磷酸酯连接组合的核酸，膦酸烷基酯和膦 酸芳基酯，硫逐磷酸烷基酯和硫逐磷酸芳基酯，膦酸甲酯，硫逐 磷酸甲酯，二硫代磷酸酯，对乙氧，吗啉代及其组合。具有硫逐 磷酸酯连接的核酸具有最大活性并可保护该核酸不受细胞内核 酸外切和内切酶的降解。每种组合及它们对于免疫细胞的特定效 果都已在美国专利No.6,207,646和6,239,116中就CpG核酸进 行了详细描述，在此引入其全文作为参考。相信这些修饰的核酸 由于具有增强的核酸酶抵抗力，增强的细胞吸收，增强的蛋白结 合，和/或改变的细胞内定位而显示出更高的刺激活性。
修饰的骨架例如硫逐磷酸酯可以利用氨基磷酸酯或H-膦酸 盐方法使用自动化技术合成。可以制备磷酸芳基酯和磷酸烷基 酯，例如，如美国专利No.4,469,863中所述；磷酸烷基三酯(其 中带电荷的氧分子被烷基化，如美国专利No.5,023,243和欧洲 专利No.092,574中所述)可以使用商业可获得的试剂用自动化 固相合成法制备。制备其它DNA骨架修饰和替代的方法另有描 述。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990) Bioconjugate Chem 1：165.
其它稳定核酸包括：非离子DNA类似物，例如磷酸烷基酯 和磷酸芳基酯(其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基取代)，膦 酸二酯和膦酸烷基三酯，其中带电荷的氧分子被烷基化。含有二 醇，例如三水缩四乙二醇或三水缩六乙二醇的核酸，在其一端或 两端都显示出对核酸酶降解的显著抗性。
另一类骨架修饰包括2′-O-甲基核糖核苷(2′-OMe)。这类替 换在现有技术中已有描述，特别是在Zhao et al.(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：24：3453-8中描述了它们的免疫刺激性质。Zhao et al描述了制备核酸的2′-OMe修饰的方法。
本发明的含有G，U的免疫刺激RNA寡聚物典型地是大约5 个到大约40个核苷酸长。因此在特定的实施方案中，含有G，U 的RNA寡聚物可以是5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29， 30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或者40个核苷酸 长。在一个实施方案中含有G，U的RNA寡聚物可以是5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个核 苷酸长。在一个实施方案中含有G，U的RNA寡聚物可以是5， 6，7，8，9，10，11，或12个核苷酸长。在一个实施方案中 含有G，U的RNA寡聚物可以是8，9，10，11，或12个核苷酸 长。
例如，已发现具有下述碱基序列的RNA寡聚物可用于本发 明的组合物和方法：5’-GUGUUUAC-3’；5’-GUAGGCAC-3’； 5’-CUAGGCAC-3’；5’-CUCGGCAC-3’；和5’-GUGUUUAC-3’ 与5’-GUAGGCAC-3’的组合。
由于已经发现本发明的含有G，U的寡聚物的免疫刺激效果 是依赖于MyD88的，发明人相信本发明的含有G，U的免疫刺 激RNA寡聚物在行使其免疫刺激作用的时候可能与至少一个 TLR相互作用。本发明的含有G，U的免疫刺激RNA寡聚物可 能代表了至少一个TLR的至少一部分天然配体或者与其类似。 这样的天然配体包括核糖体RNA，其是来自原核的或是来自真 核的，以及特定的病毒RNA。TLR可以是TLR8，TLR7，或者 有待确定的TLR。TLR1，TLR7，TLR8和TLR10的天然配体以 前未有描述。
已发现本发明的免疫刺激RNA分子是以所有RNA类型天然 存在的，通常与高度保守序列或关键结构特征相结合。在一个实 施例中，发现免疫刺激RNA存在于内部核糖体进入位点(IRES) 附近。
IRES是一种包含在病毒RNA以及其它以不依赖于帽子方式 调控病毒基因组的转录起始的mRNA的5’未翻译区(5’UTR)的 复杂结构特征中的最小顺式作用RNA元件。Hellen CU et al. (2001)Genes Dev 15：1593-1612.不依赖于帽子的病毒RNA翻译 起始最初是在细小核糖核酸病毒中观察到的。Jackson RJ et al. (1990)Trends Biochem Sci 15：477-83；Jackson RJ et al.(1995) RNA 1：985-1000.
在大多数真核细胞中，mRNA翻译的起始是从帽子结合复合 体真核起始因子(eIF)4F，由eIF4E(帽结合蛋白)，eIF4A和 eIF4G组成，结合到mRNA的5’帽子端开始。然后40S核糖体亚 基，携带着eIF3，和三元起始复合物tRNA-eIF2-GTP通过eIF3 和eIF4G之间的相互作用结合到mRNA的5’端。然后40S亚基 按5′到3′的方向扫描mRNA直到遇到合适的起始密码子，在此加 入起始甲硫氨酸-tRNA的反密码子，然后60S亚基加入形成80S 核糖体，然后转录开始。
因此IRES的重要性，至少在病毒中，就是IRES给予了病毒 一种选择性的优势，而不使用细胞中的依赖于帽子结构的翻译。
下述病毒在其基因组中具有IRES元件：所有的细小核糖核 酸病毒；牛病毒性腹泻病毒；传统猪瘟病毒；蟋蟀麻痹病毒；脑 心肌炎病毒；口蹄疫病毒；弗里德鼠白血病毒gag mRNA；HCV； 人免疫缺陷病毒env mRNA；与卡波氏肉瘤相关的疱疹病毒； Moloney鼠白血病毒gag mRNA；Plautia stali肠病毒；脊髓灰质 炎病毒；鼻病毒；禾谷缢管蚜病毒；和劳氏肉瘤病毒；Hellen CU et al.(2001)Genes Dev 15：1593-1612.此列表并非是限制本发 明。
丙型肝炎病毒(HCV)的病毒蛋白是由一段其侧翼是5’和3’ UTR的9.5kb的单链正义RNA翻译而来的。高度保守的5’UTR 在第40-370位核苷酸处含有一个IRES。Reynolds JE et al.(1996) RNA 2：867-78.HCV的5′UTR具有四个主要的结构域(I-IV)， 其中结构域II和III还具有子域，体内突变研究表明子域IIId包 括一个27个核苷酸的茎环(核苷酸253-279)，这对HCV IRES 介导的翻译是很关键的。Kieft JS et al.(1999)J Mol Biol 292： 513-29；Klinck R et al.(2000)RNA 6：1423-31.IIId的27聚体的 序列是5′-GCCGAGUAGUGUUGGGUCGCGAAAGGC-3′(SEQ ID NO：4)，其中UUGGGU构成了末端环。茎环结构包括许多 非Watson-Crick的碱基对，主要是其它RNA，包括不稳定的UоG， UоA，GоA和AоA碱基对。
在另一个实施例中，本发明的免疫刺激RNA序列是1型人 免疫缺陷病毒(HIV-1)的病毒RNA的5’端附近的富含G，U的 序列，它对于病毒RNA的包装非常重要。Russell RS et al.(2002) Virology 303：152-63.特别是本发明发现在U5内有两个关键的 富含G，U的序列，分别是5′-GUAGUGUGUG-3′(SEQ ID NO：2) 和5′-GUCUGUUGUGUG-3′(SEQ ID NO：3)，分别相应于BH10 株的第99-108位核苷酸和第112-123位核苷酸，具有很高的免疫 刺激性(参见下述实施例11)。应当注意的是SEQ ID NO：2同时 含有GUAGU和GUGUG，SEQ ID NO：3含有GUGUG。
在另一个实施例中，本发明的免疫刺激RNA序列存在于很 多细菌的5S核糖体RNA的环E中。
TLR8和TLR7与TLR9显示出高的序列同源性(图8)。TLR9 是CpG-DNA受体，可转导免疫刺激信号。TLR9中有两个DNA 结合基序(美国专利申请No.09/954,987)，其在TLR8和TLR7 中也存在，并具有一些修饰(图9)。尽管存在相似性，但是， TLR7和TLR8不能结合CpG-DNA。
本发明已经发现鸟嘌呤核苷，特别是鸟嘌呤核苷与尿嘧啶结 合，以及特定的含有鸟嘌呤核苷的核酸及其衍生物，是TLR8的 天然配体。本发明已经发现RNA，氧化性RNA，富含G，U的 核苷酸，以及具有至少一个G-U碱基对的至少部分双链的核苷酸 分子都是TLR8的配体。在特定的涉及鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷 衍生物，和富含G，U的核苷酸的优选实施方案中，鸟嘌呤核苷 是核糖核苷。含有GUU，GUG，GGU，GGG，UGG，UGU，UUG， UUU，其多个或任意组合的核苷酸分子都是TLR8的配体。在一 些实施方案中，TLR8的配体是富含G，U的寡核苷酸，其中包 含六聚体序列(UUGUGG)n，(UGGUUG)n，(GUGUGU)n，或者 (GGGUUU)n，其中n是1至8的整数，优选n是至少3。除此之 外，本发明还发现核糖核苷氧钒基复合物的混合物(即腺嘌呤， 胞嘧啶，鸟嘌呤核苷和尿嘧啶核糖核苷氧钒基复合物的混合物) 和单独的鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物都是TLR8的配体。此外， 本发明发现特定的咪唑并喹诺酮，包括resiquimod和咪喹莫特是 TLR8的配体。
本发明还发现鸟嘌呤核苷和特定的含有鸟嘌呤核苷的核苷 酸及其衍生物是TLR7的天然配体。本发明发现RNA，氧化性 RNA，富含G的核苷酸，以及富含G的至少部分双链的核苷酸 分子都是TLR7的配体。在特定的涉及鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷 衍生物，和富含G的核苷酸的优选实施方案中，鸟嘌呤核苷是核 糖核苷。除此之外，本发明还发现核糖核苷氧钒基复合物的混合 物(即腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤核苷和尿嘧啶核糖核苷氧钒基复 合物的混合物)和单独的鸟嘌呤核糖核苷氧钒基复合物都是 TLR7的配体。本发明发现7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷(洛索立 宾)是TLR7的配体。
除了具有不同的配体之外，不同的TLR在不同的组织中和不 同类型的免疫细胞上的表达也具有差异，人TLR7在胎盘，肺， 脾，淋巴结，扁桃腺中以及浆细胞前体树突状细胞(pDC)上表 达。Chuang T-H et al.(2000)Eur Cytokine Netw 11：372-8)； Kadowaki N et al.(2001)J Exp Med 194：863-9.人TLR8在肺，外 周血白细胞(PBL)，胎盘，脾，淋巴结中，以及单核细胞上表 达。Kadowaki N et al.(2001)J Exp Med 194：863-9；Chuang T-H et al.(2000)Eur Cytokine Netw 11：372-8.人TLR9在脾，淋巴结， 骨髓，PBL中以及pDC，B细胞和CD123+DC上表达。Kadowaki N et al.(2001)J Exp Med 194：863-9；Bauer S et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：9237-42；Chuang T-H et al.(2000)Eur Cytokine Netw 11：372-8.
先前已有报道认为鸟嘌呤核苷衍生物是B细胞和NK细胞的 激活剂，但是还不了解它们的受体和作用机制。Goodman MG et al. (1994)JPharm Exp Ther 274：1552-57；Reitz AB et al.(1994)JMed Chem 37：3561-78.这样的鸟嘌呤核苷衍生物包括但不限于8-溴 代鸟嘌呤核苷，8-氧代鸟嘌呤核苷，8-巯基鸟嘌呤核苷，和7- 烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷(洛索立宾)。
咪唑基喹啉是合成的小分子免疫反应调节剂，可诱导几种细 胞因子的表达，包括干扰素(例如IFN-α和IFN-γ)，肿瘤坏死因 子α(TNF-α)和一些白介素(例如IL-1，IL-6和IL-12)。咪唑 基喹啉可以刺激Th1免疫反应，这个结论部分依据其诱导IgG2a 水平增高的能力。咪唑基喹啉试剂还可以抑制Th2细胞因子如 IL-4，IL-5和IL-13的产生。一些由咪唑基喹啉诱导的细胞因子 是由巨噬细胞和树突状细胞产生的。一些种类的咪唑基喹啉可以 增加NK细胞的胞溶活性，可以刺激B细胞增殖和分化，因此可 以诱导抗体的产生和分泌。
这里所说的咪唑基喹啉试剂包括咪唑基喹啉胺，咪唑基吡啶 胺，6，7-稠和环烷基咪唑基吡啶胺，和1，2桥接咪唑基喹啉胺。 这些化合物在美国专利申请No.4689338，4929624，5238944， 5266575，5268376，5346905，5352784，5389640，5395937， 5494916，5482936，5525612，6039969和6110929中有描述。特 定种类的咪唑基喹啉试剂包括4-氨基-α，α-二甲基-2-乙氧基甲基 -1H-咪唑基[4，5-c]喹啉-1-乙醇(resiquimod或R-848或S-28463， PCT/US01/28764，WO 02/22125)；和1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑基 [4，5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特或R-837或S-26308)。目前咪喹莫特 用于疣例如生殖器疣和肛门疣的局部治疗，也已检验了其用于基 底细胞癌的局部治疗。
人和鼠TLR3的核苷酸以及氨基酸序列是已知的。参见 GenBank Accession No.U88879，NM003265，NM_126166， AF355152；和AAC34134，NP_003256，NP_569054，AAK26117。 人TLR3有904个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：20所示。相应 的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。鼠TLR3有905个氨基酸， 其序列如SEQ ID NO：22所示。相应的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。TLR3多肽含有一个具有富含亮氨酸的重复区域的 胞外域，一个转膜域，和一个含有TLR域的胞内域。
这里所说的“TLR3多肽”指含有根据上述序列的全长TLR3， 直系同源体，等位变体，SNP，经保守性氨基酸取代的变体，TLR3 融合蛋白，以及上述各序列的功能性片段的多肽。优选的实施方 案包括与SEQ ID NO：20的人TLR3氨基酸序列具有至少65％序 列相同性，更优选地具有至少80％序列相同性，更优选地具有至 少90％序列相同性，最优选地具有至少95％序列相同性的人 TLR3多肽。优选的实施方案还包括与SEQ ID NO：22的鼠TLR3 氨基酸序列具有至少65％序列相同性，更优选地具有至少80％ 序列相同性，更优选地具有至少90％序列相同性，最优选地具有 至少95％序列相同性的鼠TLR3多肽。
这里所说的“TLR3信号传导”指TLR3多肽激活TLR/IL-1R (TIR)信号传导途径的能力，也指TLR信号传导途径。TLR3 活性的变化可以这里所公开的检测方法测量得到，包括在对B 敏感的启动子和增强子控制下的基因表达。这种天然存在的基因 包括编码IL-1β，IL-6，IL-8，干扰素12的p40亚基(IL-12p40)， 以及共刺激分子CD80和CD86。其它基因可以在这样的调控元 件(见下文)的控制之下报道TLR3信号传导的水平。还可以向 SEQ ID NO：21或者SEQ ID NO：23中加入额外的核苷酸序列，优 选是向SEQ ID NO：21的开放阅读框架的5’或3’端加入，从而产 生编码嵌合多肽的核苷酸序列，其中包括一种可检测的或者报道 子分子，例如FLAG，荧光素酶(luc)，绿色荧光蛋白(GFP)， 以及其它本领域公知的分子。
SEQ ID NO：20 人TLR3氨基酸序列
MRQTLPCIYF WGGLLPFGML CASSTTKCTV SHEVADCSHL KLTQVPDDLP TNITVLNLTH 60
NQLRRLPAAN FTRYSQLTSL DVGFNTISKL EPELCQKLPM LKVLNLQHNE LSQLSDKTFA 120
FCTNLTELHL MSNSIQKIKN NPFVKQKNLI TLDLSHNGLS STKLGTQVQL ENLQELLLSN 180
NKIQALKSEE LDIFANSSLK KLELSSNQIK EFSPGCFHAI GRLFGLFLNN VQLGPSLTEK 240
LCLELANTSI RNLSLSNSQL STTSNTTFLG LKWTNLTMLD LSYNNLNVVG NDSFAWLPQL 300
EYFFLEYNNI QHLFSHSLHG LFNVRYLNLK RSFTKQSISL ASLPKIDDFS FQWLKCLEHL 360
NMEDNDIPGI KSNMFTGLIN LKYLSLSNSF TSLRTLTNET FVSLAHSPLH ILNLTKNKIS 420
KIESDAFSWL GHLEVLDLGL NEIGQELTGQ EWRGLENIFE IYLSYNKYLQ LTRNSFALVP 480
SLQRLMLRRV ALKNVDSSPS PFQPLRNLTI LDLSNNNIAN INDDMLEGLE KLEILDLQHN 540
NLARLWKHAN PGGPIYFLKG LSHLHILNLE SNGFDEIPVE VFKDLFELKI IDLGLNNLNT 600
LPASVFNNQV SLKSLNLQKN LITSVEKKVF GPAFRNLTEL DMRFNPFDCT CESIAWFVNW 660
INETHTNIPE LSSHYLCNTP PHYHGFPVRL FDTSSCKDSA PFELFFMINT SILLIFIFIV 720
LLIHFEGWRI SFYWNVSVHR VLGFKEIDRQ TEQFEYAAYI IHAYKDKDWV WEHFSSMEKE 780
DQSLKFCLEE RDFEAGVFEL EAIVNSIKRS RKIIFVITHH LLKDPLCKRF KVHHAVQQAI 840
EQNLDSIILV FLEEIPDYKL NHALCLRRGM FKSHCILNWP VQKERIGAFR HKLQVALGSK 900
NSVH 904
SEQ ID NO：21 人TLR3核苷酸序列
cactttcgag agtgccgtct atttgccaca cacttccctg atgaaatgtc tggatttgga 60
ctaaagaaaa aaggaaaggc tagcagtcat ccaacagaat catgagacag actttgcctt 120
gtatctactt ttgggggggc cttttgccct ttgggatgct gtgtgcatcc tccaccacca 180
agtgcactgt tagccatgaa gttgctgact gcagccacct gaagttgact caggtacccg 240
atgatctacc cacaaacata acagtgttga accttaccca taatcaactc agaagattac 300
cagccgccaa cttcacaagg tatagccagc taactagctt ggatgtagga tttaacacca 360
tctcaaaact ggagccagaa ttgtgccaga aacttcccat gttaaaagtt ttgaacctcc 420
agcacaatga gctatctcaa ctttctgata aaacctttgc cttctgcacg aatttgactg 480
aactccatct catgtccaac tcaatccaga aaattaaaaa taatcccttt gtcaagcaga 540
agaatttaat cacattagat ctgtctcata atggcttgtc atctacaaaa ttaggaactc 600
aggttcagct ggaaaatctc caagagcttc tattatcaaa caataaaatt caagcgctaa 660
aaagtgaaga actggatatc tttgccaatt catctttaaa aaaattagag ttgtcatcga 720
atcaaattaa agagttttct ccagggtgtt ttcacgcaat tggaagatta tttggcctct 780
ttctgaacaa tgtccagctg ggtcccagcc ttacagagaa gctatgtttg gaattagcaa 840
acacaagcat tcggaatctg tctctgagta acagccagct gtccaccacc agcaatacaa 900
ctttcttggg actaaagtgg acaaatctca ctatgctcga tctttcctac aacaacttaa 960
atgtggttgg taacgattcc tttgcttggc ttccacaact agaatatttc ttcctagagt 1020
ataataatat acagcatttg ttttctcact ctttgcacgg gcttttcaat gtgaggtacc 1080
tgaatttgaa acggtctttt actaaacaaa gtatttccct tgcctcactc cccaagattg 1140
atgatttttc ttttcagtgg ctaaaatgtt tggagcacct taacatggaa gataatgata 1200
ttccaggcat aaaaagcaat atgttcacag gattgataaa cctgaaatac ttaagtctat 1260
ccaactcctt tacaagtttg cgaactttga caaatgaaac atttgtatca cttgctcatt 1320
ctcccttaca catactcaac ctaaccaaga ataaaatctc aaaaatagag agtgatgctt 1380
tctcttggtt gggccaccta gaagtacttg acctgggcct taatgaaatt gggcaagaac 1440
tcacaggcca ggaatggaga ggtctagaaa atattttcga aatctatctt tcctacaaca 1500
agtacctgca gctgactagg aactcctttg ccttggtccc aagccttcaa cgactgatgc 1560
tccgaagggt ggcccttaaa aatgtggata gctctccttc accattccag cctcttcgta 1620
acttgaccat tctggatcta agcaacaaca acatagccaa cataaatgat gacatgttgg 1680
agggtcttga gaaactagaa attctcgatt tgcagcataa caacttagca cggctctgga 1740
aacacgcaaa ccctggtggt cccatttatt tcctaaaggg tctgtctcac ctccacatcc 1800
ttaacttgga gtccaacggc tttgacgaga tcccagttga ggtcttcaag gatttatttg 1860
aactaaagat catcgattta ggattgaata atttaaacac acttccagca tctgtcttta 1920
ataatcaggt gtctctaaag tcattgaacc ttcagaagaa tctcataaca tccgttgaga 1980
agaaggtttt cgggccagct ttcaggaacc tgactgagtt agatatgcgc tttaatccct 2040
ttgattgcac gtgtgaaagt attgcctggt ttgttaattg gattaacgag acccatacca 2100
acatccctga gctgtcaagc cactaccttt gcaacactcc acctcactat catgggttcc 2160
cagtgagact ttttgataca tcatcttgca aagacagtgc cccctttgaa ctctttttca 2220
tgatcaatac cagtatcctg ttgattttta tctttattgt acttctcatc cactttgagg 2280
gctggaggat atctttttat tggaatgttt cagtacatcg agttcttggt ttcaaagaaa 2340
tagacagaca gacagaacag tttgaatatg cagcatatat aattcatgcc tataaagata 2400
aggattgggt ctgggaacat ttctcttcaa tggaaaagga agaccaatct ctcaaatttt 2460
gtctggaaga aagggacttt gaggcgggtg tttttgaact agaagcaatt gttaacagca 2520
tcaaaagaag cagaaaaatt atttttgtta taacacacca tctattaaaa gacccattat 2580
gcaaaagatt caaggtacat catgcagttc aacaagctat tgaacaaaat ctggattcca 2640
ttatattggt tttccttgag gagattccag attataaact gaaccatgca ctctgtttgc 2700
gaagaggaat gtttaaatct cactgcatct tgaactggcc agttcagaaa gaacggatag 2760
gtgcctttcg tcataaattg caagtagcac ttggatccaa aaactctgta cattaaattt 2820
atttaaatat tcaattagca aaggagaaac tttctcaatt taaaaagttc tatggcaaat 2880
ttaagttttc cataaaggtg ttataatttg tttattcata tttgtaaatg attatattct 2940
atcacaatta catctcttct aggaaaatgt gtctccttat ttcaggccta tttttgacaa 3000
ttgacttaat tttacccaaa ataaaacata taagcacgta aaaaaaaaaa aaaaaaa 3057
SEQ ID NO：22 鼠TLR3氨基酸序列
MKGCSSYLMY SFGGLLSLWI LLVSSTNQCT VRYNVADCSH LKLTHIPDDL PSNITVLNLT 60
HNQLRRLPPT NFTRYSQLAI LDAGFNSISK LEPELCQILP LLKVLNLQHN ELSQISDQTF 120
VFCTNLTELD LMSNSIHKIK SNPFKNQKNL IKLDLSHNGL SSTKLGTGVQ LENLQELLLA 180
KNKILALRSE ELEFLGNSSL RKLDLSSNPL KEFSPGCFQT IGKLFALLLN NAQLNPHLTE 240
KLCWELSNTS IQNLSLANNQ LLATSESTFS GLKWTNLTQL DLSYNNLHDV GNGSFSYLPS 300
LRYLSLEYNN IQRLSPRSFY GLSNLRYLSL KRAFTKQSVS LASHPNIDDF SFQWLKYLEY 360
LNMDDNNIPS TKSNTFTGLV SLKYLSLSKT FTSLQTLTNE TFVSLAHSPL LTLNLTKNHI 420
SKIANGTFSW LGQLRILDLG LNEIEQKLSG QEWRGLRNIF EIYLSYNKYL QLSTSSFALV 480
PSLQRLMLRR VALKNVDISP SPFRPLRNLT ILDLSNNNIA NINEDLLEGL ENLEILDFQH 540
NNLARLWKRA NPGGPVNFLK GLSHLHILNL ESNGLDEIPV GVFKNLFELK SINLGLNNLN 600
KLEPFIFDDQ TSLRSLNLQK NLITSVEKDV FGPPFQNLNS LDMRFNPFDC TCESISWFVN 660
WINQTHTNIF ELSTHYLCNT PHHYYGFPLK LFDTSSCKDS APFELLFIIS TSMLLVFILV 720
VLLIHIEGWR ISFYWNVSVH RILGFKEIDT QAEQFEYTAY IIHAHKDRDW VWEHFSPMEE 780
QDQSLKFCLE ERDFEAGVLG LEAIVNSIKR SRKIIFVITH HLLKDPLCRR FKVHHAVQQA 840
IEQNLDSIIL IFLQNIPDYK LNHALCLRRG MFKSHCILNW PVQKERINAF HHKLQVALGS 900
RNSAH 904
SEQ ID NO：23 鼠TLR3核苷酸序列
tagaatatga tacagggatt gcacccataa tctgggctga atcatgaaag ggtgttcctc 60
ttatctaatg tactcctttg ggggactttt gtccctatgg attcttctgg tgtcttccac 120
aaaccaatgc actgtgagat acaacgtagc tgactgcagc catttgaagc taacacacat 180
acctgatgat cttccctcta acataacagt gttgaatctt actcacaacc aactcagaag 240
attaccacct accaacttta caagatacag ccaacttgct atcttggatg caggatttaa 300
ctccatttca aaactggagc cagaactgtg ccaaatactc cctttgttga aagtattgaa 360
cctgcaacat aatgagctct ctcagatttc tgatcaaacc tttgtcttct gcacgaacct 420
gacagaactc gatctaatgt ctaactcaat acacaaaatt aaaagcaacc ctttcaaaaa 480
ccagaagaat ctaatcaaat tagatttgtc tcataatggt ttatcatcta caaagttggg 540
aacgggggtc caactggaga acctccaaga actgctctta gcaaaaaata aaatccttgc 600
gttgcgaagt gaagaacttg agtttcttgg caattcttct ttacgaaagt tggacttgtc 660
atcaaatcca cttaaagagt tctccccggg gtgtttccag acaattggca agttattcgc 720
cctcctcttg aacaacgccc aactgaaccc ccacctcaca gagaagcttt gctgggaact 780
ttcaaacaca agcatccaga atctctctct ggctaacaac cagctgctgg ccaccagcga 840
gagcactttc tctgggctga agtggacaaa tctcacccag ctcgatcttt cctacaacaa 900
cctccatgat gtcggcaacg gttccttctc ctatctccca agcctgaggt atctgtctct 960
ggagtacaac aatatacagc gtctgtcccc tcgctctttt tatggactct ccaacctgag 1020
gtacctgagt ttgaagcgag catttactaa gcaaagtgtt tcacttgctt cacatcccaa 1080
cattgacgat ttttcctttc aatggttaaa atatttggaa tatctcaaca tggatgacaa 1140
taatattcca agtaccaaaa gcaatacctt cacgggattg gtgagtctga agtacctaag 1200
tctttccaaa actttcacaa gtttgcaaac tttaacaaat gaaacatttg tgtcacttgc 1260
tcattctccc ttgctcactc tcaacttaac gaaaaatcac atctcaaaaa tagcaaatgg 1320
tactttctct tggttaggcc aactcaggat acttgatctc ggccttaatg aaattgaaca 1380
aaaactcagc ggccaggaat ggagaggtct gagaaatata tttgagatct acctatccta 1440
taacaaatac ctccaactgt ctaccagttc ctttgcattg gtccccagcc ttcaaagact 1500
gatgctcagg agggtggccc ttaaaaatgt ggatatctcc ccttcacctt tccgccctct 1560
tcgtaacttg accattctgg acttaagcaa caacaacata gccaacataa atgaggactt 1620
gctggagggt cttgagaatc tagaaatcct ggattttcag cacaataact tagccaggct 1680
ctggaaacgc gcaaaccccg gtggtcccgt taatttcctg aaggggctgt ctcacctcca 1740
catcttgaat ttagagtcca acggcttaga tgaaatccca gtcggggttt tcaagaactt 1800
attcgaacta aagagcatca atctaggact gaataactta aacaaacttg aaccattcat 1860
ttttgatgac cagacatctc taaggtcact gaacctccag aagaacctca taacatctgt 1920
tgagaaggat gttttcgggc cgccttttca aaacctgaac agtttagata tgcgcttcaa 1980
tccgttcgac tgcacgtgtg aaagtatttc ctggtttgtt aactggatca accagaccca 2040
cactaatatc tttgagctgt ccactcacta cctctgtaac actccacatc attattatgg 2100
cttccccctg aagcttttcg atacatcatc ctgtaaagac agcgccccct ttgaactcct 2160
cttcataatc agcaccagta tgctcctggt ttttatactt gtggtactgc tcattcacat 2220
cgagggctgg aggatctctt tttactggaa tgtttcagtg catcggattc ttggtttcaa 2280
ggaaatagac acacaggctg agcagtttga atatacagcc tacataattc atgcccataa 2340
agacagagac tgggtctggg aacatttctc cccaatggaa gaacaagacc aatctctcaa 2400
attttgccta gaagaaaggg actttgaagc aggcgtcctt ggacttgaag caattgttaa 2460
tagcatcaaa agaagccgaa aaatcatttt cgttatcaca caccatttat taaaagaccc 2520
tctgtgcaga agattcaagg tacatcacgc agttcagcaa gctattgagc aaaatctgga 2580
ttcaattata ctgatttttc tccagaatat tccagattat aaactaaacc atgcactctg 2640
tttgcgaaga ggaatgttta aatctcattg catcttgaac tggccagttc agaaagaacg 2700
gataaatgcc tttcatcata aattgcaagt agcacttgga tctcggaatt cagcacatta 2760
aactcatttg aagatttgga gtcggtaaag ggatagatcc aatttataaa ggtccatcat 2820
gaatctaagt tttacttgaa agttttgtat atttatttat atgtatagat gatgatatta 2880
catcacaatc caatctcagt tttgaaatat ttcggcttat ttcattgaca tctggtttat 2940
tcactccaaa taaacacatg ggcagttaaa aacatcctct attaatagat tacccattaa 3000
ttcttgaggt gtatcacagc tttaaagggt tttaaatatt tttatataaa taagactgag 3060
agttttataa atgtaatttt ttaaaactcg agtcttactg tgtagctcag aaaggcctgg 3120
aaattaatat attagagagt catgtcttga acttatttat ctctgcctcc ctctgtctcc 3180
agagtgttgc ttttaagggc atgtagcacc acacccagct atgtacgtgt gggattttat 3240
aatgctcatt tttgagacgt ttatagaata aaagataatt gcttttatgg tataaggcta 3300
cttgaggtaa 3310
人和鼠TLR7的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如 GenBank Accession No.AF240467，AF245702，Nu016562， AF334942，NM_133211；和AAF60188，AAF78035，NP_057646， AAL73191，AAL73192。人TLR7有1049个氨基酸，其序列如 SEQ ID NO：24所示。相应的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。 鼠TLR7有1050个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：26所示。相应 的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。TLR7多肽含有一个具有富 含亮氨酸的重复区域的胞外域，一个转膜域，和一个含有TLR 域的胞内域。
这里所说的“TLR7多肽”指含有根据上述序列的全长TLR7， 直系同源体，等位变体，SNP，保守性氨基酸取代的变体，TLR7 融合蛋白，以及上述各序列的功能性片段的多肽。优选的实施方 案包括与SEQ ID NO：24的人TLR7氨基酸序列具有至少65％序 列相同性，更优选地具有至少80％序列相同性，更优选地具有至 少90％序列相同性，最优选地具有至少95％序列相同性的人 TLR7多肽。优选的实施方案还包括与SEQ ID NO：26的鼠TLR7 氨基酸序列具有至少65％序列相同性，更优选地具有至少80％ 序列相同性，更优选地具有至少90％序列相同性，最优选地具有 至少95％序列相同性的鼠TLR7多肽。
这里所说的“TLR7信号传导”指TLR7多肽激活TLR/IL-1R (TIR)信号传导途径的能力，也指TLR信号传导途径。TLR7 活性的变化可以这里所公开的检测方法测量得到，包括在对kB 敏感的启动子和增强子控制下的基因表达。这种天然存在的基因 包括编码IL-1β，IL-6，IL-8，干扰素12的p40亚基(IL-12p40)， 以及共刺激分子CD80和CD86。其它基因可以在这样的调控元 件(见下文)的控制之下报道TLR7信号传导的水平。还可以向 SEQ ID NO：25或者SEQ ID NO：27中加入额外的核苷酸序列，优 选是向SEQ ID NO：25的开放阅读框架的5’或3’端加入，从而产 生编码嵌合多肽的核苷酸序列，其中包括一种可检测的或者报道 子分子，例如FLAG，荧光素酶(luc)，绿色荧光蛋白(GFP)， 以及其它本领域公知的分子。
SEQ ID NO：24 人TLR7氨基酸序列
MVFPMWTLKR QILILFNIIL ISKLLGARWF PKTLPCDVTL DVPKNHVIVD CTDKHLTEIP 60
GGIPTNTTNL TLTINHIPDI SPASFHRLDH LVEIDFRCNC VPIPLGSKNN MCIKRLQIKP 120
RSFSGLTYLK SLYLDGNQLL EIPQGLPPSL QLLSLEANNI FSIRKENLTE LANIEILYLG 180
QNCYYRNPCY VSYSIEKDAF LNLTKLKVLS LKDNNVTAVP TVLPSTLTEL YLYNNMIAKI 240
QEDDFNNLNQ LQILDLSGNC PRCYNAPFPC APCKNNSPLQ IPVNAFDALT ELKVLRLHSN 300
SLQHVPPRWF KNINKLQELD LSQNFLAKEI GDAKFLHFLP SLIQLDLSFN FELQVYRASM 360
NLSQAFSSLK SLKILRIRGY VFKELKSFNL SPLHNLQNLE VLDLGTNFIK IANLSMFKQF 420
KRLKVIDLSV NKISPSGDSS EVGFCSNART SVESYEPQVL EQLHYFRYDK YARSCRFKNK 480
EASFMSVNES CYKYGQTLDL SKNSIFFVKS SDFQHLSFLK CLNLSGNLIS QTLNGSEFQP 540
LAELRYLDFS NNRLDLLHST AFEELHKLEV LDISSNSHYF QSEGITHMLN FTKNLKVLQK 600
LMMNDNDISS STSRTMESES LRTLEFRGNH LDVLWREGDN RYLQLFKNLL KLEELDISKN 660
SLSFLPSGVF DGMPPNLKNL SLAKNGLKSF SWKKLQCLKN LETLDLSHNQ LTTVPERLSN 720
CSRSLKNLIL KNNQIRSLTK YFLQDAFQLR YLDLSSNKIQ MIQKTSFPEN VLNNLKMLLL 780
HHNRFLCTCD AVWFVWWVNH TEVTIPYLAT DVTCVGPGAH KGQSVISLDL YTCELDLTNL 840
ILFSLSISVS LFLMVMMTAS HLYFWDVWYI YHFCKAKIKG YQRLISPDCC YDAFIVYDTK 900
DPAVTEWVLA ELVAKLEDPR EKHFNLCLEE RDWLPGQPVL ENLSQSIQLS KKTVFVMTDK 960
YAKTENFKIA FYLSHQRLMD EKVDVIILIF LEKPFQKSKF LQLRKRLCGS SVLEWPTNPQ 1020
AHPYFWQCLK NALATDNHVA YSQVFKETV 1049
SEQ ID NO：25 人TLR7核苷酸序列
actccagata taggatcact ccatgccatc aagaaagttg atgctattgg gcccatctca 60
agctgatctt ggcacctctc atgctctgct ctcttcaacc agacctctac attccatttt 120
ggaagaagac taaaaatggt gtttccaatg tggacactga agagacaaat tcttatcctt 180
tttaacataa tcctaatttc caaactcctt ggggctagat ggtttcctaa aactctgccc 240
tgtgatgtca ctctggatgt tccaaagaac catgtgatcg tggactgcac agacaagcat 300
ttgacagaaa ttcctggagg tattcccacg aacaccacga acctcaccct caccattaac 360
cacataccag acatctcccc agcgtccttt cacagactgg accatctggt agagatcgat 420
ttcagatgca actgtgtacc tattccactg gggtcaaaaa acaacatgtg catcaagagg 480
ctgcagatta aacccagaag ctttagtgga ctcacttatt taaaatccct ttacctggat 540
ggaaaccagc tactagagat accgcagggc ctcccgccta gcttacagct tctcagcctt 600
gaggccaaca acatcttttc catcagaaaa gagaatctaa cagaactggc caacatagaa 660
atactctacc tgggccaaaa ctgttattat cgaaatcctt gttatgtttc atattcaata 720
gagaaagatg ccttcctaaa cttgacaaag ttaaaagtgc tctccctgaa agataacaat 780
gtcacagccg tccctactgt tttgccatct actttaacag aactatatct ctacaacaac 840
atgattgcaa aaatccaaga agatgatttt aataacctca accaattaca aattcttgac 900
ctaagtggaa attgccctcg ttgttataat gccccatttc cttgtgcgcc gtgtaaaaat 960
aattctcccc tacagatccc tgtaaatgct tttgatgcgc tgacagaatt aaaagtttta 1020
cgtctacaca gtaactctct tcagcatgtg cccccaagat ggtttaagaa catcaacaaa 1080
ctccaggaac tggatctgtc ccaaaacttc ttggccaaag aaattgggga tgctaaattt 1140
ctgcattttc tccccagcct catccaattg gatctgtctt tcaattttga acttcaggtc 1200
tatcgtgcat ctatgaatct atcacaagca ttttcttcac tgaaaagcct gaaaattctg 1260
cggatcagag gatatgtctt taaagagttg aaaagcttta acctctcgcc attacataat 1320
cttcaaaatc ttgaagttct tgatcttggc actaacttta taaaaattgc taacctcagc 1380
atgtttaaac aatttaaaag actgaaagtc atagatcttt cagtgaataa aatatcacct 1440
tcaggagatt caagtgaagt tggcttctgc tcaaatgcca gaacttctgt agaaagttat 1500
gaaccccagg tcctggaaca attacattat ttcagatatg ataagtatgc aaggagttgc 1560
agattcaaaa acaaagaggc ttctttcatg tctgttaatg aaagctgcta caagtatggg 1620
cagaccttgg atctaagtaa aaatagtata ttttttgtca agtcctctga ttttcagcat 1680
ctttctttcc tcaaatgcct gaatctgtca ggaaatctca ttagccaaac tcttaatggc 1740
agtgaattcc aacctttagc agagctgaga tatttggact tctccaacaa ccggcttgat 1800
ttactccatt caacagcatt tgaagagctt cacaaactgg aagttctgga tataagcagt 1860
aatagccatt attttcaatc agaaggaatt actcatatgc taaactttac caagaaccta 1920
aaggttctgc agaaactgat gatgaacgac aatgacatct cttcctccac cagcaggacc 1980
atggagagtg agtctcttag aactctggaa ttcagaggaa atcacttaga tgttttatgg 2040
agagaaggtg ataacagata cttacaatta ttcaagaatc tgctaaaatt agaggaatta 2100
gacatctcta aaaattccct aagtttcttg ccttctggag tttttgatgg tatgcctcca 2160
aatctaaaga atctctcttt ggccaaaaat gggctcaaat ctttcagttg gaagaaactc 2220
cagtgtctaa agaacctgga aactttggac ctcagccaca accaactgac cactgtccct 2280
gagagattat ccaactgttc cagaagcctc aagaatctga ttcttaagaa taatcaaatc 2340
aggagtctga cgaagtattt tctacaagat gccttccagt tgcgatatct ggatctcagc 2400
tcaaataaaa tccagatgat ccaaaagacc agcttcccag aaaatgtcct caacaatctg 2460
aagatgttgc ttttgcatca taatcggttt ctgtgcacct gtgatgctgt gtggtttgtc 2520
tggtgggtta accatacgga ggtgactatt ccttacctgg ccacagatgt gacttgtgtg 2580
gggccaggag cacacaaggg ccaaagtgtg atctccctgg atctgtacac ctgtgagtta 2640
gatctgacta acctgattct gttctcactt tccatatctg tatctctctt tctcatggtg 2700
atgatgacag caagtcacct ctatttctgg gatgtgtggt atatttacca tttctgtaag 2760
gccaagataa aggggtatca gcgtctaata tcaccagact gttgctatga tgcttttatt 2820
gtgtatgaca ctaaagaccc agctgtgacc gagtgggttt tggctgagct ggtggccaaa 2880
ctggaagacc caagagagaa acattttaat ttatgtctcg aggaaaggga ctggttacca 2940
gggcagccag ttctggaaaa cctttcccag agcatacagc ttagcaaaaa gacagtgttt 3000
gtgatgacag acaagtatgc aaagactgaa aattttaaga tagcatttta cttgtcccat 3060
cagaggctca tggatgaaaa agttgatgtg attatcttga tatttcttga gaagcccttt 3120
cagaagtcca agttcctcca gctccggaaa aggctctgtg ggagttctgt ccttgagtgg 3180
ccaacaaacc cgcaagctca cccatacttc tggcagtgtc taaagaacgc cctggccaca 3240
gacaatcatg tggcctatag tcaggtgttc aaggaaacgg tctagccctt ctttgcaaaa 3300
cacaactgcc tagtttacca aggagaggcc tggctgttta aattgttttc atatatatca 3360
caccaaaagc gtgttttgaa attcttcaag aaatgagatt gcccatattt caggggagcc 3420
accaacgtct gtcacaggag ttggaaagat ggggtttata taatgcatca agtcttcttt 3480
cttatctctc tgtgtctcta tttgcacttg agtctctcac ctcagctcct gtaaaagagt 3540
ggcaagtaaa aaacatgggg ctctgattct cctgtaattg tgataattaa atatacacac 3600
aatcatgaca ttgagaagaa ctgcatttct acccttaaaa agtactggta tatacagaaa 3660
tagggttaaa aaaaactcaa gctctctcta tatgagacca aaatgtacta gagttagttt 3720
agtgaaataa aaaaccagtc agctggccgg gcatggtggc tcatgcttgt aatcccagca 3780
ctttgggagg ccgaggcagg tggatcacga ggtcaggagt ttgagaccag tctggccaac 3840
atggtgaaac cccgtctgta ctaaaaatac aaaaattagc tgggcgtggt ggtgggtgcc 3900
tgtaatccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggaggtggag 3960
gtggcagtga gccgagatca cgccactgca atgcagcccg ggcaacagag ctagactgtc 4020
tcaaaagaac aaaaaaaaaa aaacacaaaa aaactcagtc agcttcttaa ccaattgctt 4080
ccgtgtcatc cagggcccca ttctgtgcag attgagtgtg ggcaccacac aggtggttgc 4140
tgcttcagtg cttcctgctc tttttccttg ggcctgcttc tgggttccat agggaaacag 4200
taagaaagaa agacacatcc ttaccataaa tgcatatggt ccacctacaa atagaaaaat 4260
atttaaatga tctgccttta tacaaagtga tattctctac ctttgataat ttacctgctt 4320
aaatgttttt atctgcactg caaagtactg tatccaaagt aaaatttcct catccaatat 4380
ctttcaaact gttttgttaa ctaatgccat atatttgtaa gtatctgcac acttgataca 4440
gcaacgttag atggttttga tggtaaaccc taaaggagga ctccaagagt gtgtatttat 4500
ttatagtttt atcagagatg acaattattt gaatgccaat tatatggatt cctttcattt 4560
tttgctggag gatgggagaa gaaaccaaag tttatagacc ttcacattga gaaagcttca 4620
gttttgaact tcagctatca gattcaaaaa caacagaaag aaccaagaca ttcttaagat 4680
gcctgtactt tcagctgggt ataaattcat gagttcaaag attgaaacct gaccaatttg 4740
ctttatttca tggaagaagt gatctacaaa ggtgtttgtg ccatttggaa aacagcgtgc 4800
atgtgttcaa gccttagatt ggcgatgtcg tattttcctc acgtgtggca atgccaaagg 4860
ctttacttta cctgtgagta cacactatat gaattatttc caacgtacat ttaatcaata 4920
agggtcacaa attcccaaat caatctctgg aataaataga gaggtaatta aattgctgga 4980
gccaactatt tcacaacttc tgtaagc 5007
SEQ ID NO：26 鼠TLR7氨基酸序列
MVFSMWTRKR QILIFLNMLL VSRVFGFRWF PKTLPCEVKV NIPEAHVIVD CTDKHLTEIP 60
EGIPTNTTNL TLTINHIPSI SPDSFRRLNH LEEIDLRCNC VPVLLGSKAN VCTKRLQIRP 120
GSFSGLSDLK ALYLDGNQLL EIPQDLPSSL HLLSLEANNI FSITKENLTE LVNIETLYLG 180
QNCYYRNPCN VSYSIEKDAF LVMRNLKVLS LKDNNVTAVP TTLPPNLLEL YLYNNIIKKI 240
QENDFNNLNE LQVLDLSGNC PRCYNVPYPC TPCENNSPLQ IHDNAFNSLT ELKVLRLHSN 300
SLQHVPPTWF KNMRNLQELD LSQNYLAREI EEAKFLHFLP NLVELDFSFN YELQVYHASI 360
TLPHSLSSLE NLKILRVKGY VFKELKNSSL SVLHKLPRLE VLDLGTNFIK IADLNIFKHF 420
ENLKLIDLSV NKISPSEESR EVGFCPNAQT SVDRHGPQVL EALHYFRYDE YARSCRFKNK 480
EPPSFLPLNA DCHIYGQTLD LSRNNIFFIK PSDFQHLSFL KCLNLSGNTI GQTLNGSELW 540
PLRELRYLDF SNNRLDLLYS TAFEELQSLE VLDLSSNSHY FQAEGITHML NFTKKLRLLD 600
KLMMNDNDIS TSASRTMESD SLRILEFRGN HLDVLWRAGD NRYLDFFKNL FNLEVLDISR 660
NSLNSLPPEV FEGMPPNLKN LSLAKNGLKS FFWDRLQLLK HLEILDLSHN QLTKVPERLA 720
NCSKSLTTLI LKHNQIRQLT KYFLEDALQL RYLDISSNKI QVIQKTSFPE NVLNNLEMLV 780
LHHNRFLCNC DAVWFVWWVN HTDVTIPYLA TDVTCVGPGA HKGQSVISLD LYTCELDLTN 840
LILFSVSISS VLFLMVVMTT SHLFFWDMWY IYYFWKAKIK GYQHLQSMES CYDAFIVYDT 900
KNSAVTEWVL QELVAKLEDP REKHFNLCLE ERDWLPGQPV LENLSQSIQL SKKTVFVMTQ 960
KYAKTESFKM AFYLSHQRLL DEKVDVIILI FLEKPLQKSK FLQLRKRLCR SSVLEWPANP 1020
QAHPYFWQCL KNALTTDNHV AYSQMFKETV 1050
SEQ ID NO：27 鼠TLR7核苷酸序列
attctcctcc accagacctc ttgattccat tttgaaagaa aactgaaaat ggtgttttcg 60
atgtggacac ggaagagaca aattttgatc tttttaaata tgctcttagt ttctagagtc 120
tttgggtttc gatggtttcc taaaactcta ccttgtgaag ttaaagtaaa tatcccagag 180
gcccatgtga tcgtggactg cacagacaag catttgacag aaatccctga gggcattccc 240
actaacacca ccaatcttac ccttaccatc aaccacatac caagcatctc tccagattcc 300
ttccgtaggc tgaaccatct ggaagaaatc gatttaagat gcaattgtgt acctgttcta 360
ctggggtcca aagccaatgt gtgtaccaag aggctgcaga ttagacctgg aagctttagt 420
ggactctctg acttaaaagc cctttacctg gatggaaacc aacttctgga gataccacag 480
gatctgccat ccagcttaca tcttctgagc cttgaggcta acaacatctt ctccatcacg 540
aaggagaatc taacagaact ggtcaacatt gaaacactct acctgggtca aaactgttat 600
tatcgaaatc cttgcaatgt ttcctattct attgaaaaag atgctttcct agttatgaga 660
aatttgaagg ttctctcact aaaagataac aatgtcacag ctgtccccac cactttgcca 720
cctaatttac tagagctcta tctttataac aatatcatta agaaaatcca agaaaatgat 780
tttaataacc tcaatgagtt gcaagttctt gacctaagtg gaaattgccc tcgatgttat 840
aatgtcccat atccgtgtac accgtgtgaa aataattccc ccttacagat ccatgacaat 900
gctttcaatt cattgacaga attaaaagtt ttacgtttac acagtaattc tcttcagcat 960
gtgcccccaa catggtttaa aaacatgaga aacctccagg aactagacct ctcccaaaac 1020
tacttggcca gagaaattga ggaggccaaa tttttgcatt ttcttcccaa ccttgttgag 1080
ttggattttt ctttcaatta tgagctgcag gtctaccatg catctataac tttaccacat 1140
tcactctctt cattggaaaa cttgaaaatt ctgcgtgtca aggggtatgt ctttaaagag 1200
ctgaaaaact ccagtctttc tgtattgcac aagcttccca ggctggaag ttcttgacctt 1260
ggcactaact tcataaaaat tgctgacctc aacatattca aacattttga aaacctcaaa 1320
ctcatagacc tttcagtgaa taagatatct ccttcagaag agtcaagaga agttggcttt 1380
tgtcctaatg ctcaaacttc tgtagaccgt catgggcccc aggtccttga ggccttacac 1440
tatttccgat acgatgaata tgcacggagc tgcaggttca aaaacaaaga gccaccttct 1500
ttcttgcctt tgaatgcaga ctgccacata tatgggcaga ccttagactt aagtagaaat 1560
aacatatttt ttattaaacc ttctgatttt cagcatcttt cattcctcaa atgcctcaac 1620
ttatcaggaa acaccattgg ccaaactctt aatggcagtg aactctggcc gttgagagag 1680
ttgcggtact tagacttctc caacaaccgg cttgatttac tctactcaac agcctttgaa 1740
gagctccaga gtcttgaagt tctggatcta agtagtaaca gccactattt tcaagcagaa 1800
ggaattactc acatgctaaa ctttaccaag aaattacggc ttctggacaa actcatgatg 1860
aatgataatg acatctctac ttcggccagc aggaccatgg aaagtgactc tcttcgaatt 1920
ctggagttca gaggcaacca tttagatgtt ctatggagag ccggtgataa cagatacttg 1980
gacttcttca agaatttgtt caatttagag gtattagata tctccagaaa ttccctgaat 2040
tccttgcctc ctgaggtttt tgagggtatg ccgccaaatc taaagaatct ctccttggcc 2100
aaaaatgggc tcaaatcttt cttttgggac agactccagt tactgaagca tttggaaatt 2160
ttggacctca gccataacca gctgacaaaa gtacctgaga gattggccaa ctgttccaaa 2220
agtctcacaa cactgattct taagcataat caaatcaggc aattgacaaa atattttcta 2280
gaagatgctt tgcaattgcg ctatctagac atcagttcaa ataaaatcca ggtcattcag 2340
aagactagct tcccagaaaa tgtcctcaac aatctggaga tgttggtttt acatcacaat 2400
cgctttcttt gcaactgtga tgctgtgtgg tttgtctggt gggttaacca tacagatgtt 2460
actattccat acctggccac tgatgtgact tgtgtaggtc caggagcaca caaaggtcaa 2520
agtgtcatat cccttgatct gtatacgtgt gagttagatc tcacaaacct gattctgttc 2580
tcagtttcca tatcatcagt cctctttctt atggtagtta tgacaacaag tcacctcttt 2640
ttctgggata tgtggtacat ttattatttt tggaaagcaa agataaaggg gtatcagcat 2700
ctgcaatcca tggagtcttg ttatgatgct tttattgtgt atgacactaa aaactcagct 2760
gtgacagaat gggttttgca ggagctggtg gcaaaattgg aagatccaag agaaaaacac 2820
ttcaatttgt gtctagaaga aagagactgg ctaccaggac agccagttct agaaaacctt 2880
tcccagagca tacagctcag caaaaagaca gtgtttgtga tgacacagaa atatgctaag 2940
actgagagtt ttaagatggc attttatttg tctcatcaga ggctcctgga tgaaaaagtg 3000
gatgtgatta tcttgatatt cttggaaaag cctcttcaga agtctaagtt tcttcagctc 3060
aggaagagac tctgcaggag ctctgtcctt gagtggcctg caaatccaca ggctcaccca 3120
tacttctggc agtgcctgaa aaatgccctg accacagaca atcatgtggc ttatagtcaa 3180
atgttcaagg aaacagtcta gctctctgaa gaatgtcacc acctaggaca tgccttgaat 3240
cga 3243
人和鼠TLR8的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如 GenBank Accession No.AF246971，AF245703，NM_016610， XM_045706，AY035890，NM_133212；和AAF64061，AAF78036， NP_057694，XP_045706，AAK62677，NP_573475。人TLR8存 在至少两种异构体，一种有1041个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：28所示，另一种有1059个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：30 所示。相应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30 所示。这两种异构体中较短的一个较为重要。鼠TLR8有1032 个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：32所示。相应的核苷酸序列如 SEQ ID NO：33所示。TLR8多肽含有一个具有富含亮氨酸的重复 区域的胞外域，一个转膜域，和一个含有TLR域的胞内域。
这里所说的“TLR8多肽”指含有根据上述序列的全长TLR8， 直系同源体，等位变体，SNP，经保守性氨基酸置换的变体，TLR8 融合蛋白，以及上述各序列的功能性片段的多肽。优选的实施方 案包括与SEQ ID NO：28的人TLR8氨基酸序列具有至少65％序 列相同性，更优选地具有至少80％序列相同性，更优选地具有至 少90％序列相同性，最优选地具有至少95％序列相同性的人 TLR8多肽。优选的实施方案还包括与SEQ ID NO：32的鼠TLR8 氨基酸序列具有至少65％序列相同性，更优选地具有至少80％ 序列相同性，更优选地具有至少90％序列相同性，最优选地具有 至少95％序列相同性的鼠TLR8多肽。
这里所说的“TLR8信号传导”指TLR8多肽激活TLR/IL-1R (TIR)信号传导途径的能力，也指TLR信号传导途径。TLR8 活性的变化可以这里所公开的检测方法测量得到，包括在对B 敏感的启动子和增强子控制下的基因表达。这种天然存在的基因 包括编码IL-1β，IL-6，IL-8，干扰素12的p40亚基(IL-12p40)， 以及共刺激分子CD80和CD86。其它基因可以在这样的调控元 件(见下文)的控制之下报道TLR8信号传导的水平。还可以向 SEQ ID NO：29或者SEQ ID NO：33中加入额外的核苷酸序列，优 选是向SEQ ID NO：29的开放阅读框架的5’或3’端加入，从而产 生编码嵌合多肽的核苷酸序列，其中包括一种可检测的或者报道 子分子，例如FLAG，荧光素酶(luc)，绿色荧光蛋白(GFP)， 以及其它本领域公知的分子。
SEQ ID NO：28 人TLR8氨基酸序列(1041)
MENMFLQSSM LTCIFLLISG SCELCAEENF SRSYPCDEKK QNDSVIAECS NRRLQEVPQT 60
VGKYVTELDL SDNFITHITN ESFQGLQNLT KINLNHNPNV QHQNGNPGIQ SNGLNITDGA 120
FLNLKNLREL LLEDNQLPQI PSGLPESLTE LSLIQNNIYN ITKEGISRLI NLKNLYLAWN 180
CYFNKVCEKT NIEDGVFETL TNLELLSLSF NSLSHVPPKL PSSLRKLFLS NTQIKYISEE 240
DFKGLINLTL LDLSGNCPRC FNAPFPCVPC DGGASINIDR FAFQNLTQLR YLNLSSTSLR 300
KINAAWFKNM PHLKVLDLEF NYLVGEIASG AFLTMLPRLE ILDLSFNYIK GSYPQHINIS 360
RNFSKLLSLR ALHLRGYVFQ ELREDDFQPL MQLPNLSTIN LGINFIKQID FKLFQNFSNL 420
EIIYLSENRI SPLVKDTRQS YANSSSFQRH IRKRRSTDFE FDPESNFYHF TRPLIKPQCA 480
AYGKALDLSL NSIFFIGPNQ FENLPDIACL NLSANSNAQV LSGTEFSAIP HVKYLDLTNN 540
RLDFDNASAL TELSDLEVLD LSYNSHYFRI AGVTHHLEFI QNFTNLKVLN LSHNNIYTLT 600
DKYNLESKSL VELVFSGNRL DILWNDDDNR YISIFKGLKN LTRLDLSLNR LKHIPNEAFL 660
NLPASLTELH INDNMLKFFN WTLLQQFPRL ELLDLRGNKL LFLTDSLSDF TSSLRTLLLS 720
HNRISHLPSG FLSEVSSLKH LDLSSNLLKT INKSALETKT TTKLSMLELH GNPFECTCDI 780
GDFRRWMDEH LNVKIPRLVD VICASPGDQR GKSIVSLELT TCVSDVTAVI LFFFTFFITT 840
MVMLAALAHH LFYWDVWFIY NVCLAKVKGY RSLSTSQTFY DAYISYDTKD ASVTDWVINE 900
LRYHLEESRD KNVLLCLEER DWDPGLAIID NLMQSINQSK KTVFVLTKKY AKSWNFKTAF 960
YLALQRLMDE NMDVIIFILL EPVLQHSQYL RLRQRICKSS ILQWPDNPKA EGLFWQTLRN 1020
VVLTENDSRY NNMYVDSIKQ Y 1041
SEQ ID NO：29 人TLR8核苷酸序列
ttctgcgctg ctgcaagtta cggaatgaaa aattagaaca acagaaacat ggaaaacatg 60
ttccttcagt cgtcaatgct gacctgcatt ttcctgctaa tatctggttc ctgtgagtta 120
tgcgccgaag aaaatttttc tagaagctat ccttgtgatg agaaaaagca aaatgactca 180
gttattgcag agtgcagcaa tcgtcgacta caggaagttc cccaaacggt gggcaaatat 240
gtgacagaac tagacctgtc tgataatttc atcacacaca taacgaatga atcatttcaa 300
gggctgcaaa atctcactaa aataaatcta aaccacaacc ccaatgtaca gcaccagaac 360
ggaaatcccg gtatacaatc aaatggcttg aatatcacag acggggcatt cctcaaccta 420
aaaaacctaa gggagttact gcttgaagac aaccagttac cccaaatacc ctctggtttg 480
ccagagtctt tgacagaact tagtctaatt caaaacaata tatacaacat aactaaagag 540
ggcatttcaa gacttataaa cttgaaaaat ctctatttgg cctggaactg ctattttaac 600
aaagtttgcg agaaaactaa catagaagat ggagtatttg aaacgctgac aaatttggag 660
ttgctatcac tatctttcaa ttctctttca cacgtgccac ccaaactgcc aagctcccta 720
cgcaaacttt ttctgagcaa cacccagatc aaatacatta gtgaagaaga tttcaaggga 780
ttgataaatt taacattact agatttaagc gggaactgtc cgaggtgctt caatgcccca 840
tttccatgcg tgccttgtga tggtggtgct tcaattaata tagatcgttt tgcttttcaa 900
aacttgaccc aacttcgata cctaaacctc tctagcactt ccctcaggaa gattaatgct 960
gcctggttta aaaatatgcc tcatctgaag gtgctggatc ttgaattcaa ctatttagtg 1020
ggagaaatag cctctggggc atttttaacg atgctgcccc gcttagaaat acttgacttg 1080
tcttttaact atataaaggg gagttatcca cagcatatta atatttccag aaacttctct 1140
aaacttttgt ctctacgggc attgcattta agaggttatg tgttccagga actcagagaa 1200
gatgatttcc agcccctgat gcagcttcca aacttatcga ctatcaactt gggtattaat 1260
tttattaagc aaatcgattt caaacttttc caaaatttct ccaatctgga aattatttac 1320
ttgtcagaaa acagaatatc accgttggta aaagataccc ggcagagtta tgcaaatagt 1380
tcctcttttc aacgtcatat ccggaaacga cgctcaacag attttgagtt tgacccacat 1440
tcgaactttt atcatttcac ccgtccttta ataaagccac aatgtgctgc ttatggaaaa 1500
gccttagatt taagcctcaa cagtattttc ttcattgggc caaaccaatt tgaaaatctt 1560
cctgacattg cctgtttaaa tctgtctgca aatagcaatg ctcaagtgtt aagtggaact 1620
gaattttcag ccattcctca tgtcaaatat ttggatttga caaacaatag actagacttt 1680
gataatgcta gtgctcttac tgaattgtcc gacttggaag ttctagatct cagctataat 1740
tcacactatt tcagaatagc aggcgtaaca catcatctag aatttattca aaatttcaca 1800
aatctaaaag ttttaaactt gagccacaac aacatttata ctttaacaga taagtataac 1860
ctggaaagca agtccctggt agaattagtt ttcagtggca atcgccttga cattttgtgg 1920
aatgatgatg acaacaggta tatctccatt ttcaaaggtc tcaagaatct gacacgtctg 1980
gatttatccc ttaataggct gaagcacatc ccaaatgaag cattccttaa tttgccagcg 2040
agtctcactg aactacatat aaatgataat atgttaaagt tttttaactg gacattactc 2100
cagcagttcc ctcgtctcga gttgcttgac ttacgtggaa acaaactact ctttttaact 2160
gatagcctat ctgactttac atcttccctt cggacactgc tgctgagtca taacaggatt 2220
tcccacctac cctctggctt tctttctgaa gtcagtagtc tgaagcacct cgatttaagt 2280
tccaatctgc taaaaacaat caacaaatcc gcacttgaaa ctaagaccac caccaaatta 2340
tctatgttgg aactacacgg aaaccccttt gaatgcacct gtgacattgg agatttccga 2400
agatggatgg atgaacatct gaatgtcaaa attcccagac tggtagatgt catttgtgcc 2460
agtcctgggg atcaaagagg gaagagtatt gtgagtctgg agctgacaac ttgtgtttca 2520
gatgtcactg cagtgatatt atttttcttc acgttcttta tcaccaccat ggttatgttg 2580
gctgccctgg ctcaccattt gttttactgg gatgtttggt ttatatataa tgtgtgttta 2640
gctaaggtaa aaggctacag gtctctttcc acatcccaaa ctttctatga tgcttacatt 2700
tcttatgaca ccaaagatgc ctctgttact gactgggtga taaatgagct gcgctaccac 2760
cttgaagaga gccgagacaa aaacgttctc ctttgtctag aggagaggga ttgggacccg 2820
ggattggcca tcatcgacaa cctcatgcag agcatcaacc aaagcaagaa aacagtattt 2880
gttttaacca aaaaatatgc aaaaagctgg aactttaaaa cagcttttta cttggctttg 2940
cagaggctaa tggatgagaa catggatgtg attatattta tcctgctgga gccagtgtta 3000
cagcattctc agtatttgag gctacggcag cggatctgta agagctccat cctccagtgg 3060
cctgacaacc cgaaggcaga aggcttgttt tggcaaactc tgagaaatgt ggtcttgact 3120
gaaaatgatt cacggtataa caatatgtat gtcgattcca ttaagcaata ctaactgacg 3180
ttaagtcatg atttcgcgcc ataataaaga tgcaaaggaa tgacatttct gtattagtta 3240
tctattgcta tgtaacaaat tatcccaaaa cttagtggtt taaaacaaca catttgctgg 3300
cccacagttt t 3311
SEQ ID NO：30 人TLR8氨基酸序列(1059)
MKESSLQNSS CSLGKETKKE NMFLQSSMLT CIFLLISGSC ELCAEENFSR SYPCDEKKQN 60
DSVIAECSNR RLQEVPQTVG KYVTELDLSD NFITHITNES FQGLQNLTKI NLNHNPNVQH 120
QNGNPGIQSN GLNITDGAFL NLKNLRELLL EDNQLPQIPS GLPESLTELS LIQNNIYNIT 180
KEGISRLINL KNLYLAWNCY FNKVCEKTNI EDGVFETLTN LELLSLSFNS LSHVSPKLPS 240
SLRKLFLSNT QIKYISEEDF KGLINLTLLD LSGNCPRCFN APFPCVPCDG GASINIDRFA 300
FQNLTQLRYL NLSSTSLRKI NAAWFKNMPH LKVLDLEFNY LVGEIASGAF LTMLPRLEIL 360
DLSFNYIKGS YPQHINISRN FSKPLSLRAL HLRGYVFQEL REDDFQPLMQ LPNLSTINLG 420
INFIKQIDFK LFQNFSNLEI IYLSENRISP LVKDTRQSYA NSSSFQRHIR KRRSTDFEFD 480
PHSNFYHFTR PLIKPQCAAY GKALDLSLNS IFFIGPNQFE NLPDIACLNL SANSNAQVLS 540
GTEFSAIPHV KYLDLTNNRL DFDNASALTE LSDLEVLDLS YNSHYFRIAG VTHHLEFIQN 600
FTNLKVLNLS HNNIYTLTDK YNLESKSLVE LVFSGNRLDI LWNDDDNRYI SIFKGLKNLT 660
RLDLSLNRLK HIPNEAFLNL PASLTELHIN DNMLKFFNWT LLQQFPRLEL LDLRGNKLLF 720
LTDSLSDFTS SLRTLLLSHN RISHLPSGFL SEVSSLKHLD LSSNLLKTIN KSALETKTTT 780
KLSMLELHGN PFECTCDIGD FRRWMDEHLN VKIPRLVDVI CASPGDQRGK SIVSLELTTC 840
VSDVTAVILF FFTFFITTMV MLAALAHHLF YWDVWFIYNV CLAKIKGYRS LSTSQTFYDA 900
YISYDTKDAS VTDWVINELR YHLEESRDKN VLLCLEERDW DPGLAIIDNL MQSINQSKKT 960
VFVLTKKYAK SWNFKTAFYL ALQRLMDENM DVIIFILLEP VLQHSQYLRL RQRICKSSIL 1020
QWPDNPKAEG LFWQTLRNVV LTENDSRYNN MYVDSIKQY 1059
SEQ ID NO：31 人TLR8核苷酸序列
ctcctgcata gagggtacca ttctgcgctg ctgcaagtta cggaatgaaa aattagaaca 60
acagaaacgt ggttctcttg acacttcagt gttagggaac atcagcaaga cccatcccag 120
gagaccttga aggaagcctt tgaaagggag aatgaaggag tcatctttgc aaaatagctc 180
ctgcagcctg ggaaaggaga ctaaaaagga aaacatgttc cttcagtcgt caatgctgac 240
ctgcattttc ctgctaatat ctggttcctg tgagttatgc gccgaagaaa atttttctag 300
aagctatcct tgtgatgaga aaaagcaaaa tgactcagtt attgcagagt gcagcaatcg 360
tcgactacag gaagttcccc aaacggtggg caaatatgtg acagaactag acctgtctga 420
taatttcatc acacacataa cgaatgaatc atttcaaggg ctgcaaaatc tcactaaaat 480
aaatctaaac cacaacccca atgtacagca ccagaacgga aatcccggta tacaatcaaa 540
tggcttgaat atcacagacg gggcattcct caacctaaaa aacctaaggg agttactgct 600
tgaagacaac cagttacccc aaataccctc tggtttgcca gagtctttga cagaacttag 660
tctaattcaa aacaatatat acaacataac taaagagggc atttcaagac ttataaactt 720
gaaaaatctc tatttggcct ggaactgcta ttttaacaaa gtttgcgaga aaactaacat 780
agaagatgga gtatttgaaa cgctgacaaa tttggagttg ctatcactat ctttcaattc 840
tctttcacac gtgtcaccca aactgccaag ctccctacgc aaactttttc tgagcaacac 900
ccagatcaaa tacattagtg aagaagattt caagggattg ataaatttaa cattactaga 960
tttaagcggg aactgtccga ggtgcttcaa tgccccattt ccatgcgtgc cttgtgatgg 1020
tggtgcttca attaatatag atcgttttgc ttttcaaaac ttgacccaac ttcgatacct 1080
aaacctctct agcacttccc tcaggaagat taatgctgcc tggtttaaaa atatgcctca 1140
tctgaaggtg ctggatcttg aattcaacta tttagtggga gaaatagcct ctggggcatt 1200
tttaacgatg ctgccccgct tagaaatact tgacttgtct tttaactata taaaggggag 1260
ttatccacag catattaata tttccagaaa cttctctaaa cctttgtctc tacgggcatt 1320
gcatttaaga ggttatgtgt tccaggaact cagagaagat gatttccagc ccctgatgca 1380
gcttccaaac ttatcgacta tcaacttggg tattaatttt attaagcaaa tcgatttcaa 1440
acttttccaa aatttctcca atctggaaat tatttacttg tcagaaaaca gaatatcacc 1500
gttggtaaaa gatacccggc agagttatgc aaatagttcc tcttttcaac gtcatatccg 1560
gaaacgacgc tcaacagatt ttgagtttga cccacattcg aacttttatc atttcacccg 1620
tcctttaata aagccacaat gtgctgctta tggaaaagcc ttagatttaa gcctcaacag 1680
tattttcttc attgggccaa accaatttga aaatcttcct gacattgcct gtttaaatct 1740
gtctgcaaat agcaatgctc aagtgttaag tggaactgaa ttttcagcca ttcctcatgt 1800
caaatatttg gatttgacaa acaatagact agactttgat aatgctagtg ctcttactga 1860
attgtccgac ttggaagttc tagatctcag ctataattca cactatttca gaatagcagg 1920
cgtaacacat catctagaat ttattcaaaa tttcacaaat ctaaaagttt taaacttgag 1980
ccacaacaac atttatactt taacagataa gtataacctg gaaagcaagt ccctggtaga 2040
attagttttc agtggcaatc gccttgacat tttgtggaat gatgatgaca acaggtatat 2100
ctccattttc aaaggtctca agaatctgac acgtctggat ttatccctta ataggctgaa 2160
gcacatccca aatgaagcat tccttaattt gccagcgagt ctcactgaac tacatataaa 2220
tgataatatg ttaaagtttt ttaactggac attactccag cagtttcctc gtctcgagtt 2280
gcttgactta cgtggaaaca aactactctt tttaactgat agcctatctg actttacatc 2340
ttcccttcgg acactgctgc tgagtcataa caggatttcc cacctaccct ctggctttct 2400
ttctgaagtc agtagtctga agcacctcga tttaagttcc aatctgctaa aaacaatcaa 2460
caaatccgca cttgaaacta agaccaccac caaattatct atgttggaac tacacggaaa 2520
cccctttgaa tgcacctgtg acattggaga tttccgaaga tggatggatg aacatctgaa 2580
tgtcaaaatt cccagactgg tagatgtcat ttgtgccagt cctggggatc aaagagggaa 2640
gagtattgtg agtctggagc taacaacttg tgtttcagat gtcactgcag tgatattatt 2700
tttcttcacg ttctttatca ccaccatggt tatgttggct gccctggctc accatttgtt 2760
ttactgggat gtttggttta tatataatgt gtgtttagct aagataaaag gctacaggtc 2820
tctttccaca tcccaaactt tctatgatgc ttacatttct tatgacacca aagatgcctc 2880
tgttactgac tgggtgataa atgagctgcg ctaccacctt gaagagagcc gagacaaaaa 2940
cgttctcctt tgtctagagg agagggattg ggacccggga ttggccatca tcgacaacct 3000
catgcagagc atcaaccaaa gcaagaaaac agtatttgtt ttaaccaaaa aatatgcaaa 3060
aagctggaac tttaaaacag ctttttactt ggctttgcag aggctaatgg atgagaacat 3120
ggatgtgatt atatttatcc tgctggagcc agtgttacag cattctcagt atttgaggct 3180
acggcagcgg atctgtaaga gctccatcct ccagtggcct gacaacccga aggcagaagg 3240
cttgttttgg caaactctga gaaatgtggt cttgactgaa aatgattcac ggtataacaa 3300
tatgtatgtc gattccatta agcaatacta actgacgtta agtcatgatt tcgcgccata 3360
ataaaga 3367
SEQ ID NO：32 鼠TLR8氨基酸
MENMPPQSWI LTCFCLLSSG TSAIFHKANY SRSYPCDEIR HNSLVIAECN HRQLHEVPQT 60
IGKYVTNIDL SDNAITHITK ESFQKLQNLT KIDLNHNAKQ QHPNENKNGM NITEGALLSL 120
RNLTVLLLED NQLYTIPAGL PESLKELSLI QNNIFQVTKN NTFGLRNLER LYLGWNCYFK 180
CNQTFKVEDG AFKNLIHLKV LSLSFNNLFY VPPKLPSSLR KLFLSNAKIM NITQEDFKGL 240
ENLTLLDLSG NCPRCYNAPF PCTPCKENSS IHIHPLAFQS LTQLLYLNLS STSLRTIPST 300
WFENLSNLKE LHLEFNYLVQ EIASGAFLTK LPSLQILDLS FNFQYKEYLQ FINISSNFSK 360
LRSLKKLHLR GYVFRELKKK HFEHLQSLPN LATINLGINF IEKIDFKAFQ NFSKLDVIYL 420
SGNRIASVLD GTDYSSWRNR LRKPLSTDDD EFDHHVNFYH STKPLIKPQC TAYGKALDLS 480
LNNIFIIGKS QFEGFQDIAC LNLSFNANTQ VFNGTEFSSM PHIKYLDLTN NRLDFDDNNA 540
FSDLHDLEVL DLSHNAHYFS IAGVTHRLGF IQNLINLRVL NLSHNGIYTL TEESELKSIS 600
LKELVFSGNR LDHLWNANDG KYWSIFKSLQ NLIRLDLSYN NLQQIPNGAF LNLPQSLQEL 660
LISGNKLRFF NWTLLQYFPH LHLLDLSRNE LYFLPNCLSK FAHSLETLLL SHNHFSHLPS 720
GFLSEARNLV HLDLSFNTIK MINKSSLQTK MKTNLSILEL HGNYFDCTCD ISDFRSWLDE 780
NLNITIPKLV NVICSNPGDQ KSKSIMSLDL TTCVSDTTAA VLFFLTFLTT SMVMLAALVH 840
HLFYWDVWFI YHMCSAKLKG YRTSSTSQTF YDAYISYDTK DASVTDWVIN ELRYHLEESE 900
DKSVLLCLEE RDWDPGLPII DNLMQSINQS KKTIFVLTKK YAKSWNFKTA FYLALQRLMD 960
ENMDVIIFIL LEPVLQYSQY LRLRQRICKS SILQWPNNPK AENLFWQSLK NVVLTENDSR 1020
YDDLYIDSIR QY 1032
SEQ ID NO：33 鼠TLR核苷酸
attcagagtt ggatgttaag agagaaacaa acgttttacc ttcctttgtc tatagaacat 60
ggaaaacatg ccccctcagt catggattct gacgtgcttt tgtctgctgt cctctggaac 120
cagtgccatc ttccataaag cgaactattc cagaagctat ccttgtgacg agataaggca 180
caactccctt gtgattgcag aatgcaacca tcgtcaactg catgaagttc cccaaactat 240
aggcaagtat gtgacaaaca tagacttgtc agacaatgcc attacacata taacgaaaga 300
gtcctttcaa aagctgcaaa acctcactaa aatcgatctg aaccacaatg ccaaacaaca 360
gcacccaaat gaaaataaaa atggtatgaa tattacagaa ggggcacttc tcagcctaag 420
aaatctaaca gttttactgc tggaagacaa ccagttatat actatacctg ctgggttgcc 480
tgagtctttg aaagaactta gcctaattca aaacaatata tttcaggtaa ctaaaaacaa 540
cacttttggg cttaggaact tggaaagact ctatttgggc tggaactgct attttaaatg 600
taatcaaacc tttaaggtag aagatggggc atttaaaaat cttatacact tgaaggtact 660
ctcattatct ttcaataacc ttttctatgt gccccccaaa ctaccaagtt ctctaaggaa 720
actttttctg agtaatgcca aaatcatgaa catcactcag gaagacttca aaggactgga 780
aaatttaaca ttactagatc tgagtggaaa ctgtccaagg tgttacaatg ctccatttcc 840
ttgcacacct tgcaaggaaa actcatccat ccacatacat cctctggctt ttcaaagtct 900
cacccaactt ctctatctaa acctttccag cacttccctc aggacgattc cttctacctg 960
gtttgaaaat ctgtcaaatc tgaaggaact ccatcttgaa ttcaactatt tagttcaaga 1020
aattgcctcg ggggcatttt taacaaaact acccagttta caaatccttg atttgtcctt 1080
caactttcaa tataaggaat atttacaatt tattaatatt tcctcaaatt tctctaagct 1140
tcgttctctc aagaagttgc acttaagagg ctatgtgttc cgagaactta aaaagaagca 1200
tttcgagcat ctccagagtc ttccaaactt ggcaaccatc aacttgggca ttaactttat 1260
tgagaaaatt gatttcaaag ctttccagaa tttttccaaa ctcgacgtta tctatttatc 1320
aggaaatcgc atagcatctg tattagatgg tacagattat tcctcttggc gaaatcgtct 1380
tcggaaacct ctctcaacag acgatgatga gtttgatcca cacgtgaatt tttaccatag 1440
caccaaacct ttaataaagc cacagtgtac tgcttatggc aaggccttgg atttaagttt 1500
gaacaatatt ttcattattg ggaaaagcca atttgaaggt tttcaggata tcgcctgctt 1560
aaatctgtcc ttcaatgcca atactcaagt gtttaatggc acagaattct cctccatgcc 1620
ccacattaaa tatttggatt taaccaacaa cagactagac tttgatgata acaatgcttt 1680
cagtgatctt cacgatctag aagtgctgga cctgagccac aatgcacact atttcagtat 1740
agcaggggta acgcaccgtc taggatttat ccagaactta ataaacctca gggtgttaaa 1800
cctgagccac aatggcattt acaccctcac agaggaaagt gagctgaaaa gcatctcact 1860
gaaagaattg gttttcagtg gaaatcgtct tgaccatttg tggaatgcaa atgatggcaa 1920
atactggtcc atttttaaaa gtctccagaa tttgatacgc ctggacttat catacaataa 1980
ccttcaacaa atcccaaatg gagcattcct caatttgcct cagagcctcc aagagttact 2040
tatcagtggt aacaaattac gtttctttaa ttggacatta ctccagtatt ttcctcacct 2100
tcacttgctg gatttatcga gaaatgagct gtattttcta cccaattgcc tatctaagtt 2160
tgcacattcc ctggagacac tgctactgag ccataatcat ttctctcatc taccctctgg 2220
cttcctctcc gaagccagga atctggtgca cctggatcta agtttcaaca caataaagat 2280
gatcaataaa tcctccctgc aaaccaagat gaaaacgaac ttgtctattc tggagctaca 2340
tgggaactat tttgactgca cgtgtgacat aagtgatttt cgaagctggc tagatgaaaa 2400
tctgaatatc acaattccta aattggtaaa tgttatatgt tccaatcctg gggatcaaaa 2460
atcaaagagt atcatgagcc tagatctcac gacttgtgta tcggatacca ctgcagctgt 2520
cctgtttttc ctcacattcc ttaccacctc catggttatg ttggctgctc tggttcacca 2580
cctgttttac tgggatgttt ggtttatcta tcacatgtgc tctgctaagt taaaaggcta 2640
caggacttca tccacatccc aaactttcta tgatgcttat atttcttatg acaccaaaga 2700
tgcatctgtt actgactggg taatcaatga actgcgctac caccttgaag agagtgaaga 2760
caaaagtgtc ctcctttgtt tagaggagag ggattgggat ccaggattac ccatcattga 2820
taacctcatg cagagcataa accagagcaa gaaaacaatc tttgttttaa ccaagaaata 2880
tgccaagagc tggaacttta aaacagcttt ctacttggcc ttgcagaggc taatggatga 2940
gaacatggat gtgattattt tcatcctcct ggaaccagtg ttacagtact cacagtacct 3000
gaggcttcgg cagaggatct gtaagagctc catcctccag tggcccaaca atcccaaagc 3060
agaaaacttg ttttggcaaa gtctgaaaaa tgtggtcttg actgaaaatg attcacggta 3120
tgacgatttg tacattgatt ccattaggca atactagtga tgggaagtca cgactctgcc 3180
atcataaaaa cacacagctt ctccttacaa tgaaccgaat 3220
人和鼠TLR9的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如 GenBank Accession No.NM_017442，AF259262，AB045180， AF245704，AB045181，AF348140，AF314224，NM_031178；和 NP_059138，AAF72189，BAB19259，AAF78037，BAB19260， AAK29625，AAK28488，NP_112455。人TLR9存在至少两种异 构体，一种有1032个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：34所示，另 一种有1055个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：36所示。相应的核 苷酸序列分别如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：37所示。这两种异 构体中较短的一个较为重要。鼠TLR9有1032个氨基酸，其序 列如SEQ ID NO：38所示。相应的核苷酸序列如SEQ ID NO：39 所示。TLR9多肽含有一个具有富含亮氨酸的重复区域的胞外域， 一个转膜域，和一个含有TLR域的胞内域。
这里所说的“TLR9多肽”指含有根据上述序列的全长TLR9， 直系同源体，等位变体，SNP，经保守性氨基酸取代的变体，TLR9 融合蛋白，以及上述各序列的功能性片段的多肽。优选的实施方 案包括与SEQ ID NO：34的人TLR9氨基酸序列具有至少65％序 列相同性，更优选地具有至少80％序列相同性，更优选地具有至 少90％序列相同性，最优选地具有至少95％序列相同性的人 TLR9多肽。优选的实施方案还包括与SEQ ID NO：38的鼠TLR9 氨基酸序列具有至少65％序列相同性，更优选地具有至少80％ 序列相同性，更优选地具有至少90％序列相同性，最优选地具有 至少95％序列相同性的鼠TLR9多肽。
这里所说的“TLR9信号传导”指TLR9多肽激活TLR/IL-1R (TIR)信号传导途径的能力，也指TLR信号传导途径。不受任 何特定理论的限制，TLR/IL-1R信号传导途径包括通过分子骨髓 分化标记88(MyD88)和肿瘤坏死因子(TNF)受体结合的因子 6(TRAF6)的信号传导，导致IB激酶复合物激酶和c-jun NH2-末端激酶(例如Jnk 1/2)的激活。Hacker H et al.(2000)J Exp Med 192：595-600.TLR9活性的变化可以这里所公开的检测方法测量 得到，包括在对KB敏感的启动子和增强子控制下的基因表达。 这种天然存在的基因包括编码IL-1，IL-6，IL-8，干扰素12(IL-12 p40)的p40亚基，以及共刺激分子CD80和CD86。其它基因可 以在这样的调控元件(见下文)的控制之下报道TLR8信号传导 的水平。还可以向SEQ ID NO：35或者SEQ ID NO：39中加入额外 的核苷酸序列，优选是向SEQ ID NO：35的开放阅读框架的5’或 3’端加入，从而产生编码嵌合多肽的核苷酸序列，其中包括一种 可检测的或者报道子分子，例如FLAG，荧光素酶(luc)，绿色 荧光蛋白(GFP)，以及其它本领域公知的分子。
SEQ ID NO：34 人TLR9氨基酸序列(1032)
MGFCRSALHP LSLLVQAIML AMTLALGTLP AFLPCELQPH GLVNCNWLFL KSVPHFSMAA 60
PRGNVTSLSL SSNRIHHLHD SDFAHLPSLR HLNLKWNCPP VGLSPMHFPC HMTIEPSTFL 120
AVPTLEELNL SYNNIMTVPA LPKSLISLSL SHTNILMLDS ASLAGLHALR FLFMDGNCYY 180
KNPCRQALEV APGALLGLGN LTHLSLKYNN LTVVPRNLPS SLEYLLLSYN RIVKLAPEDL 240
ANLTALRVLD VGGNCRRCDH APNPCMECPR HFPQLHPDTF SHLSRLEGLV LKDSSLSWLN 300
ASWFRGLGNL RVLDLSENFL YKCITKTKAF QGLTQLRKLN LSFNYQKRVS FAHLSLAPSF 360
GSLVALKELD MHGIFFRSLD ETTLRPLARL PMLQTLRLQM NFINQAQLGI FRAFPGLRYV 420
DLSDNRISGA SELTATMGEA DGGEKVWLQP GDLAPAPVDT PSSEDFRPNC STLNFTLDLS 480
RNNLVTVQPE MFAQLSHLQC LRLSHNCISQ AVNGSQFLPL TGLQVLDLSH NKLDLYHEHS 540
FTELPRLEAL DLSYNSQPFG MQGVGHNFSF VAHLRTLRHL SLAHNNIHSQ VSQQLCSTSL 600
RALDFSGNAL GHMWAEGDLY LHFFQGLSGL IWLDLSQNRL HTLLPQTLRN LPKSLQVLRL 660
RDNYLAFFKW WSLHFLPKLE VLDLAGNQLK ALTNGSLPAG TRLRRLDVSC NSISFVAPGF 720
FSKAKELREL NLSANALKTV DHSWFGPLAS ALQILDVSAN PLHCACGAAF MDFLLEVQAA 780
VPGLPSRVKC GSPGQLQGLS IFAQDLRLCL DEALSWDCFA LSLLAVALGL GVPMLHHLCG 840
WDLWYCFHLC LAWLPWRGRQ SGRDEDALPY DAFVVFDKTQ SAVADWVYNE LRGQLEECRG 900
RWALRLCLEE RDWLPGKTLF ENLWASVYGS RKTLFVLAHT DRVSGLLRAS FLLAQQRLLE 960
DRKDVVVLVI LSPDGRRSRY VRLRQRLCRQ SVLLWPHQPS GQRSFWAQLG MALTRDNHHF 1020
YNRNFCQGPT AE 1032
SEQ ID NO：35 人TLR9核苷酸序列
ccgctgctgc ccctgtggga agggacctcg agtgtgaagc atccttccct gtagctgctg 60
tccagtctgc ccgccagacc ctctggagaa gcccctgccc cccagcatgg gtttctgccg 120
cagcgccctg cacccgctgt ctctcctggt gcaggccatc atgctggcca tgaccctggc 180
cctgggtacc ttgcctgcct tcctaccctg tgagctccag ccccacggcc tggtgaactg 240
caactggctg ttcctgaagt ctgtgcccca cttctccatg gcagcacccc gtggcaatgt 300
caccagcctt tccttgtcct ccaaccgcat ccaccacctc catgattctg actttgccca 360
cctgcccagc ctgcggcatc tcaacctcaa gtggaactgc ccgccggttg gcctcagccc 420
catgcacttc ccctgccaca tgaccatcga gcccagcacc ttcttggctg tgcccaccct 480
ggaagagcta aacctgagct acaacaacat catgactgtg cctgcgctgc ccaaatccct 540
catatccctg tccctcagcc ataccaacat cctgatgcta gactctgcca gcctcgccgg 600
cctgcatgcc ctgcgcttcc tattcatgga cggcaactgt tattacaaga acccctgcag 660
gcaggcactg gaggtggccc cgggtgccct ccttggcctg ggcaacctca cccacctgtc 720
actcaagtac aacaacctca ctgtggtgcc ccgcaacctg ccttccagcc tggagtatct 780
gctgttgtcc tacaaccgca tcgtcaaact ggcgcctgag gacctggcca atctgaccgc 840
cctgcgtgtg ctcgatgtgg gcggaaattg ccgccgctgc gaccacgctc ccaacccctg 900
catggagtgc cctcgtcact tcccccagct acatcccgat accttcagcc acctgagccg 960
tcttgaaggc ctggtgttga aggacagttc tctctcctgg ctgaatgcca gttggttccg 1020
tgggctggga aacctccgag tgctggacct gagtgagaac ttcctctaca aatgcatcac 1080
taaaaccaag gccttccagg gcctaacaca gctgcgcaag cttaacctgt ccttcaatta 1140
ccaaaagagg gtgtcctttg cccacctgtc tctggcccct tccttcggga gcctggtcgc 1200
cctgaaggag ctggacatgc acggcatctt cttccgctca ctcgatgaga ccacgctccg 1260
gccactggcc cgcctgccca tgctccagac tctgcgtctg cagatgaact tcatcaacca 1320
ggcccagctc ggcatcttca gggccttccc tggcctgcgc tacgtggacc tgtcggacaa 1380
ccgcatcagc ggagcttcgg agctgacagc caccatgggg gaggcagatg gaggggagaa 1440
ggtctggctg cagcctgggg accttgctcc ggccccagtg gacactccca gctctgaaga 1500
cttcaggccc aactgcagca ccctcaactt caccttggat ctgtcacgga acaacctggt 1560
gaccgtgcag ccggagatgt ttgcccagct ctcgcacctg cagtgcctgc gcctgagcca 1620
caactgcatc tcgcaggcag tcaatggctc ccagttcctg ccgctgaccg gtctgcaggt 1680
gctagacctg tcccacaata agctggacct ctaccacgag cactcattca cggagctacc 1740
acgactggag gccctggacc tcagctacaa cagccagccc tttggcatgc agggcgtggg 1800
ccacaacttc agcttcgtgg ctcacctgcg caccctgcgc cacctcagcc tggcccacaa 1860
caacatccac agccaagtgt cccagcagct ctgcagtacg tcgctgcggg ccctggactt 1920
cagcggcaat gcactgggcc atatgtgggc cgagggagac ctctatctgc acttcttcca 1980
aggcctgagc ggtttgatct ggctggactt gtcccagaac cgcctgcaca ccctcctgcc 2040
ccaaaccctg cgcaacctcc ccaagagcct acaggtgctg cgtctccgtg acaattacct 2100
ggccttcttt aagtggtgga gcctccactt cctgcccaaa ctggaagtcc tcgacctggc 2160
aggaaaccag ctgaaggccc tgaccaatgg cagcctgcct gctggcaccc ggctccggag 2220
gctggatgtc agctgcaaca gcatcagctt cgtggccccc ggcttctttt ccaaggccaa 2280
ggagctgcga gagctcaacc ttagcgccaa cgccctcaag acagtggacc actcctggtt 2340
tgggcccctg gcgagtgccc tgcaaatact agatgtaagc gccaaccctc tgcactgcgc 2400
ctgtggggcg gcctttatgg acttcctgct ggaggtgcag gctgccgtgc ccggtctgcc 2460
cagccgggtg aagtgtggca gtccgggcca gctccagggc ctcagcatct ttgcacagga 2520
cctgcgcctc tgcctggatg aggccctctc ctgggactgt ttcgccctct cgctgctggc 2580
tgtggctctg ggcctgggtg tgcccatgct gcatcacctc tgtggctggg acctctggta 2640
ctgcttccac ctgtgcctgg cctggcttcc ctggcggggg cggcaaagtg ggcgagatga 2700
ggatgccctg ccctacgatg ccttcgtggt cttcgacaaa acgcagagcg cagtggcaga 2760
ctgggtgtac aacgagcttc gggggcagct ggaggagtgc cgtgggcgct gggcactccg 2820
cctgtgcctg gaggaacgcg actggctgcc tggcaaaacc ctctttgaga acctgtgggc 2880
ctcggtctat ggcagccgca agacgctgtt tgtgctggcc cacacggacc gggtcagtgg 2940
tctcttgcgc gccagcttcc tgctggccca gcagcgcctg ctggaggacc gcaaggacgt 3000
cgtggtgctg gtgatcctga gccctgacgg ccgccgctcc cgctacgtgc ggctgcgcca 3060
gcgcctctgc cgccagagtg tcctcctctg gccccaccag cccagtggtc agcgcagctt 3120
ctgggcccag ctgggcatgg ccctgaccag ggacaaccac cacttctata accggaactt 3180
ctgccaggga cccacggccg aatagccgtg agccggaatc ctgcacggtg ccacctccac 3240
actcacctca cctctgc 3258
SEQ ID NO：36 人TLR9氨基酸序列(1055)
MPMKWSGWRW SWGPATHTAL PPPQGFCRSA LHPLSLLVQA IMLAMTLALG TLPAFLPCEL 60
QPHGLVNCNW LFLKSVPHFS MAAPRGNVTS LSLSSNRIHH LHDSDFAHLP SLRHLNLKWN 120
CPPVGLSPMH FPCHMTIEPS TFLAVPTLEE LNLSYNNIMT VPALPKSLIS LSLSHTNILM 180
LDSASLAGLH ALRFLFMDGN CYYKNPCRQA LEVAPGALLG LGNLTHLSLK YNNLTVVPRN 240
LPSSLEYLLL SYNRIVKLAP EDLANLTALR VLDVGGNCRR CDHAPNPCME CPRHFPQLHP 300
DTFSHLSRLE GLVLKDSSLS WLNASWFRGL GNLRVLDLSE NFLYKCITKT KAFQGLTQLR 360
KLNLSFNYQK RVSFAHLSLA PSFGSLVALK ELDMHGIFFR SLDETTLRPL ARLPMLQTLR 420
LQMNFINQAQ LGIFRAFPGL RYVDLSDNRI SGASELTATM GEADGGEKVW LQPGDLAPAP 480
VDTPSSEDFR PNCSTLNFTL DLSRNNLVTV QPEMFAQLSH LQCLRLSHNC ISQAVNGSQF 540
LPLTGLQVLD LSHNKLDLYH EHSFTELPRL EALDLSYNSQ PFGMQGVGHN FSFVAHLRTL 600
RHLSLAHNNI HSQVSQQLCS TSlRALDFSG NALGHMWAEG DLYLHFFQGL SGLIWLDLSQ 660
NRLHTLLPQT LRNLPKSLQV LRLRDNYLAF FKWWSLHFLP KLEVLDLAGN QLKALTNGSL 720
PAGTRLRRLD VSCNSISFVA PGFFSKAKEL RELNLSANAL KTVDHSWFGP LASALQILDV 780
SANPLHCACG AAFMDFLLEV QAAVPGLPSR VKCGSPGQLQ GLSIFAQDLR LCLDEALSWD 840
CFALSLLAVA LGLGVPMLHH LCGWDLWYCF HLCLAWLPWR GRQSGRDEDA LPYDAFVVFD 900
KTQSAVADWV YNELRGQLEE CRGRWALRLC LEERDWLPGK TLFENLWASV YGSRKTLFVL 960
AHTDRVSGLL RASFLLAQQR LLEDRKDVVV LVILSPDGRR SRYVRLRQRL CRQSVLLWPH 1020
QPSGQRSFWA QLGMALTRDN HHFYNRNFCQ GPTAE 1055
SEQ ID NO：37 人TLR9核苷酸序列
atgcccatga agtggagtgg gtggaggtgg agctgggggc cggccactca cacagccctc 60
ccacccccac agggtttctg ccgcagcgcc ctgcacccgc tgtctctcct ggtgcaggcc 120
atcatgctgg ccatgaccct ggccctgggt accttgcctg ccttcctacc ctgtgagctc 180
cagccccacg gcctggtgaa ctgcaactgg ctgttcctga agtctgtgcc ccacttctcc 240
atggcagcac cccgtggcaa tgtcaccagc ctttccttgt cctccaaccg catccaccac 300
ctccatgatt ctgactttgc ccacctgccc agcctgcggc atctcaacct caagtggaac 360
tgcccgccgg ttggcctcag ccccatgcac ttcccctgcc acatgaccat cgagcccagc 420
accttcttgg ctgtgcccac cctggaagag ctaaacctga gctacaacaa catcatgact 480
gtgcctgcgc tgcccaaatc cctcatatcc ctgtccctca gccataccaa catcctgatg 540
ctagactctg ccagcctcgc cggcctgcat gccctgcgct tcctattcat ggacggcaac 600
tgttattaca agaacccctg caggcaggca ctggaggtgg ccccgggtgc cctccttggc 660
ctgggcaacc tcacccacct gtcactcaag tacaacaacc tcactgtggt gccccgcaac 720
ctgccttcca gcctggagta tctgctgttg tcctacaacc gcatcgtcaa actggcgcct 780
gaggacctgg ccaatctgac cgccctgcgt gtgctcgatg tgggcggaaa ttgccgccgc 840
tgcgaccacg ctcccaaccc ctgcatggag tgccctcgtc acttccccca gctacatccc 900
gataccttca gccacctgag ccgtcttgaa ggcctggtgt tgaaggacag ttctctctcc 960
tggctgaatg ccagttggtt ccgtgggctg ggaaacctcc gagtgctgga cctgagtgag 1020
aacttcctct acaaatgcat cactaaaacc aaggccttcc agggcctaac acagctgcgc 1080
aagcttaacc tgtccttcaa ttaccaaaag agggtgtcct ttgcccacct gtctctggcc 1140
ccttccttcg ggagcctggt cgccctgaag gagctggaca tgcacggcat cttcttccgc 1200
tcactcgatg agaccacgct ccggccactg gcccgcctgc ccatgctcca gactctgcgt 1260
ctgcagatga acttcatcaa ccaggcccag ctcggcatct tcagggcctt ccctggcctg 1320
cgctacgtgg acctgtcgga caaccgcatc agcggagctt cggagctgac agccaccatg 1380
ggggaggcag atggagggga gaaggtctgg ctgcagcctg gggaccttgc tccggcccca 1440
gtggacactc ccagctctga agacttcagg cccaactgca gcaccctcaa cttcaccttg 1500
gatctgtcac ggaacaacct ggtgaccgtg cagccggaga tgtttgccca gctctcgcac 1560
ctgcagtgcc tgcgcctgag ccacaactgc atctcgcagg cagtcaatgg ctcccagttc 1620
ctgccgctga ccggtctgca ggtgctagac ctgtcccaca ataagctgga cctctaccac 1680
gagcactcat tcacggagct accacgactg gaggccctgg acctcagcta caacagccag 1720
ccctttggca tgcagggcgt gggccacaac ttcagcttcg tggctcacct gcgcaccctg 1800
cgccacctca gcctggccca caacaacatc cacagccaag tgtcccagca gctctgcagt 1860
acgtcgctgc gggccctgga cttcagcggc aatgcactgg gccatatgtg ggccgaggga 1920
gacctctatc tgcacttctt ccaaggcctg agcggtttga tctggctgga cttgtcccag 1980
aaccgcctgc acaccctcct gccccaaacc ctgcgcaacc tccccaagag cctacaggtg 2040
ctgcgtctcc gtgacaatta cctggccttc tttaagtggt ggagcctcca cttcctgccc 2100
aaactggaag tcctcgacct ggcaggaaac cagctgaagg ccctgaccaa tggcagcctg 2160
cctgctggca cccggctccg gaggctggat gtcagctgca acagcatcag cttcgtggcc 2220
cccggcttct tttccaaggc caaggagctg cgagagctca accttagcgc caacgccctc 2280
aagacagtgg accactcctg gtttgggccc ctggcgagtg ccctgcaaat actagatgta 2340
agcgccaacc ctctgcactg cgcctgtggg gcggccttta tggacttcct gctggaggtg 2400
caggctgccg tgcccggtct gcccagccgg gtgaagtgtg gcagtccggg ccagctccag 2460
ggcctcagca tctttgcaca ggacctgcgc ctctgcctgg atgaggccct ctcctgggac 2520
tgtttcgccc tctcgctgct ggctgtggct ctgggcctgg gtgtgcccat gctgcatcac 2580
ctctgtggct gggacctctg gtactgcttc cacctgtgcc tggcctggct tccctggcgg 2640
gggcggcaaa gtgggcgaga tgaggatgcc ctgccctacg atgccttcgt ggtcttcgac 2700
aaaacgcaga gcgcagtggc agactgggtg tacaacgagc ttcgggggca gctggaggag 2760
tgccgtgggc gctgggcact ccgcctgtgc ctggaggaac gcgactggct gcctggcaaa 2820
accctctttg agaacctgtg ggcctcggtc tatggcagcc gcaagacgct gtttgtgctg 2880
gcccacacgg accgggtcag tggtctcttg cgcgccagct tcctgctggc ccagcagcgc 2940
ctgctggagg accgcaagga cgtcgtggtg ctggtgatcc tgagccctga cggccgccgc 3000
tcccgctatg tgcggctgcg ccagcgcctc tgccgccaga gtgtcctcct ctggccccac 3060
cagcccagtg gtcagcgcag cttctgggcc cagctgggca tggccctgac cagggacaac 3120
caccacttct ataaccggaa cttctgccag ggacccacgg ccgaa 3165
SEQ ID NO：38 鼠TLR9氨基酸序列
MVLRRRTLHP LSLLVQAAVL AETLALGTLP AFLPCELKPH GLVDCNWLFL KSVPRFSAAA 60
SCSNITRLSL ISNRIHHLHN SDFVHLSNLR QLNLKWNCPP TGLSPLHFSC HMTIEPRTFL 120
AMRTLEELNL SYNGITTVPR LPSSLVNLSL SHTNILVLDA NSLAGLYSLR VLFMDGNCYY 180
KNPCTGAVKV TPGALLGLSN LTHLSLKYNN LTKVPRQLPP SLEYLLVSYN LIVKLGPEDL 240
ANLTSLRVLD VGGNCRRCDH APNPCIECGQ KSLHLHPETF HHLSHLEGLV LKDSSLHTLN 300
SSWFQGLVNL SVLDLSENFL YESINHTNAF QNLTRLRKLN LSFNYRKKVS FARLHLASSF 360
KNLVSLQELN MNGIFFRSLN KYTLRWLADL PKLHTLHLQM NFINQAQLSI FGTFRALRFV 420
DLSDNRISGP STLSFATPEE ADDAEQEELL SADPHPAPLS TPASKNFMDR CKNFKFTMDL 480
SRNNLVTIKP EMFVNLSRLQ CLSLSHNSIA QAVNGSQFLP LTNLQVLDLS HNKLDLYHWK 540
SFSELPQLQA LDLSYNSQPF SMKGIGHNFS FVAHLSMLHS LSLAHNDIHT RVSSHLNSNS 600
VRFLDFSGNG MGRMWDEGGL YLHFFQGLSG LLKLDLSQNN LHILRPQNLD NLPKSLKLLS 660
LRDNYLSFFN WTSLSFLPNL EVLDLAGNQL KALTNGTLPN GTLLQKLDVS SNSIVSVVPA 720
FFALAVELKE VNLSHNILKT VDRSWFGPIV MNLTVLDVRS NPLHCACGAA FVDLLLEVQT 780
KVPGLANGVK CGSPGQLQGR SIFAQDLRLC LDEVLSWDCF GLSLLAVAVG MVVPILHHLC 840
GWDVWYCFHL CLAWLPLLAR SRRSAQALPY DAFVVFDKAQ SAVADWVYNE LRVRLEERRG 900
RRALRLCLED RDWLPGQTLF ENLWASIYGS RKTLFVLAHT DRVSGLLRTS FLLAQQRLLE 960
DRKDVVVLVI LRPDAHRSRY VRLRQRLCRQ SVLFWPQQPN GQGGFWAQLS TALTRDNRHF 1020
YNQNFCRGPT AE 1032
SEQ ID NO：39 鼠TLR9核苷酸序列
tgtcagaggg agcctcggga gaatcctcca tctcccaaca tggttctccg tcgaaggact 60
ctgcacccct tgtccctcct ggtacaggct gcagtgctgg ctgagactct ggccctgggt 120
accctgcctg ccttcctacc ctgtgagctg aagcctcatg gcctggtgga ctgcaattgg 180
ctgttcctga agtctgtacc ccgtttctct gcggcagcat cctgctccaa catcacccgc 240
ctctccttga tctccaaccg tatccaccac ctgcacaact ccgacttcgt ccacctgtcc 300
aacctgcggc agctgaacct caagtggaac tgtccaccca ctggccttag ccccctgcac 360
ttctcttgcc acatgaccat tgagcccaga accttcctgg ctatgcgtac actggaggag 420
ctgaacctga gctataatgg tatcaccact gtgccccgac tgcccagctc cctggtgaat 480
ctgagcctga gccacaccaa catcctggtt ctagatgcta acagcctcgc cggcctatac 540
agcctgcgcg ttctcttcat ggacgggaac tgctactaca agaacccctg cacaggagcg 600
gtgaaggtga ccccaggcgc cctcctgggc ctgagcaatc tcacccatct gtctctgaag 660
tataacaacc tcacaaaggt gccccgccaa ctgcccccca gcctggagta cctcctggtg 720
tcctataacc tcattgtcaa gctggggcct gaagacctgg ccaatctgac ctcccttcga 780
gtacttgatg tgggtgggaa ttgccgtcgc tgcgaccatg cccccaatcc ctgtatagaa 840
tgtggccaaa agtccctcca cctgcaccct gagaccttcc atcacctgag ccatctggaa 900
ggcctggtgc tgaaggacag ctctctccat acactgaact cttcctggtt ccaaggtctg 960
gtcaacctct cggtgctgga cctaagcgag aactttctct atgaaagcat caaccacacc 1020
aatgcctttc agaacctaac ccgcctgcgc aagctcaacc tgtccttcaa ttaccgcaag 1080
aaggtatcct ttgcccgcct ccacctggca agttccttca agaacctggt gtcactgcag 1140
gagctgaaca tgaacggcat cttcttccgc tcgctcaaca agtacacgct cagatggctg 1200
gccgatctgc ccaaactcca cactctgcat cttcaaatga acttcatcaa ccaggcacag 1260
ctcagcatct ttggtacctt ccgagccctt cgctttgtgg acttgtcaga caatcgcatc 1320
agtgggcctt caacgctgtc agaagccacc cctgaagagg cagatgatgc agagcaggag 1380
gagctgttgt ctgcggatcc tcacccagct ccactgagca cccctgcttc taagaacttc 1440
atggacaggt gtaagaactt caagttcacc atggacctgt ctcggaacaa cctggtgact 1500
atcaagccag agatgtttgt caatctctca cgcctccagt gtcttagcct gagccacaac 1560
tccattgcac aggctgtcaa tggctctcag ttcctgccgc tgactaatct gcaggtgctg 1620
gacctgtccc ataacaaact ggacttgtac cactggaaat cgttcagtga gctaccacag 1680
ttgcaggccc tggacctgag ctacaacagc cagcccttta gcatgaaggg tataggccac 1740
aatttcagtt ttgtggccca tctgtccatg ctacacagcc ttagcctggc acacaatgac 1800
attcataccc gtgtgtcctc acatctcaac agcaactcag tgaggtttct tgacttcagc1860
ggcaacggta tgggccgcat gtgggatgag gggggccttt atctccattt cttccaaggc 1920
ctgagtggcc tgctgaagct ggacctgtct caaaataacc tgcatatcct ccggccccag 1980
aaccttgaca acctccccaa gagcctgaag ctgctgagcc tccgagacaa ctacctatct 2040
ttctttaact ggaccagtct gtccttcctg cccaacctgg aagtcctaga cctggcaggc 2100
aaccagctaa aggccctgac caatggcacc ctgcctaatg gcaccctcct ccagaaactg 2160
gatgtcagca gcaacagtat cgtctctgtg gtcccagcct tcttcgctct ggcggtcgag 2220
ctgaaagagg tcaacctcag ccacaacatt ctcaagacgg tggatcgctc ctggtttggg 2280
cccattgtga tgaacctgac agttctagac gtgagaagca accctctgca ctgtgcctgt 2340
ggggcagcct tcgtagactt actgttggag gtgcagacca aggtgcctgg cctggctaat 2400
ggtgtgaagt gtggcagccc cggccagctg cagggccgta gcatcttcgc acaggacctg 2460
cggctgtgcc tggatgaggt cctctcttgg gactgctttg gcctttcact cttggctgtg 2520
gccgtgggca tggtggtgcc tatactgcac catctctgcg gctgggacgt ctggtactgt 2580
tttcatctgt gcctggcatg gctacctttg ctggcccgca gccgacgcag cgcccaagct 2640
ctcccctatg atgccttcgt ggtgttcgat aaggcacaga gcgcagttgc ggactgggtg 2700
tataacgagc tgcgggtgcg gctggaggag cggcgcggtc gccgagccct acgcttgtgt 2760
ctggaggacc gagattggct gcctggccag acgctcttcg agaacctctg ggcttccatc 2820
tatgggagcc gcaagactct atttgtgctg gcccacacgg accgcgtcag tggcctcctg 2880
cgcaccagct tcctgctggc tcagcagcgc ctgttggaag accgcaagga cgtggtggtg 2940
ttggtgatcc tgcgtccgga tgcccaccgc tcccgctatg tgcgactgcg ccagcgtctc 3000
tgccgccaga gtgtgctctt ctggccccag cagcccaacg ggcagggggg cttctgggcc 3060
cagctgagta cagccctgac tagggacaac cgccacttct ataaccagaa cttctgccgg 3120
ggacctacag cagaatagct cagagcaaca gctggaaaca gctgcatctt catgcctggt 3180
tcccgagttg ctctgcctgc 3200
核糖核苷氧钒基复合物(即腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤核苷和 尿嘧啶核糖核苷氧钒基复合物)是本领域公知的RNA酶抑制剂。 Berger SL et al.(1979)Biochemistry 18：5143；Puskas RS et al. (1982)Biochemistry 21：4602.核糖核苷氧钒基复合物可以从供 应商包括Sigma-Aldrich，Inc处获得。
在一个实施方案中，本发明的含有G，U的免疫刺激RNA 寡聚物不含有CpG二核苷酸，也不是CpG免疫刺激核苷酸。
CpG免疫刺激核苷酸是一种含有CG二核苷酸的核苷酸，其 中C残基未甲基化。已知CpG免疫刺激核苷酸可以刺激Th1类 型的免疫应答。CpG序列在人DNA中相对较少，通常存在于感 染性微生物例如细菌DNA中。人免疫系统的进化使得其可以识 别CpG序列作为感染的早期警告信号，并立即启动强有力的免 疫应答以对抗入侵的病原体，而不会引起其它免疫刺激试剂所伴 随的负面反应。因此含有CpG的核酸，依靠其天然免疫防御机 制，可以成为免疫治疗的一条独特的天然途径。CpG核酸对免疫 调节的效果在下述文献中有详细描述：美国专利如US 6,194,388 B1，US 6,207,646 B1，US 6,239,116 B1和US 6,218,371 B1，以 及公开的专利申请，如PCT/US98/03678，PCT/US98/10408， PCT/US98/04703，和PCT/US99/09863。在此引入这些专利和专 利申请的全文作为参考。
CpG核酸是一种含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的核 苷酸。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的核苷酸是指在胞 嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列中含有一个未甲基化胞嘧啶(即“CpG DNA”或者含有5’端胞嘧啶和3’端鸟嘌呤核苷并通过磷酸键连接 起来的DNA)，并能激活免疫系统的核酸分子。CpG核酸可以是 双链的或是单链的。通常双链分子在体内更加稳定，而单链分子 可增强免疫活性。因此在本发明的某些方面优选所述核酸是单 链，在另一些方面优选所述核酸是双链。在特定的实施方案中， 当所述核酸是单链的时候，它可以形成二级和三级结构(例如通 过自身的折叠，或者在整个序列上或在长度方向上的选定区段上 与其自身的杂交)。相应地，这样一个核酸的初级结构可以是单 链的，它的高级结构可以是双链或是三链的。这里所说的术语 CpG核酸或者CpG寡核苷酸是指一种免疫刺激CpG核酸，除非 特别指明。整个免疫刺激核酸可以是未甲基化的或者可以是部分 甲基化的，但是至少5′CG 3′的C必须是未甲基化的。
本发明的一方面提供了一种激活免疫细胞的方法。所述方法 包括使免疫细胞与有效量的能诱导免疫细胞的激活的上述本发 明的免疫刺激组合物接触。这里所说的“免疫细胞”是指属于免 疫系统的细胞。免疫细胞参与炎性反应和免疫应答的调控和实 施。它们包括但不限于B淋巴细胞(B细胞)，T淋巴细胞(T 细胞)，天然杀伤(NK)细胞，树突状细胞，其它组织特异性抗 原呈递细胞(例如胰岛细胞)，巨噬细胞，单核细胞，粒细胞(嗜 中性粒细胞，嗜曙红细胞，嗜碱细胞)，以及肥大细胞。脾细胞， 胸腺细胞和外周血单核细胞(PBMC)都含有免疫细胞。免疫细 胞可以用本领域技术人员公知的方法从血液，脾骨髓，淋巴结， 胸腺和其它组织中分离出来。免疫细胞还包括特定的细胞系以及 体外或离体的初级培养物。
在一个实施方案中，免疫细胞的激活包括免疫细胞分泌细胞 因子。在一个实施方案中，免疫细胞的激活包括免疫细胞分泌趋 化因子。在一个实施方案中免疫细胞的激活包括免疫细胞表达共 刺激/辅助分子。在一个实施方案中，所述共刺激/辅助分子选自 下组：细胞间粘附分子(ICAM，例如CD54)，白细胞功能相关 抗原(LFA，例如CD58)，B7(CD80，CD86)，和CD40。
“免疫细胞的激活”指免疫细胞从休眠状态或静止状态向与 免疫细胞功能相关的代谢活性升高的状态和表型转变。所说的免 疫细胞功能包括，例如可溶性产物如免疫球蛋白，细胞因子，和 趋化因子的分泌；共刺激/辅助分子和MHC抗原在细胞表面的表 达；免疫细胞的迁移；对靶细胞的吞噬作用和细胞毒性作用；免 疫细胞的成熟。在一些实施例中，免疫激活指Th1免疫激活；在 另一些实施例中，免疫激活指Th2免疫激活。
这里所说的“Th1免疫激活”指免疫细胞活化并表达Th1样 分泌产物，包括特定的细胞因子，趋化因子以及免疫球蛋白的子 集合；特定免疫细胞的激活。Th1样分泌产物包括，例如，细胞 因子IFN-γ，IL-2，IL-12，IL-18，TNF-α，和趋化因子IP-10 (CXCL10)。在鼠中，Th1免疫激活刺激IgG2a的分泌。免疫激 活还包括NK细胞和树突状细胞，即细胞免疫涉及的细胞的激活。 Th1免疫激活可以对Th2免疫激活进行负调控。
这里所说的“Th2免疫激活”指免疫细胞活化并表达Th1 样分泌产物，包括特定的细胞因子，趋化因子以及免疫球蛋白的 子集合；特定免疫细胞的激活。Th1样分泌产物包括，例如，细 胞因子IL-4和IL-10。在鼠中，Th2免疫激活可刺激IgG1和IgE 的分泌。Th2免疫激活可以对Th1免疫激活进行负调控。
另一方面，本发明提供了在患者中诱导免疫应答的方法。所 述方法包括给患者施用有效量的可在患者中诱导免疫应答的本 发明的组合物。因此本发明的组合物可以用于治疗需要免疫激活 的患者。需要免疫激活的患者可以包括需要Th1样免疫激活的患 者。
本发明的组合物和方法可以单独使用也可以和其它试剂一 起使用，用于治疗需要Th1样免疫激活的患者。“需要Th1样免 疫激活的患者”是患有疾病，失调或症状或具有其患病危险并且 能够通过对Th1的免疫应答获益的患者。
这样的患者可能患有Th2介导的失调或者具有其患病危险， 所述Th2介导的失调容易受到Th1介导的交叉调控或抑制。这样 的失调包括，例如，特定的组织特异性自体免疫疾病。可选择地， 这样的患者可能患有Th1缺陷或者具有患病危险。这样的失调包 括，例如，肿瘤，细胞内病原体感染，以及AIDS。
这里所说的“富含G，U的RNA”指至少5个核苷酸长，在碱 基组成上鸟嘌呤(G)和鸟嘧啶(U)至少是60％，更优选地至 少是80％，最优选地至少是90％的RNA。如果序列少于10个 碱基，那么这样的组成见于全长序列，如果RNA多于10个碱基， 这样的组成见于至少10个连续碱基区段。
这里所说的“富含G的RNA”指在碱基组成上鸟嘌呤(G)至 少是70％，更优选地至少是80％，更优选地是至少90％，最优 选地至少是95％的RNA。如果序列少于10个碱基，那么这样的 组成见于全长序列，如果RNA多于10个碱基，这样的组成见于 至少10个连续碱基区段。
在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种DNA∶RNA结 合体。DNA∶RNA结合体是一种包含至少一个脱氧核糖核苷与至 少一个核糖核苷相连的分子或复合体。所述脱氧核糖核苷和核糖 核苷组分可以通过碱基对相互作用连接。可选择地，所述脱氧核 糖核苷和核糖核苷组分可以通过至少一个脱氧核糖核苷和至少 一个核糖核苷的糖分子之间的共价键连接。糖分子之间的共价键 可以是直接的或是间接的，例如可以通过连接子。碱基对相互作 用包括但不限于非共价的Watson-Crick类型碱基对相互作用。其 它碱基对相互作用包括本发明涉及的非共价(例如Hoogstein碱 基对)和共价相互作用。碱基对相互作用也可以包括两条链的双 链形成，但是本发明也包括更高级的相互作用。
这里所述的包括至少一个脱氧核糖核苷和至少一个核糖核 苷的糖分子之间的共价键的DNA∶RNA结合体具有一个嵌合 DNA∶RNA骨架。具有嵌合DNA∶RNA骨架的DNA∶RNA结合体 具有由其碱基序列所定义的初级结构，它还具有二级或更高级结 构。二级或更高级结构包括至少一个分子内碱基对相互作用，例 如茎环结构，或者分子间碱基对相互作用。
异源双链核酸分子的碱基对指DNA和RNA之间的分子内或 分子间碱基对相互作用。例如，异源双链核酸分子碱基对可以存 在于单个互补单链DNA和RNA分子之间。可选择地，在合适的 DNA∶RNA嵌合骨架核酸分子中，异源双链核酸分子的碱基对可 以存在于同一个分子的互补DNA和RNA区域之间。
在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种在DNA和 RNA之间具有切割位点的嵌合DNA∶RNA骨架。切割位点是指 嵌合骨架上的一种结构元件，易于以任何合适的方式切割。这种 切割位点可以是磷酸二酯键，它相对较容易被核酸内切酶切割。 在此情况下，DNA和RNA都含有稳定的核苷酸间连接，因此嵌 合骨架最容易在稳定DNA和稳定RNA之间的磷酸二酯键连接处 被核酸内切酶切割。切割位点可以设计为易于在特定的pH条件 下被切割，例如相对在较高pH比较低pH下稳定，或者相反的 情况。可以通过在核糖体中制备嵌合DNA∶RNA组合物获得这种 pH敏感性。切割位点可以包括二硫键。这样的二硫键相对在氧 化条件下比还原条件下更稳定，例如内涵体中存在的是还原条 件。切割位点还可以包括易于通过酶，pH，氧化还原条件等被切 割的连接子。在一些实施方案中，所述组合物可以包含多于一个 的切割位点。
本发明的结合体允许选择特定的结合体组分的摩尔比。在 DNA∶RNA结合体中，具有1∶1的DNA和RNA比率是比较容 易的也是比较有利的。异源双链DNA∶RNA结合体通常其DNA 和RNA比率为1∶1。具有嵌合DNA∶RNA骨架的结合体通常也 具有1∶1的DNA和RNA比率。本发明还包括含有其它DNA∶RNA 比率的结合体，包括但不限于1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1等等。 与同种组分单独存在相比，结合体可以使一种或多种组分更稳 定。结合也便于将各组分以选定的比率递送到细胞中。
切割位点可用于本发明的任何一种目的。各组分在递送到感 兴趣的细胞中以后，通过切割位点连接起来，然后被释放出来独 立存在，或者在细胞内或细胞附近达到最佳活性。在一些实施方 案中，切割位点对于结合体的至少一种组分的药物动力学很重 要。例如，切割位点可以设计和选择为可使一种组分延缓释放。
本发明一般性地提供了识别免疫刺激化合物的有效方法以 及所识别的化合物和制剂。通常，筛选方法包括检测可抑制或增 强通过特定TLR的信号传导的化合物。所述方法使用TLR，一 种合适的TLR的参考配体，以及一种候选免疫刺激化合物。所 选择的TLR与合适的参考化合物(TLR配体)接触，测量TLR 介导的参考信号。所选择的TLR还可以和候选免疫刺激化合物 接触，测量TLR介导的检测信号。然后比较检测信号和参考信 号。然后使用较好的候选免疫刺激化合物作为检测中使用的参考 化合物。这种方法适用于自动的，高通量的候选化合物检测。这 种高通量筛选方法的例子在美国专利No.6,103,479；6,051,380； 6,051,373；5,998,152；5,876,946；5,708,158；5,443,791；5,429, 921；和5,143,854中有描述。
检测混合物含有候选免疫刺激化合物。典型地，复杂检测混 合物同时用不同的试剂浓度检测，得到对各种浓度的不同的应 答。典型地，其中一种浓度是负对照，即浓度为零或者浓度在能 检测到的限度之下。候选免疫刺激化合物包括多种化学物质，典 型地是有机化合物。优选地，候选免疫刺激化合物是小有机化合 物，即分子量大于50小于2500。聚合体候选免疫刺激化合物可 以具有更高的分子量，例如分子量在大约2500到大约12500的 寡核苷酸。候选免疫刺激化合物包括其与多肽之间的结构相互作 用所必需的功能性化学基团，可以包括至少一个胺，羰基，羟基 或羧基，优选有至少两个功能性化学基团，更优选有至少三个功 能性化学集团。候选免疫刺激化合物可以含有被一个或多个上述 识别的功能性基团取代的碳环或者杂环结构和/或芳香或者芳香 聚合物结构。候选免疫刺激化合物也可以是生物分子如核酸，肽， 多糖，脂肪酸，甾醇，类异戊二烯，嘌呤，嘧啶，或者它们的衍 生物或结构类似物，或其组合。如果候选免疫刺激化合物是核酸， 候选的免疫刺激化合物典型地是DNA或RNA分子，虽然也包括 具有非天然键或亚基的修饰核酸。
候选免疫刺激化合物可以来自多种不同的来源，包括天然 的，合成的，或半合成的化合物库，或者它们的任意组合。例如， 可以使用多种方法随机和直接地合成多种不同的有机化合物和 生物分子，包括随机寡核苷酸，合成的有机组合库，随机肽噬菌 体展示库等。可选择地，可以制备细菌，真菌，植物和动物提取 物的天然化合物库。
除此之外，可以通过传统的化学，物理和生物化学方法修饰 天然的和合成的库和化合物。而且，可以使用已知的药理学试剂 进行定向的或随机的化学修饰，如酰化，烷基化，酯化，酰胺 化等，以产生候选免疫刺激化合物的结构类似物。
因此，候选免疫刺激化合物的来源是基于已知TLR配体的分 子库，例如CpG寡核苷酸已知可以和TLR9相互作用，在分子的 一个或多个位点改变配体的结构以含有更多或更少的化学部分 或者不同的化学部分。创建类似物抑制剂库时分子的结构变化可 以是定向的，随机的或者定向与随机取代和/或其它的组合。在制 备组合库的时候本领域普通技术人员可以基于现有的TLR9配体 制备库。
混合物中还可以含有各种其它试剂。包括试剂如盐，缓冲液， 中性蛋白质(例如清蛋白)，去垢剂等等，它们有助于获得最佳 的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸结合。这样的试剂也可以减少反应物 的非特异性或背景相互作用。也可以使用其它能够提高检测效率 的试剂例如蛋白酶抑制剂，核酸酶抑制剂，抗微生物试剂等等。
组分添加的次序，培育的温度，培育的时间，以及其它检测 的参数可以很容易确定。因此试验过程只是检测参数的最优化， 而不是确定检测的基本组成。培育温度一般在4℃和40℃之间。 培育时间优选尽量短以利于进行快速，高通量的筛选，一般在1 分钟到10小时之间。
培育之后，可以使用任何使用者可用的方法检测TLR信号传 导的水平。对于不含细胞的结合类型的检测，经常用分离步骤将 结合的组分与未结合的组分分离开。可以用各种方法进行分离。 例如，可以在溶液中进行分离，或者，至少有一种组分在固体底 物上固定化，未结合的组分可以很容易被分离。固体底物可以是 各种不同的材料以及各种不同的形状，例如微量滴定盘，微球， 检测条，树脂粒子等。底物优选使信噪比达到最大，并减少背景 结合，同时易于分离并降低成本。
例如分离可以通过从容器中移去微球或检测条来进行，倾空 或稀释容器如微量滴定盘的孔，清洗微球，粒子，用洗脱溶液或 溶剂进行柱层析或过滤。分离步骤优选包括漂洗或清洗。例如， 当固体底物是微量滴定盘的时候，其上的孔可以用洗脱溶液洗脱 多次，洗脱溶液一般包括培育混合物中那些不参与特异性结合的 组分，例如盐，缓冲液，去垢剂，非特异性蛋白等等。如果固体 底物是磁珠，这些磁珠可以用洗脱液洗脱一次或多次，然后用磁 铁分离。
在基于细胞的检测中可以用任意适宜的方法进行检测，例如 测量细胞内的，细胞表面的，或由细胞分泌的诱导多肽。
可在基于细胞的检测中使用的检测方法的例子包括荧光激 活细胞分类法(FACS)分析，生物发光，荧光，酶连免疫吸附 检测(ELISA)，逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)等。
可在不含细胞的检测中使用的检测方法的例子包括生物发 光，荧光，酶连免疫吸附检测(ELISA)，逆转录酶-聚合酶链式 反应(RT-PCR)等。
患者指人或动物，包括但不限于狗，猫，马，牛，猪，绵羊， 山羊，鸡，啮齿类动物，例如大鼠和小鼠，灵长类动物，例如猴， 以及鱼或水生生物如有鳍动物(例如鲑鱼)和有壳动物(例如虾 和扇贝)。
适合于治疗和预防方法的患者包括脊椎动物和无脊椎动物。 患者可以是家养动物(例如狗，猫，鱼等)，农业畜养动物(例 如牛，马，猪，鸡等)，实验室动物(例如小鼠，大鼠，兔子等)， 动物园的动物(例如狮子，长颈鹿等)，但是不限于这些。虽然 这里所说的大多是涉及人的疾病，但是本发明也可用于治疗其它 非人的脊椎动物。
这里所说的术语“治疗”，当用于本文所述的一种失调的时候， 同时指能减少患者患失调可能性的预防性治疗和对已患失调的 治疗，例如减小或消除失调的异常或症状，或者防止失调的异常 或症状变得更糟。
患有失调的患者是指所患失调的表现能够客观检测的到的 患者。因此例如，患有癌症的患者是指具有可检测的癌细胞的患 者。患有感染的患者是指暴露于感染微生物中并且机体内具有急 性或慢性可检测的所述微生物的患者。所述感染可以是潜伏的 (静止的)或是活跃的。
具有患失调的危险的患者定义为患有失调的危险性比正常 情况高的患者。正常危险性一般是指没有患失调，并且不易患该 失调，例如由于遗传因素或环境因素，的正常患者所具有的危险 性。因此具有患失调危险的患者包括但不限于由于遗传因素易患 该失调的患者，以及暴露于已知的能引起失调的环境因素中的患 者。环境因素包括但不限于感染性试剂如病毒，细菌，真菌和寄 生虫。其它环境因素包括，例如烟草烟雾，特定的有机化合物， 石棉等等。
术语核酸和其它治疗剂的“有效量”是指必需的或者说足以实 现所需的生物效果的量。一般地，有效量是指能引起免疫系统激 活所必需的量，可导致抗原特异性的免疫反应的产生。在一些实 施方案中，将核酸或其它治疗剂以有效量给药以刺激或诱导Th1 免疫反应或一般的免疫反应。能刺激Th1免疫应答的有效量是指 可以刺激产生一种或多种Th1类细胞因子，例如IL-2，IL-12， TNF-α和IFN-γ，和/或产生一种或多种Th1类抗体的量。
本发明的另一个方面提供了一种在患者中诱导免疫反应的 方法。本发明的所述方法包括给患者施用抗原，给患者施用有效 量的可诱导对此抗原的免疫反应的本发明的免疫刺激组合物。所 述抗原可以在本发明的免疫刺激组合物之前，之后或与其同时给 药。此外，抗原和所述免疫刺激化合物都可以给患者施用多于一 次。
本发明的另一方面进一步提供了一种在患者中诱导免疫反 应的方法。本发明的所述方法包括分离患者的树突状细胞，使所 述树突状细胞在离体与本发明的免疫刺激组合物接触，使树突状 细胞在离体与抗原接触，给患者施用接触后的树突状细胞。
术语“抗原”指能激发免疫反应的分子。术语抗原泛指任何 类型的可以被宿主系统识别为外来物的分子。抗原包括但不限于 微生物抗原，癌抗原和变态反应原。抗原包括但不限于细胞，细 胞提取物，蛋白质，多肽，多糖，多糖结合体，肽和多糖的非肽 模仿物，以及其它分子，小分子，脂类，糖脂类和碳水化合物。 许多抗原都是天然的蛋白或多肽，这是由于蛋白质和多肽通常比 碳水化合物或脂类更具有抗原性。
抗原可以是由核酸载体编码的抗原，或者它也可以不由核酸 载体编码。在前一种情况中，将所述核酸载体给患者施用，抗原 在体内表达。在后一种情况中，抗原可以直接给患者施用。这里 所说的不由核酸载体编码的抗原可以是任何类型的非核酸的抗 原。例如，在本发明的某些方面，不由核酸载体编码的抗原是肽 或多肽。对肽或多肽抗原的初级氨基酸序列进行微小的修饰可以 获得与对应多肽具有相同抗原活性的多肽。这样的修饰可以是定 点突变，或者是自然突变。本申请包括所有由这些修饰产生的并 且仍然具有抗原性的多肽。所述肽或多肽可以是，例如来自病毒 的。本发明中使用的抗原可以使任意长度的，可以是全长蛋白的 小的肽片段，或者是全长形式的多肽。例如，抗原的长度可以是 少于5个，少于8个，少于10个，少于15个，少于20个，少 于30个，少于50个，少于70个，少于100个，或者更多个氨 基酸残基，使得其可以刺激特定的免疫反应。
编码抗原的核酸可操作地连接到基因表达序列上，使得可以 在真核细胞中表达抗原核酸。基因表达序列可以是任何调控核苷 酸序列，例如启动子序列，或者启动子-增强子的组合序列，使 得与之相连的抗原核酸可以进行有效的转录和翻译。例如，基因 表达序列可以是哺乳动物或病毒启动子，例如组成型或诱导型启 动子。哺乳动物组成型启动子包括但不限于下述基因的启动子： 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，腺苷脱氨酶，丙酮酸激酶， β-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。典型的可以在真核细胞 中发挥作用的病毒启动子包括，例如来自巨细胞病毒(CMV)， 猿病毒(例如SV40)，乳头瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒 (HIV)，劳氏肉瘤病毒，莫洛尼氏白血病毒以及其它逆转录病毒 的长末端重复(LTR)的启动子，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶 启动子。其中组成型启动子是本领域普通技术人员公知的。本发 明的可作为基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型 启动子在存在诱导试剂的时候表达。例如，亲金属蛋白启动子在 存在某些金属离子的条件下可被诱导并提高转录核翻译。其它诱 导型的启动子是本领域普通技术人员所公知的。
通常，基因表达序列必须包括分别与转录和翻译起始相关的 5’端非转录和5’端非翻译序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT 序列等等。特别地，5’端非转录序列要包括启动子区域，该启动 子区域包括对与其可操作连接的抗原核酸进行转录调控的启动 子序列。根据需要，基因表达序列任选地包括增强子序列或者上 游活化子序列。
抗原核酸可操作地与基因表达序列相连。这里所说的抗原核 酸序列和基因表达序列，当它们是共价连接以使抗原编码序列的 表达或转录和/或翻译受到基因表达序列的影响或控制的时候，被 认为是可操作地相连的。如果在5’端基因表达序列中启动子的诱 导可以导致抗原序列转录，并且如果两个DNA序列之间的连接 状态没有(1)导致出现移码突变，(2)妨碍启动子区域引导抗 原序列转录的能力，或者(3)妨碍相应的RNA转录并翻译成为 蛋白质的能力，那么这两个DNA序列被认为是可操作地连接。 因此，如果基因表达序列可以使抗原核酸序列转录，并使转录结 果可以翻译成所需的蛋白质或多肽，那么基因表达序列就是可操 作地与抗原核酸序列相连。
本发明的抗原核酸可以单独或者与载体一起递送到免疫系 统中。从广义来说，载体可以是任何能够促进抗原核酸向免疫系 统细胞的传送，以使得抗原可以表达并且呈递到免疫细胞表面的 媒介物。通常使用载体将核酸运输到免疫细胞中会比不使用载体 的降解程度更低。所述载体任选地包括上述基因表达序列以增强 抗原核酸在免疫细胞中的表达。通常可用于本发明的载体包括但 不限于质粒，噬菌粒，病毒，其它来源于病毒或细菌并且能够插 入或结合抗原核酸序列的载体。病毒载体是优选的载体形式，包 括但不限于来自下列病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼 氏鼠白血病毒，Harvey小鼠肉瘤病毒，鼠乳房肿瘤病毒，和劳式 肉瘤病毒；腺病毒，腺病毒相关病毒；SV40类型病毒；多瘤病 毒；爱波斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒； 脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒如逆转录病毒。还可以使用本文 未指出但是本领域公知的其它载体。
优选的病毒载体是基于不引起细胞病变的真核细胞病毒，其 中非必需的基因被感兴趣的基因取代。不引起细胞病变的病毒包 括逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒RNA逆转录为DNA， 然后前病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒可用于人的基 因治疗。大部分有用的逆转录病毒是复制缺陷型的(即能够直接 合成所需蛋白质，但是不能够形成感染性颗粒)。这样经过基因 改造的逆转录表达载体可以用于使基因在体内高效转导。产生复 制缺陷型逆转录病毒的标准操作方法(包括在质粒中引入外源遗 传物质，用质粒对包装细胞进行转染，用包装细胞系产生重组逆 转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，用病毒颗粒感染靶细 胞)在Kriegler，M.，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，W.H.Freeman Co.，New York(1990)和Murray，E.J. Methods in Molecular Biology，vol.7，Humana Press，Inc.，Cliffton， New Jersey(1991)中有描述。
优选的病毒是腺相关病毒，一种双链DNA病毒。腺相关病 毒可以改造成复制缺陷型的，可以感染许多类型和种属的细胞。 它进一步还具有其它优点：例如热稳定性和脂溶剂稳定性；在不 同谱系的细胞，包括造血细胞中具有较高的转导率；并且没有重 复感染抑制因而能够进行多重转导。据说野生型的腺相关病毒表 现出优先整合到人细胞DNA的位点中去的特点，因而可以减少 插入突变的可能性，并降低逆转录病毒感染的插入基因表达的可 变性。除此之外，野生型腺相关病毒的感染在组织培养基中在没 有选择压力的条件下可传代超过100代，表明腺相关病毒的基因 组整合是一种相对稳定的事件。腺相关病毒还可以在染色体外发 挥作用。缺少复制酶蛋白的重组腺相关病毒明显缺乏这种整合序 列的特性。
其它载体包括质粒载体。质粒载体在本领域中已有详细描 述，是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Sambrook et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。在过去几年中，发现质粒 载体对于在体内将基因递送到细胞中是特别有用的，因为它们具 有复制并整合到宿主基因组中的能力。这些质粒具有与宿主细胞 相适应的启动子，可以表达在质粒内可操作地连接的基因编码的 肽。常用的质粒包括pBR322，pUC18，pUC19，pRc/CMV，SV40 和pBlueScript。其它质粒是本领域普通技术人员所熟知的。除此 之外，质粒还可以设计为可使用限制性酶以及连接反应以删除或 插入特定的DNA片段。
最近发现带有基因的质粒可以利用细菌递送到免疫系统中。 细菌的修饰形式例如沙门氏菌可以被质粒转染，用作递送载体。 细菌递送载体可以给宿主患者口服或者通过其它给药方式给药。 细菌可以穿过肠屏障将质粒递送到免疫细胞中，例如B细胞，树 突状细胞。使用这种方法可建立起高水平的免疫保护。这种递送 的方法可用于本发明，进行抗原，核酸，和/或其它治疗试剂的系 统递送。
根据本发明的某些方面，核酸是与治疗剂例如失调特异性药 物一同给药。这里所说的失调特异性药物是主要用于治疗或者预 防失调的治疗或制剂。
一个方面，核苷酸和失调特异性药物的组合使得可以施用更 高剂量的失调特异性药物，而不会引起所述高剂量药物通常会引 起的副作用。另一方面，核酸和失调特异性药物的组合使得两种 化合物都可以施用量较低的亚治疗剂量，但是疗效比这样低剂量 通常所达到的效果更高。在一个实施例中，通过施用免疫刺激核 酸和药物的组合可以获得有效的应答，即使所用药物的量单独不 足以提供治疗上的有益效果(即亚治疗剂量)。在另一个实施例 中，即使所述核酸的量单独不足以提供治疗上的有益效果，组合 给药也可以获得应答。
核酸和/或其它治疗剂也可以以固定的时间表给药或者不定 时给药。各种组合与现有技术中调节免疫应答或预防或治疗失调 的方法相比都具有许多优点，特别是在降低对正常组织的非特异 性毒性上。
癌症是一种细胞不受控制的生长(即分裂)的疾病。一些已 知的可以解释癌细胞不受控制的增殖的机制包括生长因子独立 性，未发现基因突变，以及不恰当的细胞信号传导。癌细胞不受 正常生长控制的能力可以导致增殖速度的增加。虽然癌症的诱因 还不知道，但是已知有许多因素可导致癌症，或者至少使患者易 患癌症。这样的因素包括特定的遗传突变(例如乳腺癌中的 BRCA基因突变，结肠癌中的APC)，暴露于可疑的能引起癌症 的试剂或者致癌物质(例如石棉，UV射线)中，以及特定癌症 的家族因素例如乳腺癌。
癌症可以是恶性的或是非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限 于胆道癌，脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，恶性合体细胞瘤；结肠癌， 子宫内膜癌，食道癌，胃癌，上皮内赘生物；淋巴瘤；肝癌，肺 癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；成神经细胞瘤； 口腔癌，卵巢癌胰腺癌，前列腺癌直肠癌，肉瘤；皮肤癌，睾丸 癌；甲状腺癌，和肾癌，以及其它癌症和肿瘤。在一个实施方案 中，所述癌症是毛细胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮肤T细胞 白血病，多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，鳞状细 胞癌，肾细胞癌，前列腺癌，膀胱细胞癌，或者结肠癌。
“患有癌症的患者”指具有可检测到的癌细胞的患者。
“具有患癌症危险的患者”指患癌症的可能性比正常情况高 的患者。这些患者包括，例如，具有遗传异常的患者，并且此遗 传异常已证明与癌症患病的较高可能性有关，具有癌症家族因素 的患者，暴露于引起癌症的试剂(即致癌物质)例如烟草，石棉 或其它化学毒素中，以及曾经进行过癌症治疗并且病情有明显缓 解的患者。
这里所说的“癌症抗原”是一种化合物，例如一种肽或蛋白， 与肿瘤或癌症细胞表面相结合，当存在MHC分子的时候在抗原 呈递细胞表面表达的时候可以引发免疫反应。癌抗原可以用癌细 胞制备，可以制备癌细胞的粗提物，例如Cohen PA et al.(1994) Cancer Res 54：1055-8中所述的，部分纯化抗原，或者利用重组 技术重新合成已知的抗原。癌抗原包括但不限于重组表达的抗 原，整个肿瘤或癌细胞的免疫原性部分。可以用本领域公知的其 它方法分离或者重组制备这样的抗原。
术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可以互换使用，指在癌细胞 中有差异表达，并且能够用来靶定癌细胞的抗原。癌抗原是可以 明显刺激肿瘤特异性免疫反应的抗原。这样的一些抗原可以由正 常细胞编码，但不是必须在正常细胞中表达。这些抗原包括那些 通常在正常细胞中是沉默的(即不表达)抗原，那些只在分化的 特定阶段表达的抗原，和那些暂时表达的抗原如胚胎或胎儿抗 原。其它癌抗原由突变细胞基因表达，例如致癌基因(例如活化 的ras致癌基因)，抑制基因(例如突变的p53)，由于内部缺失 或染色体移位造成的融合蛋白。还有其它一些癌抗原可以由病毒 基因表达，例如那些RNA和DNA肿瘤病毒携带的基因。肿瘤抗 原的例子包括MAGE，MART-1/Melan-A，gp100，二肽基肽酶IV (DPPIV)，腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)，亲环蛋白b，结肠 直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733，癌胚抗原(CEA)和其免 疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原 (PSA)和其免疫原性表位PSA-1，PSA-2和PSA-3，前列腺特 异性膜表位(PSMA)，T细胞受体/CD3-zeta链，肿瘤抗原MAGE 家族(例如MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4， MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9， MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-Xp2(MAGE-B2)， MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)，MAGE-C1， MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，MAGE-C5)，肿瘤抗原GAGE 家族(例如GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5， GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)，BAGE，RAGE，LAGE-1， NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，酪氨酸酶，p53，MUC家族， HER2/neu，p21ras，RCAS1，α-甲胎蛋白，E-cadherin，α-catenin， β-catenin和γ-catenin，p120ctn，gp100Pmell17，PRAME，NY-ESO-1， cdc27，结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)，胞衬蛋白，连接蛋白37， Ig-独特型，p15，gp75，GM2和GD2神经节苷脂，病毒产物如 人乳头瘤病毒蛋白，肿瘤抗原的Smad家族，Imp-1，PIA，EBV- 编码的核抗原(EBNA)-1，脑糖原磷酸化酶，SSX-1，SSX-2 (HOM-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7，以 及c-erbB-2。
与这些肿瘤(但不是专一地)相关的癌或肿瘤和肿瘤抗原包 括急性淋巴性白血病(etv6；aml1；亲环蛋白b)，B细胞淋巴瘤 (Ig-独特型)，神经胶质瘤(E-cadherin；a-catenin；b-catenin； g-catenin；p120ctn)。膀胱癌(p21ras)，胆囊癌(p21ras)，乳腺 癌(MUC家族；HER2/neu；c-erbB-2)，子宫颈癌(p53；p21ras)， 结肠癌(p21ras；HER2/neu；c-erbB-2；MUC家族)，结肠直肠 癌(结肠直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733；APC)，恶性合 体细胞瘤(CEA)，上皮细胞癌(亲环蛋白b)，胃癌(HER2/neu； c-erbB-2；ga733糖蛋白)，肝细胞癌(α-甲胎蛋白)，霍金氏淋巴 瘤(Imp-1；EBNA-1)，肺癌(CEA；MAGE-3；NY-ESO-1)，淋 巴样细胞衍生的白血病(亲环蛋白b)，黑色素瘤(p15蛋白，gp75， 癌胚抗原，GM2和GD2神经节苷脂)，骨髓瘤(MUC家族； p21ras)，非小细胞肺癌(HER2/neu；c-erbB-2)，鼻咽癌(Imp-1； EBNA-1)，卵巢癌(MUC家族；HER2/neu；c-erbB-2)，前列腺 癌(前列腺特异性抗原(PSA)和其免疫原性表位PSA-1，PSA-2 和PSA-3；PSMA；HER2/neu；c-erbB-2)，胰腺癌(p21ras；MUC 家族；HER2/neu；c-erbB-2；ga733糖蛋白)，肾癌(HER2/neu； c-erbB-2)，子宫颈和食道的鳞状上皮细胞癌(病毒产物如人乳头 瘤病毒蛋白)，睾丸癌(NY-ESO-1)，T-细胞白血病(HTLV-1表 位)，和黑色素瘤(Melan-A/MART-1；cdc27；MAGE-3；p21ras； gp100Pmell17)。
与MHC I和MHC II分子中的任一个或同时与两者结合的肿 瘤抗原的例子参见下述参考文献：Coulie，Stem Cells 13： 393-403，1995；Traversari et al.J Exp Med 176：1453-1457，1992； Chaux et al.J Immunol 163：2928-2936，1999；Fujie et al.Int J Cancer 80：169-172，1999；Tanzarella et al.Cancer Res 59： 2668-2674，1999；van der Bruggen et al.Eur J lmmunol 24： 2134-2140，1994；Chaux et al.J Exp Med 189：767-778，1999； Kawashima et al.Hum Immunol 59：1-14，1998；Tahara et al.Clin Cancer Res 5：2236-2241，1999；Gaugler et al.J Exp Med 179： 921-930，1994；van der Bruggen et al.Eur J Immunol 24： 3038-3043，1994；Tanaka et al.Cancer Res 57：4465-4468，1997； Oiso et al.Int J Cancer 81：387-394，1999；Herman et al. Immunogenetics 43：377-383，1996；Manici et al.J Exp Med 189： 871-876，1999；Duffour et al.Eur J Immunol 29：3329-3337，1999； Zorn et al.Eur J Immunol 29：602-607，1999；Huang et al.J Immunol 162：6849-6854，1999；Boel et al.Immunity 2： 167-175，1995；Van den Eynde et al.J Exp Med 182：689-698，1995； De Backeretal.CancerRes 59：3157-3165，1999；Jager et al.J Exp Med 187：265-270，1998；Wang et al.J Immunol 161： 3596-3606，1998；Aarnoudse et al.Int J Cancer 82：442-448，1999； Guilloux et al.J Exp Med 183：1173-1183，1996；Lupetti et al.J Exp Med 188：1005-1016，1998；Wolfel et al.Eur J Immunol 24： 759-764，1994；Skipper et al.J Exp Med 183：527-534，1996；Kang et al.J Immunol 155：1343-1348，1995；Morel et al.Int J Cancer 83： 755-759，1999；Brichard et al.Eur J Immunol 26：224-230，1996； Kittlesen et al.J Immunol 160：2099-2106，1998；Kawakami et al.J Immunol 161：6985-6992，1998；Topalian et al.J Exp Med 183： 1965-1971，1996；Kobayashi et al.Cancer Research 58： 296-301，1998；Kawakami et al.J Immunol 154：3961-3968，1995； Tsai et al.J Immunol 158：1796-1802，1997；Cox et al.Science 264： 716-719，1994；Kawakami et al.Proc Natl Acad Sci USA 91： 645 8-6462，1994；Skipper et al.J Ilmmunol 157：5027-5033，1996； Robbins et al.J Immunol 159：303-308，1997；Castelli et al. J Immunol 162：1739-1748，1999；Kawakami et al.J Exp Med 180： 347-352，1994；Castelli et al.J Exp Med 181：363-368，1995； Schneider et al.Int J Cancer 75：451-458，1998；Wang et al.JExp Med 183：1131-1140，1996；Wang et al.J Exp Med 184： 2207-2216，1996；Parkhurst et al.Cancer Research 58： 4895-4901，1998；Tsang et al.J Natl Cancer Inst 87：982-990，1995； Correale et al.J Natl Cancer Inst 89：293-300，1997；Coulie et al. Proc Natl Acad Sci USA 92：7976-7980，1995；Wolfel et al.Science 269：1281-1284，1995；Robbins et al.J ExP Med 183： 1185-1192，1996；Brandle et al.J Exp Med 183：2501-2508，1996；ten Bosch et al.Blood 88：3522-3527，1996；Mandruzzato et al.J Exp Med 186：785-793，1997；Gueguen et al.J Immunol 160： 6188-6194，1998；Gjertsen et al.Int J Cancer 72：784-790，1997； Gaudin et al.J Immunol 162：1730-1738，1999；Chiari et al. CancerRes 59：5785-5792，1999；Hogan et al.Cancer Res 58： 5144-5150，1998；Pieper et al.J Exp Med 189：757-765，1999；Wang et al.Science 284：1351-1354，1999；Fisk et al.J Exp Med 181： 2109-2117，1995；Brossart et al.Cancers 58：732-736，1998；Ropke et al.Proc Natl Acad Sci USA 93：14704-14707，1996；Ikeda et al. Immunity 6：199-208，1997；Ronsin et al.Immunol 163： 483-490，1999；Vonderheide et al.Immunity 10：673-679，1999。这 些抗原以及其它抗原在PCT申请PCT/US98/18601中公开。
本发明的组合物和方法可以单独使用，也可以和其它用于治 疗癌症的试剂和方法一同使用。目前治疗癌症有很多种方法，包 括外科手术，放射治疗和化学治疗。治疗方式的选择取决于癌症 的类型，部位和弥散性。例如，外科手术和放射治疗对于固体的 明确的肿瘤物质更合适一些，而对于非固体肿瘤癌症例如白血病 和淋巴瘤则较不实用。外科手术和放射治疗的一个优点在于它们 可以在某种程度上控制治疗的效果，因此可以限制对身体正常组 织的毒性。但是，外科手术和放射治疗通常要再进行化学治疗以 避免残余癌细胞或是具有放射抗性的癌细胞。化学治疗对于弥散 性癌症例如白血病和淋巴瘤，以及癌症转移是最适合的疗法。
化学治疗指使用化学和/或生物制剂攻击癌细胞的治疗方法。 与局部的外科手术和放射治疗不同，化学治疗是全身给药的，因 此它对正常组织的毒性是主要问题所在。由于许多化学治疗的试 剂都是根据增殖情况靶定癌细胞，因此如胃肠道和骨髓这样正常 增殖的组织也可能受到化学治疗的影响。化学治疗的一种主要副 作用就是脊髓抑制(包括贫血，中性白细胞减少以及血小板减 少)，这可能导致正常造血前体的死亡。
已知有许多化学治疗剂可用于治疗癌症。然而并不是所有的 肿瘤都对化学治疗剂有反应，而其它对化学治疗剂的初始反应可 能引起抗性。因此寻找有效的抗肿瘤药物就是要寻找具有更低的 非特异性毒性并且更有效的制剂。
癌症药物可以多种方式发挥作用。一些癌症药物是通过靶定 肿瘤细胞特异的生理机制来起作用。其例子包括靶定在癌细胞中 突变的特定的基因和它们的基因产物(即主要是蛋白)。这样的 基因包括但不限于致癌基因(例如Ras，Her2，bcl-2)，肿瘤抑 制基因(例如EGF，p53，Rb)，和细胞周期的靶(例如CDK4， p21，端粒酶)。另一方面癌症药物可以靶定癌细胞中改变的信号 传导途径和分子机制。可以使用单克隆抗体在其细胞表面表达表 位来靶定癌细胞。这种癌症治疗在这里一般称为免疫治疗。
其它癌症药物可靶定除癌细胞以外的细胞。例如，一些药物 可启动免疫系统攻击肿瘤细胞(即癌疫苗)。还有其它药物，叫 做血管生成抑制剂，是通过破坏实体肿瘤的血液供应发挥作用 的。由于大部分恶性癌症都可以发生转移(即退出初始的肿瘤部 位，在另一个部位生长，从而形成第二个肿瘤)，能够防止发生 转移的药物也可以用于治疗癌症。抗血管生成调节剂包括基本的 FGF，VEGF，促血管生成素，血管抑素，血管内皮抑素，TNF-α， TNP-470，凝血栓蛋白-1，血小板因子4，CAI，和整合素蛋白家 族的特定成员。这种类型的药物中的一种就是金属蛋白酶抑制 剂，可以抑制癌细胞所用的酶并使之停留于初级肿瘤中，并且防 止其外渗到其它组织中去。
一些癌细胞具有抗原性，因而可以被免疫系统靶定。一方面 将核酸和癌症药物，特别是那些癌症免疫治疗的药物进行组合给 药，可用于刺激针对癌抗原的特异性免疫反应。
根据免疫监视理论，免疫系统的基本功能就是在肿瘤形成之 前发现并消除新生物细胞。此理论的基本原理就是癌细胞与正常 细胞在抗原性上是不同的，因此可以引发与对不相容的同种异体 移植物的免疫排斥类似的免疫反应。研究表明，肿瘤细胞在抗原 表达的质量和数量上都不相同。例如“肿瘤特异性抗原”是能特 异地与肿瘤结合而不能与正常细胞结合的抗原。肿瘤特异性抗原 的例子是DNA或RNA病毒诱导的肿瘤中的病毒抗原。“肿瘤结 合”抗原在肿瘤细胞中和正常细胞中都存在，但是在肿瘤细胞中 其数量和形式都不同。这样的抗原的例子是癌胚抗原(例如癌胚 抗原)，分化抗原(例如T和Tn抗原)，以及致癌基因产物(例 如HER/neu)。
已经识别了不同类型的能在体外和体内杀死肿瘤靶的细胞： 天然杀伤(NK)细胞，细胞溶解型T淋巴细胞(CTL)，淋巴因 子激活的杀伤细胞(LAK)，以及活化的巨噬细胞。NK细胞不用 特异的抗原激活就可以杀死肿瘤细胞，其活性不要求存在靶细胞 的主要组织相容性复合物(MHC)编码的I类抗原。NK细胞被 认为参与新生肿瘤的控制以及肿瘤转移的控制。与NK细胞相反， CTL只有在被肿瘤抗原激活以后并且当靶抗原在表达1类MHC 的肿瘤细胞上表达的时候，才杀死肿瘤细胞。CTL被认为是排 斥迁移的肿瘤和DNA病毒引起的肿瘤的效应细胞。LAK细胞是 与NK和CTL细胞群不同的无效淋巴细胞的一个亚基。激活的巨 噬细胞一旦被激活，其杀死肿瘤细胞的方式既不是抗原依赖型 的，也不是MHC限制型的。激活的巨噬细胞可以降低其所进入 的肿瘤的生长速度。体外检测还识别了其它的免疫机制，例如抗 体依赖型，细胞介导的细胞毒性反应和抗体加补体的溶解作用。 但是这些免疫效应机制在体内都不如NK，CTL，LAK和巨噬细 胞在体内的功能重要(其综述可参见Piessens WF et al.″Tumor Immunology″，In：Scientific American Medicine，Vol.2，Scientific American Books，N.Y，pp.1-13，1996)。
免疫治疗的目标就是增强患者对已存在的肿瘤的免疫反应。 一种免疫治疗的方法包括使用佐剂。佐剂物质可来自微生物，例 如卡介杆菌，可提高动物的免疫反应并且增强其对于肿瘤的抗 性。
免疫治疗剂是来自于能特异性结合或识别癌抗原的抗体或 抗体片段的药物。基于抗体的免疫治疗可以通过与癌细胞表面结 合并且刺激内源免疫系统攻击癌细胞来发挥作用。另一种基于抗 体的治疗就是将毒性物质特异性靶定癌细胞的递送系统。抗体通 常与毒素如蓖麻蛋白(例如来自于蓖麻子)，卡奇霉素和美登素 类结合，与放射性表位如碘-131和钇-90结合，与化学治疗剂(如 本文所述的)结合，与生物反应调节剂结合。通过这种方法毒性 物质会在癌部位聚积，从而可以使对正常细胞的非特异性毒性减 至最小。除了使用癌抗原特异性的抗体之外，本发明还可以使用 可与脉管系统结合，例如可与内皮细胞结合的抗体。这是因为实 体瘤通常依赖于新生成的血管存活，因此大部分肿瘤都能够补充 和刺激新生血管的生长。因此，许多癌症药物的策略就是破坏供 给肿瘤的血管和/或破坏支持这些血管的连接组织(或基质)。
癌疫苗是能够刺激针对癌细胞的内源免疫反应的药物。目前 已经生产的疫苗主要是激活体液免疫系统(即抗体依赖型的免疫 反应)。其它目前还在研究的疫苗主要是激活细胞介导的免疫系 统，包括能杀死肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞。癌疫苗一般可 以增强癌抗原向抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)和 /或其它免疫细胞如T细胞，B细胞和NK细胞的呈递。
虽然癌疫苗可以具有几种形式，如下文所述，它们的目的都 是将癌抗原和/或癌相关抗原递送到抗原呈递细胞(APC)中，以 便于APC处理这些抗原，并最终将抗原呈递到具有I类MHC分 子的细胞表面上。癌疫苗的一种形式就是全细胞疫苗，就是将患 者体内分离出的癌细胞进行离体处理，然后再将整个细胞送入患 者体内。肿瘤细胞的溶解产物也可以用做癌抗原以引发免疫反 应。癌疫苗的另一种形式是肽疫苗，它利用癌特异的或癌结合的 小分子蛋白激活T细胞。癌结合蛋白是不完全由癌细胞表达的蛋 白(即其它正常细胞也可以表达这些抗原)。但是癌结合抗原的 表达一般总是受到特定类型的癌细胞的正调控。其它癌疫苗包括 神经节苷脂疫苗，热休克蛋白疫苗，病毒和细菌疫苗，以及核酸 疫苗。
癌疫苗的另一种形式是树突状细胞疫苗，包括在体外暴露于 癌抗原或癌相关抗原中的完整的树突状细胞。树突状细胞的溶解 产物和膜组分也可以作为癌疫苗。树突状细胞疫苗可以直接激活 APC。树突状细胞是一种专门的APC。树突状细胞通过呈递抗原， 并且通过表达可以在本地发现微生物分子如LPC的模式识别受 体，从而在天然的和获得性免疫系统之间形成连接。树突状细胞 有效地内在化，处理和呈递其所暴露于其中的可溶特异性抗原。 内在化和呈递抗原的过程引起对主要组织相容性复合物(MHC) 和共刺激分子的表达，细胞因子的产生，向淋巴组织迁移的快速 的正调控，这些过程被认为是涉及T细胞的活化。
这里所说的化学治疗剂包括所有其它形式的不属于免疫治 疗剂或癌疫苗范畴的癌症药物。这里所说的化学治疗剂包括化学 和生物制剂。这些制剂可以抑制癌细胞的继续存活所依赖的细胞 活性。化学治疗剂的种类包括烷基化/生物碱制剂，抗代谢物，激 素或激素类似物，以及各种抗肿瘤药物。其中的大部分制剂都不 是直接对癌细胞有毒性作用的，也不需要免疫激活。
这里所说的“感染性疾病”或者等同的“感染”，指由于感 染性生物体宿主的表面、局部或全身性入侵所导致的失调。感染 性生物体包括细菌，病毒，真菌和寄生虫。相应地，“感染性疾 病”包括细菌感染，病毒感染，真菌感染和寄生虫感染。
患有感染性疾病的患者指暴露于感染性生物体中并且体内 具有急性或慢性的可检测到的所述生物体。暴露于感染性生物体 中通常是发生在患者的外表面，例如皮肤或粘膜上，和/或感染性 生物体通过患者的外表面进入到内部。
具有患感染性疾病危险的患者是指暴露于引发感染的病原 体中时其危险性比正常情况下更高的患者。例如，具有患病危险 的患者可以指计划到存在特定类型感染源的地方旅行的患者，或 者它也可以指其生活方式或者治疗方式是暴露于含有感染性生 物体的体液或者直接暴露于感染性生物体之中的患者，或者是生 活在存在感染性生物体的地区的患者。具有患感染性疾病危险的 患者还包括医疗机构建议针对特定感染性生物体进行疫苗接种 的一般人群。
具有患感染性疾病危险的患者包括那些通常具有暴露于微 生物如流感病毒之中的危险，但是在本发明的治疗过程疾病并没 有发作的患者。还包括那些由于医疗和环境因素使得患者暴露于 特定微生物之中因而具有患有感染性疾病的危险的患者。
细菌是单细胞生物，可以通过二分体分裂进行无性繁殖。它 们是基于其形态，染色反应，营养和代谢要求，抗原结构，化学 组分和遗传同源性进行分类和命名的。
细菌可以基于其形态学特征分为三种，球形(球菌)，直棒 型(杆菌)和弯曲或螺旋棒型(弧菌，弯曲菌，螺菌，和螺旋菌)。 细菌也可以普遍根据其染色反应分为两类：革兰氏阳性和革兰氏 阴性。革兰氏是指一种微生物实验室中常用的染色方法。革兰氏 阳性生物在染色程序完成以后不脱色，显示为深紫色。革兰氏阴 性生物在染色以后脱色，但是吸收复染剂，呈现粉红色。
感染性细菌包括但不限于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。革 兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德氏菌，葡萄球菌和链球菌。革 兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌，假单胞菌，和沙门氏菌。 感染性细菌的实例包括但不限于Helicobacter pyloris，伯氏疏螺 旋菌，嗜肺军团杆菌，分枝杆菌属(例如结合分枝杆菌，鸟形分 枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，戈氏分枝杆菌)，金 黄色葡萄球菌，奈瑟氏淋病球菌，奈瑟氏脑膜炎球菌，单胞李斯 特菌，化脓性链球菌(链球菌A)，无乳链球菌(链球菌B)，链 球菌(草绿色)，粪链球菌，牛链球菌，链球菌(厌氧菌)，肺炎 链球菌，病原性弯曲杆菌属，肠球菌属，流感嗜血杆菌，炭疽杆 菌，白喉棒状杆菌，棒状杆菌属，猪丹毒杆菌，产气荚膜梭状芽 孢杆菌，破伤风杆菌，产气肠杆菌，克雷白氏肺炎杆菌，多杀性 巴氏杆菌，拟杆菌属，具核梭杆菌，念珠状链杆菌，梅毒螺旋体， 纤细密螺旋体，钩端螺旋体，立克次体，和以色列放线菌。
病毒是小的感染性物质，它含有核酸核心核蛋白包衣，但不 是独立的生命体。病毒也可以仅以感染性核酸的形式存在，而不 含有蛋白质。没有活细胞病毒则不能存活，它要在活细胞内复制。 病毒通过细胞内吞作用或者直接注射DNA(噬菌体)而进入特 定的活细胞并进行繁殖，从而引起疾病。繁殖后的病毒被释放出 去并感染其它细胞。一些病毒是含有DNA的病毒，其它是含有 RNA的病毒。本发明的某些方面还提供了治疗疾病的方法，所 述疾病中蛋白感染素与疾病的发生相关，如动物的牛绵状脑病 (即疯牛病，BSE)或者瘙痒传染病，或者人的克劳伊氏病。
病毒包括但不限于肠道病毒(包括但不限于小核糖核酸病毒 家族，例如脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，人肠道孤病毒)，轮 状病毒，腺病毒，肝炎病毒。在人身上发现的特定病毒包括但不 限于：逆转录病毒(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也称为 HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-111；以及其它种群， 如HIV-LP；小核糖核酸病毒(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎 病毒，肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，人肠道孤病毒)； Calciviridae(例如能引起肠胃炎的病毒)；囊膜病毒(例如人脑 炎病毒，风疹病毒)；黄病毒(例如登革热病毒，脑炎病毒，黄 热病毒)；冠状病毒(例如冠状病毒)；棒状病毒(例如疱疹性口 炎病毒，狂犬病毒)；线病毒(例如埃博拉病毒)；副粘病毒(例 如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正 粘病毒(例如流感病毒)；Bungaviridae(例如汉他病毒，bunga virus，phlebovirus和内罗病毒)；沙粒病毒(出血热病毒)；呼吸 道肠道病毒(例如呼吸道肠道病毒，环状病毒和轮状病毒)；双 核糖核酸病毒；肝病毒(乙型肝炎病毒)；细小病毒(细小病毒)； 乳头瘤病毒(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒(大部分腺病毒)； 疱疹病毒(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒， 巨细胞病毒(CMV))；痘病毒(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)； 虹色病毒(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如绵状 脑病的致病病毒，丁型肝炎的致病病毒(被认为是乙型肝炎病毒 的缺陷型卫星)，非甲非乙型肝炎的致病病毒(1类是内部传播； 2类是肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺沃克因子及相关病毒，以及 星状病毒)。
真菌是真核生物，其中只有少部分会在脊椎哺乳动物中引起 感染。由于真菌是真核生物，因此它们在尺寸，结构特征，生命 周期和繁殖机理上与原核细菌明显不同。真菌是基于其形态特 征，繁殖方式和培养特性分类的。虽然真菌可以在患者中引起不 同类型的疾病，例如吸入真菌抗原后引起呼吸过敏，食入真菌物 质后引起真菌中毒，例如有毒的蘑菇产生的毒鹅膏菌毒素和鬼笔 毒素，以及曲霉菌产生的黄曲霉毒素，但是并不是所有的真菌都 会引起感染性疾病。
感染性真菌可以引起系统性或表皮感染。正常的健康患者可 以发生初级的系统感染，在免疫缺陷的患者中更常见机会性病原 体感染。最常见的引起初级系统感染的真菌包括芽生菌，球孢子 菌，和Htoplasma。可引起免疫缺陷的或免疫抑制的患者患机会 性病原体感染的常见真菌包括但不限于白色假丝酵母，新生隐球 菌，和不同的曲霉。系统性真菌感染是一种内脏器官的入侵性感 染。生物体通常通过肺，胃肠道或静脉导管进入人体。这些类型 的感染可以由初级病原体真菌或者机会性真菌引起。
表面真菌感染包括真菌在皮肤外表面上生长而不侵入内部 组织。典型的表面真菌感染包括涉及皮肤，毛发或指甲的皮肤真 菌感染。
与真菌感染相关的疾病包括曲霉病，芽生菌病，念珠菌病， 着色芽生菌病，球孢子菌病，隐球菌病，真菌眼感染病，真菌毛 发，指甲，和皮肤感染，组织胞浆菌病，罗布菌病，耳真菌病， 巴西芽生菌病，弥散性马尔尼菲青霉菌，暗色核菌病，鼻孢子虫 病，分支孢菌病和接合霉菌病。
寄生虫是依赖于其它生物体存活的生物体，因此它们进入， 或者说感染其它生物体以延续它们的生命周期。被感染的生物 体，也就是宿主，为寄生虫提供了营养和生活环境。虽然从广义 上来讲术语寄生虫可以包括所有的感染性致病原(即细菌，病毒， 真菌，原生动物和蠕虫)，但是一般而言，这个术语仅用于表示 原生动物，蠕虫，和外寄生的节肢动物(例如蜱，螨等)。原生 动物是单细胞生物体，可以在细胞内或细胞外进行复制，特别是 在血液中，肠道中或者在组织的细胞外基质中。蠕虫是多细胞生 物体，几乎都是在细胞外生存(除了旋毛形线虫)。蠕虫的复制 通常需要离开第一宿主并转至第二宿主中。与上述种类相反，外 寄生的节肢动物与宿主身体的外表面构成寄生关系。
寄生虫包括细胞内寄生虫和绝对细胞内寄生虫。寄生虫的实 例包括但不限于恶性疟原虫，卵形疟原虫，疟疾疟原虫，微小疟 原虫，诺氏疟原虫，巴贝斯虫，divergens巴贝斯虫，枯氏锥虫， 刚地弓形虫，旋毛形线虫，巨大利什曼原虫，杜氏利什曼原虫， 巴西利什曼原虫，热带利什曼原虫，冈比亚锥虫，罗得西亚锥虫 和曼氏血吸虫。
其它医学相关的微生物在文献中已有详细描述，例如，参见 C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，在此引入其全文作为参考。上述所有列表都只是举 例说明而不是限制本发明。
本发明的组合物和方法可以单独使用，或者也可以和其它用 于治疗感染的试剂和方法一同使用。感染药物包括但不限于抗细 菌制剂，抗病毒制剂，抗真菌制剂，抗寄生虫制剂。短语如“抗 感染制剂”，“抗生素”，“抗细菌制剂”，“抗病毒制剂”，“抗真菌 制剂”，“抗寄生虫制剂”和“驱虫剂”的含义都是本领域普通技术人 员所公知的，具有标准的医学术语定义。抗细菌制剂可以短暂地 杀死或抑制细菌，包括抗生素和其它具有类似功能的合成的和天 然化合物。抗病毒制剂可以从天然来源分离出来，或者可以合成， 可用于杀死或抑制病毒。抗真菌制剂用于治疗表皮真菌感染或者 机会性和初级系统真菌感染。抗寄生虫制剂杀死或抑制寄生虫。 许多抗生素都是低分子量的分子，是细胞如微生物的次级代谢 物。通常抗生素可以干扰微生物特异的并且宿主细胞不具有的一 种或多种功能和结构。
抗感染治疗的一个问题就是其对用抗感染制剂治疗的宿主 具有副作用。例如，许多抗感染制剂都可以杀死或者抑制广谱微 生物，而不是特异地针对特定的细胞种类。用这些类型的抗感染 制剂进行治疗会导致杀死宿主细胞中生长的正常的微生物种群。 同时也杀死感染性微生物。由于微生物种群与感染性病原体竞 争，并作为其屏障，因此微生物种群的丧失会导致疾病并发症， 并使宿主易于感染其它病原体。这些化学实体对于非微生物细胞 或者宿主的组织的特异性或非特异性作用会导致其它副作用。
广泛使用抗感染药物的另一个问题是出现了具有抗生素抗 性的微生物。已出现了抗万古霉素的肠球菌，抗青霉素的肺炎双 球菌，多抗性的金黄色葡萄球菌和多抗性的肺结核菌株，并且它 们已经成为临床上的主要问题。抗感染药物的广泛应用可能会产 生许多具有抗生素抗性的细菌。因此需要新的抗感染策略来对抗 这些微生物。
抗细菌的抗生素可以有效杀死或抑制许多细菌，称为广谱抗 生素。其它类型的抗细菌的抗生素主要是对于革兰氏阳性菌或革 兰氏阴性菌有效。这类抗生素称为窄谱抗生素。其它对单一的生 物体或疾病有效，对其它类型的细菌无效的抗生素称为限谱抗生 素。
抗细菌制剂有时可以基于它们的主要作用方式来分类。通 常，抗细菌制剂是细胞壁合成抑制剂，细胞膜抑制剂，蛋白合成 抑制剂，核酸合成或功能抑制剂，以及竞争性抑制剂。细胞壁合 成抑制剂抑制细胞壁合成过程中的一个步骤，通常是抑制细菌肽 聚糖的合成。细胞壁合成抑制剂包括β-内酰胺抗生素，天然青霉 素，半合成青霉素，氨苄青霉素，克拉布兰酸，cephalolsporins， 和杆菌肽。
β-内酰胺是含有四元β-内酰胺环的抗生素，可以抑制肽聚糖 合成的最后一步。β-内酰胺抗生素可以是合成的或是天然的。由 青霉菌产生的β-内酰胺抗生素是天然青霉素，例如青霉素G或青 霉素V。这些物质是通过产黄青霉的发酵产生的。天然青霉素具 有窄谱活性，通常只对链球菌，淋球菌和葡萄球菌有效。其它类 型的对革兰氏阳性细菌也有效的青霉素，包括青霉素G，X，K 和O。
半合成青霉素通常是对霉菌产生的分子6-氨基青霉烷酸进 行修饰。6-氨基青霉烷酸可以通过增加副链进行修饰，产生比天 然青霉素具有更广谱活性的或者具有其它优良性质的青霉素。某 些类型的半合成青霉素对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有广 谱效果，但是可以被青霉素酶失活。这些半合成青霉素包括氨苄 青霉素，羧苄青霉素，甲苯异恶唑青霉素，阿洛西林，美洛西林， 和氧哌嗪青霉素。其它类型的半合成青霉素对革兰氏阳性细菌具 有较窄谱活性，但是具有其它性质使其不会被青霉素酶失活。这 些青霉素包括，例如二甲氧基苯青霉素，双氯青霉素，和乙氧萘 青霉素。一些广谱半合成青霉素可以和β-内酰胺酶抑制剂，例如 克拉布兰酸和舒巴坦组合使用。β-内酰胺酶抑制剂不具有抗微生 物的活性，但它们可以抑制青霉素酶，因此可以保护半合成青霉 素不被降解。
天然青霉素和半合成青霉素的一个严重的副作用就是青霉 素过敏。青霉素过敏非常严重，可以快速引起死亡。青霉素过敏 的患者其β-内酰胺分子会连接到血清蛋白上，启动IgE介导的炎 性反应。炎性反应引起了过敏性反应并且可能导致死亡。
另一种b-内酰胺抗生素是Cephalolsporins。它们对β-内酰胺 酶的降解很敏感，因此在单独使用的时候并不总是有效的。但是 Cephalolsporins对青霉素酶具有抗性。它们可有效抵抗许多不同 种类的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。Cephalolsporins包括但不 限于头孢菌素，头孢吡硫，苯甘头孢菌素，羟苄四唑头孢菌素， 氯氨苄头孢菌素，头孢唑林，头孢呋辛，甲氧噻吩头孢菌素，氨 噻肟头孢菌素，磺吡苄头孢霉素，头孢他美，头孢克肟，头孢三 嗪，头孢哌酮，头孢他啶，和羟羧氧酰胺菌素。
枯草杆菌抗生素是另一类可以抑制细胞壁合成的抗生素，是 通过抑制muropeptide亚基或肽聚糖从分子上释放从而抑制所述 分子将该亚基释放到膜外。虽然枯草杆菌抗生素可有效抵抗革兰 氏阳性细菌，但是它的使用一般局限于局部使用，这是由于它具 有较高毒性。
碳青霉烯类是另一类可以抑制细胞壁合成的广谱-内酰胺 抗生素。碳青霉烯类的例子包括但不限于亚胺培南。单杆菌也是 一种广谱β-内酰胺抗生素，包括euztreonam。一种由链霉菌属产 生的抗生素，万古霉素，也可以通过抑制细胞膜合成有效抵抗革 兰氏阳性细菌。
另一类抗细菌制剂是细胞膜合成抑制剂。这些化合物可以破 坏细菌膜的结构或者抑制其功能。抗细菌制剂的一个问题就是细 胞膜抑制剂对真核细胞和细菌都起作用，因为细菌和真核生物的 膜的磷脂很相似。因此这些化合物很少全身性施用，并且也不进 行高剂量的局部给药。
一种临床上使用的细胞膜抑制剂是多粘菌素。多粘菌素通过 与细胞膜的磷脂结合破坏细胞膜。多粘菌素主要是能有效抵抗革 兰氏阴性细菌，一般用于严重的假单胞菌感染，或者对较小毒性 的抗生素具有抗性的假单胞菌感染。这种化合物的系统性给药所 造成的严重的副作用包括肾和其它器官的损伤。
其它细胞膜抑制剂包括两性霉素B和制霉菌素，它们都是抗 真菌试剂，主要用于治疗系统性真菌感染和白假丝酵母感染的治 疗。咪唑是另一种细胞膜抑制剂类抗生素。咪唑可用于抗细菌制 剂，也可以用做抗真菌制剂，例如用于治疗酵母感染，皮肤真菌 感染和系统性真菌感染。咪唑包括但不限于克霉唑，双氯苯咪唑， 酮康唑，伊曲康唑，和氟康唑。
许多抗细菌制剂都是蛋白合成抑制剂，这些化合物防止细菌 合成结构蛋白和酶，因而导致细菌的细胞生长或功能受到抑制或 者导致细胞死亡。通常这些化合物可以干扰转录和翻译。阻断转 录的抗细菌制剂包括但不限于利福平和乙胺丁醇。利福平可以抑 制酶RNA聚合酶，具有广谱活性，可有效抵抗革兰氏阳性和革 兰氏阴性细菌，以及结核杆菌。乙胺丁醇可有效抵抗结核杆菌。
可阻断翻译的抗细菌制剂可干扰细菌核糖体，以防止mRNA 被翻译成蛋白。通常这类化合物包括但不限于四环素，氯霉素， 大环内酯(例如红霉素)和氨基配糖体(例如链霉素)。
氨基配糖体是一类由链霉菌属的细菌产生的抗生素，例如链 霉素，卡那霉素，托普霉素，丁胺卡那霉素和庆大霉素。氨基配 糖体用于抵抗很多由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的细菌 感染。链霉素被广泛用作治疗肺结核的初级药物。庆大霉素可抵 抗许多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括假单胞菌感染，特 别是和托普霉素一起使用。卡那霉素可抵抗许多革兰氏阳性细 菌，包括抗青霉素的葡萄球菌。氨基配糖体的一个副作用限制了 其临床使用，就是其有效剂量的长期使用可以损伤肾功能，并会 破坏听觉神经引起失聪。
另一种翻译抑制抗细菌制剂是四环素。四环素是一类广谱抗 生素，可抵抗多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。四环素的实例 包括四环素，二甲胺四环素，强力霉素，和氯四环素。它们对于 许多类型细菌的治疗都非常重要，尤其是对于莱姆病非常重要。 它们具有较低的毒性和较小的直接副作用，因此四环素被医疗团 体过度使用和滥用，造成了许多问题。例如，它的过度使用导致 抗性的广泛出现。
抗细菌制剂例如大环内酯可逆地与50S核糖体亚基结合，抑 制蛋白通过肽基转移酶的延长，或者抑制不带电荷的tRNA从细 菌核糖体上释放，或者两者均抑制。这些化合物包括红霉素，罗 红霉素，克拉霉素，竹桃霉素，和阿奇霉素。红霉素可以抵抗大 部分革兰氏阳性菌，奈瑟氏菌，军团杆菌，和嗜血杆菌，但是不 能抵抗肠杆菌。林肯霉素和氯林霉素可以阻止蛋白合成过程中肽 键的形成，可用于抵抗革兰氏阳性菌。
另一种翻译抑制剂是氯霉素。氯霉素可以结合70S核糖体， 抑制细菌酶肽基转移酶，因而能够防止蛋白合成过程中肽链的延 长。氯霉素的一个严重的副作用就是再生障碍性贫血。在一小部 分(1/50,000)患者中有效治疗量的氯霉素可引起再生障碍性贫 血。氯霉素曾经是非常频繁使用的处方抗生素，但是由于贫血导 致的死亡现在很少使用。但是由于其效果很好，它在生命受到威 胁的情况(例如伤寒)下仍然也被使用。
一些抗细菌制剂可破坏核酸合成或其功能，例如可与DNA 或RNA结合使得它们携带的信息不能被读取。这些制剂包括但 不限于喹诺酮和增效磺胺甲基异恶唑，既包括合成化学药品也包 括利福霉素，一种天然的或是半合成的化学药品。喹诺酮可通过 抑制DNA促旋酶而阻断细菌DNA的复制，而细菌需要利用该酶 产生环形DNA。它们是广谱抗菌药，其实例包括氟哌酸，卷须 霉素，依诺沙星，萘啶酸和替马沙星。萘啶酸是一种杀菌剂，可 以与DNA促旋酶(拓扑异构酶)结合并抑制促旋酶的活性，该 酶对DNA的复制是必需的，它使得超螺旋松弛或重新形成。萘 啶酸的主要用途是治疗下泌尿道感染(UTI)，因为它可以有效抵 抗引起UTI的几种常见革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌，产气肠杆 菌，克雷伯氏肺炎杆菌和变形杆菌。增效磺胺甲基异恶唑是一种 磺胺甲基异恶唑和甲氧苄氨嘧啶的组合物，可以阻断细菌合成制 造DNA核苷酸所需的叶酸。利福平是一种利福霉素的衍生物， 可以抵抗革兰氏阳性菌(包括结核杆菌和奈瑟氏脑膜炎菌引起的 脑膜炎)和一些革兰氏阴性菌。利福平与聚合酶的亚基结合， 阻断了激活聚合酶所必需的第一个核苷酸的掺加，因而阻断了 mRNA的合成。
另一类抗细菌制剂是作为细菌酶的竞争性抑制剂的化合物。 竞争性抑制剂通常与细菌生长因子的结构类似，与其竞争结合但 是在细胞中并不具有代谢功能。这些化合物包括磺胺和磺胺的化 学修饰形式，它们具有更高效的和更广泛的抗细菌活性。磺胺(例 如磺胺异恶唑和甲氧苄氨嘧啶)可用于治疗肺炎链球菌，β溶血 链球菌和大肠杆菌，已被用于治疗由大肠杆菌引起的简单UTI， 以及治疗脑膜炎球菌性脑膜炎。
抗病毒制剂是可以防止细胞被病毒感染或者防止病毒在细 胞内复制的化合物。抗病毒药物比抗细菌药物少的多，这是因为 病毒复制的过程与宿主细胞的DNA复制非常相似，非特异性的 抗病毒制剂通常对宿主都会具有毒性。病毒感染过程中有几个阶 段可以被抗病毒制剂阻断或抑制。这些阶段包括，病毒与宿主细 胞(免疫球蛋白或者连接肽)的连接，病毒脱壳(例如三环癸胺)， 病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)，病毒RNA或DNA的 复制(例如核苷类似物)，新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制 剂)，以及病毒的出芽和释放。
另一类抗病毒制剂是核苷类似物。核苷类似物是与核苷类似 的合成化合物，但其具有不完整的或是异常的脱氧核糖或核糖基 团。一旦细胞中存在核苷类似物，它们就会被磷酸化，产生三磷 酸盐形式，与正常的核苷酸竞争掺入病毒DNA或RNA。一旦核 苷类似物的三磷酸盐形式掺入正在生长的核酸链中，它就会不可 逆地与病毒聚合酶结合，从而使链终止。核苷类似物包括但不限 于，无环鸟苷(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)， 丙氧鸟苷(用于治疗巨细胞病毒)，碘苷，三氮唑核苷(用于治 疗呼吸融合病毒)，双脱氧次黄嘌呤核苷，双脱氧胞嘧啶核苷， 和叠氮胸苷(叠氮胸腺嘧啶核苷)。
另一类抗病毒制剂包括细胞因子如干扰素。干扰素是由病毒 感染的细胞和免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素可与被感染细胞 附近细胞中的特定受体结合，使该细胞发生变化以保护它不被病 毒感染。α和β干扰素也可以诱导I类和II类MHC分子在被感染 细胞的表面表达，导致宿主免疫细胞识别的抗原呈递增加。可获 得α和β干扰素的重组形式，它们已用于治疗慢性乙型肝炎和丙型 肝炎感染的治疗。有效量的抗病毒治疗的干扰素具有如发烧，不 适以及体重减轻的副作用。
免疫球蛋白治疗用于防止病毒感染。病毒感染的免疫球蛋白 治疗与细菌感染不同，因为它并不是抗原特异性的，免疫球蛋白 治疗的作用方式是与细胞外病毒颗粒结合，防止它们与细胞结合 并进入病毒要感染的细胞。该疗法在宿主体内存在抗体的这段时 间内可防止病毒感染。通常有两种类型的免疫球蛋白治疗，正常 的免疫球蛋白治疗和超免疫球蛋白治疗。正常的免疫球蛋白治疗 使用由正常供血者的血清制备的抗体产物并汇集。汇集的产物含 有多种人病毒的低滴度抗体，例如甲型肝炎，细小病毒，肠道病 毒(特别是新生儿的)。超免疫球蛋白治疗使用由对特定病毒具 有高滴度抗体的人的血清制备的抗体。这些抗体随后被用于抵抗 特定的病毒。超免疫球蛋白的例子包括带状疱疹免疫球蛋白(用 于预防免疫缺失的儿童和新生儿患水痘)，人狂犬病免疫球蛋白 (用于被狂犬病动物咬了的患者的事后预防)，乙型肝炎免疫球 蛋白(用于预防乙型肝炎病毒，特别是暴露于该病毒中的患者)， 以及RSV免疫球蛋白(用于治疗呼吸融合病毒感染)。
抗真菌制剂可用于治疗和预防感染性真菌。抗真菌制剂有时 可根据其作用机制分类。一些抗真菌制剂可作为细胞壁抑制剂抑 制葡萄糖合酶。这些制剂包括但不限于，basiungin/ECB。其它抗 真菌制剂可破坏膜的完整性。这些制剂包括但不限于咪唑，例如 克霉唑，sertaconzole，氟康唑，伊曲康唑，酮康唑，咪康唑，和 voriconacole，以及FK 463，两性霉素B，BAY 38-9502，MK 991， 帕地霉素，UK 292，布替萘芬，和特比萘芬。其它抗真菌制剂的 作用方式为阻断几丁质(例如几丁质酶)或免疫抑制(501乳剂)。
驱虫剂是可以直接杀死寄生虫的制剂。这些化合物是本领域 已知的，通常是商业可获得的。可用于人体给药的驱虫剂包括但 不限于丙硫咪唑，两性霉素B，苄硝唑，硫氯酚，氯喹盐酸，氯 喹磷酸盐，氯林霉素，去氢依米丁，乙胺嗪，二氯散糠酸盐，依 氟鸟氨酸，furazolidaone，糖皮质激素，卤泛曲林，双碘喹啉， 伊维菌素，甲苯咪唑，甲氟喹，甲葡胺锑酸盐，米拉索普，美曲 膦酯，甲硝哒唑，氯硝柳胺，硝呋莫司，奥沙尼喹，巴龙霉素， 戊烷脒，羟乙基磺酸盐，哌嗪，吡喹酮，磷酸伯氨喹啉，氯胍， 噻嘧啶双羟萘酸盐，磺胺乙嘧啶，周效磺胺乙嘧啶，盐酸奎吖因， 硫酸奎宁，葡糖酸奎尼定，螺旋霉素，锑酰葡萄糖酸钠(葡萄糖 酸锑钠)，苏拉明，四环素，强力霉素，噻苯咪唑，硝砜咪唑， 甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑，和锥虫胂胺。
本发明的组合物和方法还可以用于治疗变态反应和哮喘。 “变态反应”指对某种物质(变态反应原)具有超敏感性。变态 反应症状包括但不限于湿疹，过敏性鼻炎或伤风，花粉热，过敏 性结膜炎，支气管哮喘，风疹(荨麻疹)和食物过敏，其它过敏 性症状包括过敏性皮炎；过敏症；药物过敏；和血管性水肿。过 敏性疾病包括但不限于鼻炎(花粉热)，哮喘，荨麻疹，和过敏 性皮炎。
变态反应是一种与来自特定类的抗变态反应原的免疫球蛋 白，IgE的抗体产生相关的疾病。IgE介导的对普通的空气过敏 原的反应也是易患哮喘的一个指示因子。如果变态反应原遇到了 特异的与嗜碱细胞(在血液中循环)或肥大细胞(分散在固体组 织中)表面的IgE Fc受体(Fc R)相连的IgE，细胞便被激活， 产生并释放如组胺，血清素，和脂质调节剂的调节剂。
具有变态反应的患者是目前正对或者曾经对变态反应原具 有变态反应的患者。
具有患变态反应或哮喘危险的患者是过去曾有过变态反应 或哮喘，但是目前没有这种疾病的患者，还指由于其遗传因素或 是环境因素被认为具有患哮喘或变态反应危险的患者。具有患变 态反应或哮喘危险的患者还包括那些具有暴露于变态反应原之 中的危险或者具有患上哮喘危险的患者，即曾经患哮喘症或者易 患哮喘症的患者。例如具有患病危险的患者可以是计划到某个存 在特定类型的变态反应原或引发哮喘物质的地方旅行的患者，或 者也可以是任何居住在具有变态反应原的地区的患者。如果患者 对特定的抗原具有变态反应，那么该患者可能是暴露于该抗原之 中，即在花粉季节，患者具有暴露于该抗原的危险。
能引起变态反应的分子的一般名称是变态反应原。这里所说 的“变态反应原”是一种能激发产生IgE的免疫反应的分子。变 态反应原是一种在易患病患者体内能诱导变态反应或哮喘反应 的物质。因此，在本发明中，术语变态反应原是指特定类型的能 引发由IgE抗体介导的变态反应的抗原。本发明的方法和制备方 法涉及多种变态反应原和变态反应原片段或可起变态反应原作 用的半抗原。变态反应原非常多，包括花粉，昆虫毒素，动物鳞 屑，灰尘，真菌孢子，以及药物(例如青霉素)。
存在许多种类的变态反应原。当IgE类型的组织敏感性的免 疫球蛋白与外源变态反应原发生反应的时候，即发生变态反应。 IgE抗体与肥大细胞和/或嗜碱细胞结合，这些细胞当受到可桥接 抗体分子末端的变态反应原刺激的时候释放化学调节剂(血管活 性胺)，发生变态反应。组胺，血小板活化因子，花生四烯酸代 谢物，和血清素是公知的人的变态反应调节剂。
组胺和其它血管活性胺通常储存于肥大细胞和嗜碱细胞中。 肥大细胞分布于动物组织中，嗜碱细胞随血管系统循环流动。这 些细胞在细胞内制造和储存组胺，除非专门的IgE结合序列或事 件发生，引发组胺的释放。
变态反应的症状随IgE与抗原在机体上反应的部位不同而不 同。如果反应发生在呼吸道上皮细胞，症状就是打喷嚏，咳嗽和 哮喘反应。如果反应发生在消化道，如食物过敏，通常就会产生 腹部疼痛和腹泻。全身反应，例如被蜂蛰伤以后，可能是很严重 的，经常会危及生命。
迟发型的超敏反应，也称为IV型变态反应，是一种从抗原 侵入变态反应患者到出现炎性或免疫反应至少有12个小时的延 迟的一种变态反应。在过敏症状中，T淋巴细胞(激活的T淋巴 细胞)与抗原反应，引发T淋巴细胞释放淋巴因子(巨噬细胞迁 移抑制因子(MIF)，巨噬细胞激活因子(MAF)，有丝分裂因子 (MF)，皮肤反应因子(SRF)，趋化因子，加速新血管形成因子 等等)，它们可以作为炎症介质，这些淋巴因子的生物活性，与 局部出现的淋巴细胞和其它炎性免疫细胞的直接或间接作用一 起，引发了IV型变态反应。迟发的变态反应包括结核菌素型反 应，同种移植物注射反应，细胞依赖型的保护反应，接触性皮炎 超敏反应等，它们大多都可以被甾族试剂强烈抑制。因此，甾族 试剂可有效抵抗由迟发型变态反应引起的疾病。有效量甾族试剂 的长期使用可以引起严重的副作用，如甾族化合物依赖。本发明 的方法解决了其中部分问题，可使给药的剂量更低更少。
速发型超敏反应(或者说过敏反应)是一种迅速发生的变态 反应，即在患者暴露于致病的变态反应原的数秒或数分钟内发 生，并且它是由B淋巴细胞产生的IgE抗体介导的。在非变应性 的患者中，没有具有临床相关性的IgE抗体；但是，在患有变态 反应性疾病的患者中，IgE抗体通过激活皮肤中，淋巴器官中， 眼、鼻和口的膜中，以及呼吸道和肠道中所富含的肥大细胞来介 导速发型超敏反应。
肥大细胞具有IgE的表面受体，IgE抗体在患有变态反应的 患者中与它们结合。正如上面所述的，当结合的IgE接触到合适 的变态反应原的时候，肥大细胞就会脱粒并向周围组织中释放各 种被称为生物活性调节剂的物质，例如组胺。正是这些物质的生 物活性造成了速发型超敏反应的临床症状，也就是，呼吸道或肠 道平滑肌的收缩，小血管的扩张以及它们对水和质膜的渗透性的 增加，皮肤上粘稠粘液的分泌，发红，肿胀，以及刺激神经末梢 导致搔痒或疼痛。
这里所说的“哮喘”是指呼吸系统的失调，体现为炎症，呼 吸道狭窄，以及呼吸道对吸入物的反应性增强。哮喘经常但不是 完全与遗传过敏性或变态反应性症状有关。哮喘的症状包括由于 呼吸障碍引起的周期性喘息，无法呼吸以及胸口收紧，以及咳嗽。 与哮喘有关的呼吸道炎症可以通过许多生理变化观察到，例如呼 吸道上皮细胞剥落，基底膜下的胶原质沉积，浮肿，肥大细胞激 活，炎性细胞渗透，包括嗜中性粒细胞，inosineophils，和淋巴 细胞。呼吸道炎症使得哮喘患者经常发生呼吸道超反应性，呼吸 受限，呼吸症状，以及慢性疾病。呼吸受限包括急性支气管狭窄， 呼吸道浮肿，粘液栓的形成，以及呼吸道重建，引起支气管阻塞 的特征。在某些哮喘的情况中，可能发生基底膜纤维化，这会导 致肺功能的永久异常。
过去几年的研究表明哮喘可能是由于炎性细胞，调节剂，以 及呼吸道中存在的其它细胞和组织之间的复杂的相互作用导致 的。肥大细胞，inosineophils，上皮细胞，巨噬细胞，和活化的T 细胞在与哮喘相关的炎性过程中都起着重要作用。Djukanovic R et al.(1990)Am Rev Respir Dis 142：434-457.这些细胞可以通过 分泌可以直接或间接地作用于本地组织的已存在的和新合成的 调节剂来影响呼吸道功能。还发现T淋巴细胞的亚群(Th2)通 过释放选择性细胞因子和形成慢性疾病在呼吸道的过敏性炎性 反应中起着重要作用。Robinson DS et al.(1992)NEngl JMed 326： 298-304.
哮喘是一种出现在发展的不同阶段的复杂的失调，可以依据 症状的程度分为急性，亚急性或慢性。急性炎症反应与早期的呼 吸道细胞增加有关。亚急性炎症反应包括细胞的增加以及已有细 胞的激活，导致炎症更加持久。慢性炎症反应表现出永久的细胞 损伤，以及正在进行的细胞修复过程，这会导致呼吸道的永久异 常。
“患有哮喘的患者”是指患有呼吸系统失调的患者，所述呼 吸系统失调表现为炎症，呼吸道狭窄，呼吸道对吸入物的反应性 增加。哮喘经常，但不完全与遗传过敏性或变态反应性症状有关。 这里所说的“起始物”是指一种可引起哮喘的组合物或者环境条 件。起始物包括但不限于变态反应原，低温，锻炼，病毒感染， SO2。
本发明的组合物和方法可以单独使用或者和其它可用于治 疗哮喘的试剂和方法一同使用。这里所说的“哮喘/变态反应药物” 是指可以缓解其症状，预防其发生，或抑制哮喘或变态反应的相 关组合物。用于治疗哮喘和变态反应的各种不同药物在the Guidelines For The Diagnosis and Management of Asthma，Expert Panel Report 2，NIH Publication No.97/4051，July 19，1997中有描 述，在此引入其全文作为参考。这些药物的摘要在下述的NIH出 版物中有描述。在大部分实施方案中，哮喘/变态反应药物在某种 程度上可用于同时治疗哮喘和变态反应。
治疗哮喘的药物通常分为两类，迅速缓解的药物和长期控制 的药物。哮喘患者每天服用长期控制药物以获得和维持对长期哮 喘的控制。长期控制药物包括抗炎制剂，例如皮质甾类，色甘酸 钠和奈多罗米；长效气管扩张剂，例如长效β2-激动剂和甲基黄嘌 呤；和白细胞三烯调节剂。迅速缓解的药物包括短效β2激动剂， 抗胆碱能药物，和系统性皮质甾类。这些药物中的每一种都具有 许多副作用，没有单独使用或者组合使用的药物可以预防或者完 全治疗哮喘。
哮喘药物包括但不限于PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2激 动剂，K+通道扩张剂，VLA-4拮抗剂，neurokin拮抗剂，凝血恶 烷A2(TXA2)合成抑制剂，黄嘌呤，花生四烯酸拮抗剂，5脂 肪氧合酶抑制剂，TXA2受体拮抗剂，TXA2拮抗剂，5-脂氧活 化蛋白抑制剂，和蛋白酶抑制剂。
支气管扩张剂/β2激动剂是一类可引起支气管扩张或者平滑 肌舒张的化合物。支气管扩张剂/β2激动剂包括，但不限于沙美 特罗，沙丁胺醇，舒喘宁，特布他林，D2522/福莫特罗，芬忒醇， 双甲苯喘定，pirbuerol甲基黄嘌呤和间羟异丙肾上腺素。长效β2激动剂和支气管扩张剂除了可用于抗炎治疗之外还可用于长效 预防其症状。长效2激动剂包括但不限于沙美特罗和舒喘宁。这 些化合物通常和皮质甾类组合使用，通常不用于不进行炎症治疗 的场合。它们具有副作用如心动过速，骨骼肌颤抖，低血钾，以 及用药过多引起的QTc间隔增长。
甲基黄嘌呤，包括例如茶碱，已被用于对症状进行长效控制 和预防。这些化合物引起由磷酸二酯酶抑制和腺苷的拮抗作用造 成的支气管扩张。这些类化合物有一个特殊的问题就是剂量相关 的急性毒性。因此，必须监控常规血清浓度以说明毒性和由于代 谢清除的个体差异所造成的狭窄的治疗范围。副作用包括心动过 速，快速性心律失常，恶心和呕吐，中枢神经系统刺激，头痛， 抽搐，呕血，高血糖和低血钾。短效β2激动剂包括但不限于舒喘 宁，比托特罗，吡布特罗，和特布他林。短效β2激动剂给药的副 作用包括心动过速，骨骼肌颤抖，低血钾，乳酸增加，头痛，以 及高血糖。
治疗或预防变态反应的传统方法包括使用抗组胺或者进行 脱敏治疗。抗组胺和其它药物可以阻断变态反应的化学调节剂的 作用，这有助于调节变态反应症状的严重程度，但是不能阻止变 态反应的发生，对随后发生的变态反应也没有作用。脱敏治疗是 通过给予小剂量的变态反应原，通常是通过皮下注射，以诱导对 变态反应原的IgG型反应。IgG抗体的存在有助于中和由IgE抗 体的诱导导致的调节剂的产生。开始的时候，患者用非常低剂量 的变态反应原治疗以避免引起严重的反应，然后剂量缓慢增加。 这种类型的治疗非常危险，因为实际上患者被给予的化合物可以 引起变态反应并导致严重的变态反应。
变态反应药物包括但不限于抗组胺，类固醇，以及前列腺素 诱导剂。抗组胺是可抵抗肥大细胞或嗜碱细胞释放的组胺的化合 物。这些化合物是本领域熟知的，通常用于治疗变态反应。抗组 胺包括但不限于阿司咪唑，氮斯汀，betatastine，氯苯丁嗪，西 替利嗪，西替利嗪类似物，CS 560，地氯雷他定，依巴斯汀，依 匹斯汀，非索非那定，HSR 609，左卡巴斯汀，氯雷他定，咪唑 斯汀，去甲阿司咪唑，特非那定，以及曲尼司特。
前列腺素诱导剂是可以诱导前列腺素活性的化合物。前列腺 素可以调节平滑肌的松弛。前列腺素诱导剂包括但不限于 S-5751。
哮喘/变态反应药物还包括类固醇和免疫调节剂。类固醇包括 但不限于倍氯米松，氟替卡松，醋酸去炎松，布地缩松，皮质类 固醇和布地缩松。
皮质类固醇包括但不限于倍氯米松二丙酸盐，布地缩松，氟 尼缩松，氟替卡松丙酸酯，以及丙酮醋酸去炎松。虽然地塞米松 是一种具有抗炎作用的皮质类固醇，但是它一般不用于哮喘/变态 反应的吸入治疗，因为它可以被高效吸收，并且其治疗有效量会 引起长期的抑制副作用。但是，根据本发明，地塞米松可以用于 治疗哮喘/变态反应，因为当与本发明的核酸一同给药的时候它可 以以低剂量给药，从而减小了副作用。皮质类固醇的副作用包括 咳嗽，发音困难，霉菌性口炎(念珠菌病)，当使用高剂量时其 副作用包括全身性作用，例如肾上腺抑制，骨质疏松症，生长抑 制，皮肤变薄并且容易擦伤。Barnes & Peterson(1993)Am Rev Respir Dis 148：S1-S26；and Kamada AK et al.s(1996)Am J Respir Crit Care Med 153：1739-48.
系统性皮质类固醇包括但不限于甲基去氢氢化可的松，脱氢 皮甾醇和脱氢可的松。皮质类固醇与葡萄糖代谢，食欲增加，体 液滞留，重量增加，情绪变化，胃溃疡，以及骨头无菌性坏死中 的可逆的异常现象有关。这些化合物可用于对控制不当的持久性 哮喘进行炎性反应的短期(3-10天)预防。它们还可以长效预防 严重的持久性哮喘的症状，以抑制和控制并逆转炎症。一些与长 期使用有关的副作用包括肾上腺轴抑制，生长抑制，皮肤变薄， 高血压，糖尿病，库欣综合症，白内障，肌无力，以及较少出现 的损害免疫功能。建议使用这些化合物的最低有效量(guidelines for the diagnosis and management of asthma；expert panel report to； NIH Publication No.97-4051；July 1997)。
免疫调节剂包括但不限于下组：抗炎性制剂，白细胞三烯拮 抗剂，IL-4突变蛋白质，可溶性IL-4受体，免疫抑制剂(例如 tolerizing肽疫苗)，抗IL-4抗体，IL-4拮抗剂，抗IL-5抗体，可 溶性IL-13受体-Fc融合蛋白，抗IL-9抗体，CCR3拮抗剂，CCR5 拮抗剂，VLA-4抑制剂，以及IgE的负调节剂。
白细胞三烯调节剂通常用于长期控制和预防轻微的持久性 哮喘。白细胞三烯调节剂可以作为白细胞三烯受体拮抗剂，选择 性地竞争LTD-4和LTE-4受体。这些化合物包括但不限于扎鲁司 特和齐留通。齐留通可作为5-脂肪氧合酶抑制剂。这些药物与肝 酶的升高以及一些可逆的肝炎和胆红素血症有关。白细胞三烯是 肥大细胞，inosineophils，嗜碱细胞释放的生物化学调节剂，可 在哮喘患者的呼吸道中引起呼吸道平滑肌收缩，增加血管渗透 性，粘液分泌和激活炎性细胞。
其它免疫调剂机包括具有免疫调剂性质的神经肽。功能性研 究表明物质P，例如，可以通过特异性受体介导的机制影响淋巴 细胞的功能。物质P也可以通过刺激来自粘膜肥大细胞的花生四 烯酸调节剂的产生调节不同的速发型超敏反应。McGillies J et al. (1987)Fed Proc 46：196-9(1987).物质P是一种在1931年首次识 别的神经肽。Von Euler and Gaddum.J Physiol(London)72：74-87 (1931).它的氨基酸序列在Chang et al.in 1971中报道。Chang MM et al.(1971)Nature New Biol 232：86-87.物质P的片段的免 疫调节活性研究参见Siemion IZ et al.(1990)Molec Immunol 27： 887-890(1990).
另一类化合物是IgE的负调节剂。这些化合物包括能够结合 IgE受体的肽或其它分子，因此能够防止抗原特异性的IgE的结 合。另一类IgE负调节剂是一种直接抵抗人IgE分子的.IgE受体 结合区域的单克隆抗体。因此，一种IgE的负调节剂是抗IgE抗 体或抗体片段。Genetech正在开发抗IgE。本领域技术人员可以 制备具有相同功能的结合蛋白的具有功能活性的抗体片段。其它 类型的IgE负调节剂是能够阻断IgE抗体与Fc受体在细胞表面 结合，并且能取代IgE已结合部位的IgE。
IgE负调节剂的一个问题就是许多分子与受体之间没有天然 IgE分子与其受体之间那样强的结合能力。具有这种能力的分子 会与受体不可逆地结合。然而，这样的物质由于其可共价结合并 阻断体内其它结构类似的分子，因而相对较具有毒性。本文中所 关心的是IgE受体的链属于一个更大的基因家族，其中含有几 种不同的IgG Fc受体。这些受体对于机体对例如细菌感染的防御 是绝对必需的。被激活并共价结合的分子通常相对比较不稳定， 因此它们可能必须每天给药数次，达到相对较高的浓度才能完全 阻断肥大细胞和嗜碱性白细胞中IgE受体的不断补充。
色甘酸钠和奈多罗米用作预防运动引起的初级哮喘症状或 变态反应原引起的变态反应症状的长效控制药物。这些化合物能 通过干扰氯化物通道功能从而阻断对变态反应原的早期和晚期 的反应。它们还可以稳定肥大细胞膜并抑制inosineophils和上皮 细胞中调节剂的活化和释放。要达到最大药效通常需要进行四到 六周的给药。
抗胆碱功能药通常用于减轻急性支气管痉挛。这些化合物能 通过竞争性抑制毒蕈碱胆碱功能的受体发挥作用。抗胆碱功能药 包括但不限于异丙托溴铵。这些化合物只能逆转完全由胆碱介导 的支气管痉挛，而不能改变任何对抗原的反应。其副作用包括口 腔和呼吸性分泌干燥，某些个体的喘息增加，以及如果溅入眼中 引起的视力模糊。
除了标准的哮喘/变态反应药物，其它治疗哮喘/变态反应的 方法也可以单独使用或与已有的药物一同使用。一种优选的，但 通常是不可能的减轻变态反应的方法是避免变态反应原或引发 物。另一种目前用于治疗变态反应性疾病的方法是注射递增剂量 的变态反应原，以诱导对变态反应原的耐受性并防止进一步的变 态反应发生。
变态反应原注射治疗(变态反应原免疫治疗)已知可减轻过 敏性鼻炎。这种治疗理论上包括产生一种完全不同形式的抗体， 即一种保护性抗体，也被称为“抑制性抗体”。Cooke RA et al. (1935)Serologic Evidence of Immunity with Coexisting Sensitization in a Type of Human Allergy，Exp Med 62：733.其它 治疗变态反应的方法包括对变态反应原进行化学修饰，使得它在 患者中引起免疫反应的能力不变，但是引起变态反应的能力显著 改变。但是这些方法需要数年才能其作用，并且具有如过敏性休 克这样的副作用。
本发明的组合物和方法可用于调节免疫反应。这种调节免疫 反应的能力使得可以预防和/或治疗能通过免疫系统调节所影响 的特定的失调。
失调后治疗的目的是减小，改善或者完全消除失调，和/或与 其相关的症状，或者防止其变得更糟。失调前治疗(即预防性治 疗)的目的是减小患失调的危险性。这里所说的术语“预防”是 指对具有患失调危险的患者的预防性治疗(降低患者患失调的可 能性)，并抑制已经存在的失调的进一步发展。
患者的治疗可能需要不同的剂量，这取决于化合物的活性， 给药的方式，免疫的目的(即预防还是治疗)，失调的种类和严 重性，患者的年龄和体重。给定剂量的给药可以是一次性全部给 药或者也可以是小剂量的几次给药。以数周或数月的特定间隔多 次给药可用于提高抗原特异性的免疫反应。
结合本文给出的教导，通过选择不同的活性化合物，以及加 权因子，例如效能，相对生物利用率，患者体重，不良副作用的 严重程度，以及优选的给药方式，可获得有效的预防性或治疗性 治疗方案，而不会引起严重的毒性，该治疗方案完全可有效地治 疗特定的患者。任何特定使用的有效量都随下述因素的不同而不 同：所治疗的疾病或症状，所服用的特定的治疗剂(例如对于免 疫刺激核酸来说就是核酸的类型，即CpG核酸，未甲基化CpG 基序的数目，或者它们在核酸中的位置，核苷酸骨架修饰的程度 等等)，患者的个头，或者疾病或症状的严重程度。本领域普通 技术人员可以根据经验确定特定核酸和/或其它治疗剂的有效量 而不需要进行过度的试验。
本文所描述的患者使用的化合物剂量典型地是从0.1μg到 10,000mg，更典型地是从大约1μg/天到8000mg，最典型地是从 大约10μg至100μg。根据患者体重确定的典型剂量是从大约 0.1μg至20mg/kg/天，更典型地是从大约1至10mg/kg/天，最典 型地是从大约1至5mg/kg/天。
含有核酸和其它化合物的药物组合物可以通过任何适当的 给药方式给药。有多种不同的给药方式，给药的特定方式的选择 取决于所选的特定药物，所治疗的特定疾病，以及有效治疗所需 的剂量。本发明的方法，一般而言，可以以医学可接受的任何给 药方式实施，也就是可产生有效水平的免疫反应，而不引起临床 上不可接受的副作用的任何方式。优选的给药方式如下所述。为 治疗目的的使用，有效量的核酸和/或其它治疗剂可以以任何能将 该治疗剂递送到所希望部位，例如粘膜，全身的方式给药。
本发明的药物组合物的给药可以用技术人员所知道的任何 方式实施。给药方式包括但不限于口服，肠胃外，静脉内，肌肉 内，鼻内，舌下，气管内，吸入，皮下，眼内，阴道内，和直肠 内。用于治疗或预防哮喘或变态反应时，这些化合物优选是吸入， 吞咽或通过全身方法给药。全身方法包括口服和肠胃外。在某些 实施方案中吸入式药物是优选的，因为它可以直接递送到肺，肺 在哮喘患者中是主要的炎症部位。可以使用几种类型的装置进行 吸入式给药。这些类型的装置包括计量剂量的吸入器(MDI)， 呼吸启动的MDI，干粉吸入器(DPI)，间隔/贮藏室与MDI和喷 雾器的组合。
本发明的治疗剂可以在载体的帮助下被递送到特定的组织， 细胞类型或是免疫系统，或者全部。从广义上来讲，“载体”是 能够促进组合物向靶细胞传递的任何媒介物。载体一般是将免疫 刺激核酸，抗体，抗原，和/或失调特异性药物运输至靶细胞，并 且其降解程度比能导致载体不存在的降解程度相对较低。
通常，可用于本发明的载体可分为两类：生物载体和化学/ 物理载体。生物载体和化学/物理载体都可用于本发明中的递送和 /或治疗剂的摄取。
大部分生物载体都可用于核酸的递送，用于递送免疫刺激核 酸或者含有免疫刺激核酸的治疗剂也是合适的。
除了所述的生物载体，化学/物理载体也可用于递送含有免疫 刺激核酸，抗体，抗原和失调特异性药物的治疗剂。这里所说的 “化学/物理载体”指天然的或是合成的分子，而不是那些来源于 细菌或病毒的分子，并且能够递送核酸和/或其它药物。
本发明的优选的化学/物理载体是胶体分散系。胶体分散系包 括基于脂类的系统，包括水包油的乳剂，胶束，混合胶束，和脂 质体。本发明的优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人造膜载体， 可用于在体内或体外作为递送载体。它表现为大的单层囊泡 (LUV)，尺寸为0.2-4.0m，能够包入大的大分子。RNA，DNA 和完整的病毒颗粒可以包入水相内部，以生物活性形式递送到细 胞中。Fraley et al.(1981)Trends Biochem Sci 6：77.脂质体可以通 过与特定的配体，例如单克隆抗体，糖，糖脂类，或蛋白偶联， 从而靶定特定的组织。可用于将脂质体靶定到免疫细胞的配体包 括但不限于可与免疫细胞特异性受体相互作用的完整分子或其 片段，以及可与免疫细胞的细胞表面标记相互作用的分子，例如 抗体。
这种抗体可以很容易地用本领域技术人员公知的结合检测 加以识别。在其它一些实施方案中，脂质体可以通过与一种免疫 治疗抗体偶联从而靶定癌细胞。此外，载体还可以与核靶定肽偶 联，直接将载体送至宿主细胞的核中。
转染所用的脂类配方是商业可获得的，可以自QIAGEN得 到，例如EFFECTENETM(一种带有特殊的DNA缩合增强子的 非脂质体脂类)和SUPERFECTTM(一种新的acting dendrimeric 技术)。
脂质体是商业可获得的，可从Gibco BRL获得，例如 LIPOFECTINTM和LIPOFECTACETM，是由阳离子酸例如 N-[1-(2，3二油酰基氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA) 和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)。制备脂质体的方法是本领 域所熟知的，在许多出版物中都有描述。在Gregoriadis G(1985) Trends Biotechs1013：235-241中对脂质体也有综述。
在一个实施例中，载体是适合于对哺乳动物受体进行植入或 给药的生物相容的微粒或者植入物。典型的可用于本发明的生物 溶蚀植入物在PCT国际申请PCT/US/03307(公开号 WO 95/24929，发明名称为“Polymeric Gene Delivery System”中 进行了描述。PCT/US/0307描述了一种含有由适当的启动子控制 的外源基因的生物相容的，优选是生物可降解的聚合体基质。聚 合体基质可用于在患者中持续释放治疗剂。
聚合体基质优选是微粒的形式，例如微球(其中核酸和/或其 它治疗剂分散在固体聚合体基质中)或者微胶囊(其中核酸和/ 或其它治疗剂储藏在聚合体外壳的内核中)。用于包含治疗剂的 其它形式的聚合体基质包括薄膜，涂层，凝胶，植入物，和支架。 聚合体基质装置的尺寸和组成应使得基质在其所引入的组织中 方便地释放。聚合体基质的尺寸是根据要使用的递送方法进一步 选择的，典型地是注射到组织中，或者通过喷雾剂将悬浮颗粒送 入鼻腔和/或肺部。优选地，当使用喷雾剂的时候，聚合体基质和 核酸和/或其它治疗剂可包含在表面活性剂载体中。可以选择聚合 体基质的组分使之具有良好的降解速度，并且由具有生物附着性 的物质组成，进一步增加了基质对收到伤害的鼻腔和/或肺表面给 药时的转移效率。应选择基质的组成使其不被降解，而是在较长 的一段时间内通过扩散释放。在某些优选的实施方案中，核酸通 过植入物的方式给患者施用，而其它治疗剂则即时给药。适合于 递送，例如口腔递送或粘膜递送的生物相容的微球在下述文献中 公开：Chickering et al.(1996)Biotech Bioeng 52：96-101和 Mathiowitz E et al.(1997)Nature 386：410-414和PCT专利申请 WO 97/03702。
非生物可降解的和生物可降解的聚合体基质都可以用于给 患者递送核酸和/或其它治疗剂。生物可降解的基质是优选的。这 样的聚合物可以是天然的或是合成的聚合物。聚合物的选择取决 于所希望的释放时间，通常是数小时至一年或更长。典型地，持 续释放可以在几个小时之间，三至十二个月是最希望的，特别是 对核酸试剂来说。聚合物可选择地是水凝胶的形式，水凝胶可以 吸收达其自身90％重量的水，而且，进一步可选择地与多价离子 或其它化合物交联。
所特别感兴趣的生物附着性聚合物包括生物溶蚀水凝胶，在 H.S.Sawhney，C.P.Pathak and J.A.Hubell in Mac omolecules， (1993)26：581-587中有描述，在此引入其全文作为参考。这些 聚合物包括聚透明质酸，酪蛋白，明胶，明胶蛋白，聚酐，聚丙 烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯 酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚 (甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸 月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯 酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)以及聚(丙烯酸十八酯)。
如果治疗剂是核酸，也可以使用压缩剂。压缩剂可以单独使 用，或者与生物或化学/物理载体一起使用。这里所说的“压缩剂” 是指一种试剂，例如组蛋白，可以中和核酸上的负电荷，因而可 以将核酸压紧成为微粒剂。核酸的压缩使靶细胞更容易吸收所述 核酸。压缩剂可以单独使用，即以一种更有效被细胞吸收的方式 递送核酸，或者更优选地，与一种或多种上述载体一起使用。
其它典型的可促进核酸吸收的组分包括磷酸钙和其它胞内 运输的化学调节剂，显微注射组分，电穿孔和同源重组组分(例 如将核酸整合到靶细胞染色体的预先选定的部位)。
化合物可以单独给药(例如在盐水或缓冲液中)，或者可以 使用任何本领域已知的递送载体。例如已描述了下述载体：螺旋 体(Gould-Fogerite et al.，1994，1996)；Emulsomes(Vancott et al.， 1998，Lowell et al.，1997)；ISCOMs(Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998，Morein et al.，1999)；脂质体(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)； 活细菌载体(例如，沙门氏菌，大肠杆菌，芽孢杆菌calmatte- guerin，志贺氏杆菌，乳酸菌)(Hone et al.，1996，Pouwels et al.， 1998，Chatfield et al.，1993，Stover et al.，1991，Nugent et al.， 1998)；活病毒载体(例如牛痘，腺病毒，单纯疱疹)(Gallichan et al.，1993，1995，Moss et al.，1996，Nugent et al.，1998，Flexner et al.，1988，Morrow et al.，1999)；微球(Gupta et al.，1998，Jones et al.，1996，Maloy et al.，1994，Moore et al.，1995，O′Hagan et al.， 1994，Eldridge et al.，1989)；核酸疫苗(Fynan et al.，1993，Kuklin et al.，1997，Sasaki et al.，1998，Okada et al.，1997，Ishii et al.， 1997)；聚合物(例如羧甲基纤维素，壳聚糖)(Hamajima et al.， 1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；聚合物环(Wyatt et al.，1998)； 蛋白体(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；氟 化钠(Hashi et al.，1998)；转基因植物(Tacket et al.，1998，Mason et al.，1998，Haq et al.，1995)；病毒颗粒(Gluck et al.，1992， Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)；以及类病毒颗粒(Jiang et al.，1999，Leibl et al.，1998)。
本发明的配方是以药学可接收的溶液给药，所述药学可接收 的溶液通常包括药学可接收浓度的盐，缓冲试剂，防腐剂，相容 载体，佐剂，以及可任选的其它治疗成分。
术语药学可接收的载体是指一种或多种适合于给人或其它 脊椎动物给药的相容的固体或液体填充物，稀释剂或封装物质。 术语载体是指有机或无机成分，其可以是天然的或是合成的，并 且活性成分与之结合以便于使用。药物组合物的组分也可以与本 发明的化合物混合，彼此之间没有可明显削弱药效的相互作用。
对于口服给药，化合物(即核酸，抗原，抗体，和其它治疗 剂)可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接收的载体结 合制备。这样的载体使得本发明的化合物可以制成片剂，丸剂， 糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆剂，淤浆，悬浮液等，给所治 疗患者口服使用。口服药物的制备可以通过将固体赋形剂任选地 研磨成混合物，如果需要，在加入合适的辅助剂之后处理颗粒混 合物得到片剂或糖衣丸的核。合适的赋形剂是填充物如糖，包括 乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉，小 麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素， 羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。如果需要，还可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯 烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐例如褐藻酸钠。可选择地，口服制 剂也可以用盐水或缓冲液配制以中和其内部的酸性环境，或者也 可以不用任何载体给药。
糖衣丸的核可使用适当的包衣。为此目的可以使用浓缩的糖 溶液，其中任选地含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮， 聚羰乙烯凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和适当的有 机溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣丸中加入染料或色素以 标识或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入式胶囊，以 及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入 式胶囊可以含有活性成分与填充物如乳糖，粘合剂如淀粉，和/ 或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选地稳定剂的混合物。在软 胶囊中，活性化合物可以在合适的液体中溶解或悬浮，例如脂肪 油，液体石蜡，或液体聚乙二醇。除此之外，还可以加入稳定剂。 口服给药也可以使用微球制剂。这种微球在现有技术中已有定 义。所有的口服给药制剂的剂量都应适合给药。
对于面颊给药，组合物可以采用片剂或传统方式配制的锭 剂。
对于吸入式给药，用于本发明的化合物可以方便地以加压容 器或喷雾器中喷出的悬浮喷雾的形式递送，其中使用合适的推进 剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳 或其它合适的气体。使用加压喷雾的时候，剂量单位可以通过用 泵计量剂量来确定剂量单位。在吸入器或吹药器中使用的明胶胶 囊和药仓可以制备成含有化合物和合适的粉末基如乳糖或淀粉 的混合物。
化合物在需要全身递送的时候可以配制成通过注射的肠胃 外给药，例如通过快速浓注或持续输注。注射配方可以制成剂量 单位形式，例如安瓿瓶或夺剂量容器，并加入防腐剂。组合物可 采用这样的形式，悬浮液，溶液或油性或水性乳剂，也可以含有 配方试剂例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶 液。此外，也可以将活性化合物的悬液制备成合适的油性注射悬 液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或者合成 的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。水性注射 悬浮液可以包含可增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素 钠，山梨醇，或右旋糖苷。可选择地，悬浮液还可以含有合适的 稳定剂或可增加化合物溶解性的试剂，以制备高浓缩的溶液。
可选择地，活性化合物可以是粉末形式，在使用前与合适的 载体，例如无菌不含热源的水混合。
化合物还可以制成直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠 剂，例如含有传统的栓剂主剂如可可油或其它甘油酯。
除了上述的配方，化合物还可以配制成储存剂。这样的长效 制剂可以加入合适的聚合物质或疏水物质(例如可接收的油包裹 的乳剂)或离子交换树脂，或保守可溶性衍生物，如保守可溶性 盐。
药物组合物还可以含有合适的固体或凝胶状载体或赋形剂。 这种载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，不同的 糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶，和聚合物如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制剂形式是，例如用于吸入的水或盐 水溶液，微胶囊化的，螺旋体化的，包裹微观金颗粒，包含在脂 质体中，喷雾状，悬浮微粒，植入皮肤的丸剂，或者在尖锐物体 表面干燥并刮擦皮肤。药物组合物还可以包括微粒，粉末，片剂， 包衣片剂，(微)胶囊，栓剂，糖浆剂，乳剂，悬浮液，霜剂， 液滴，或者活性化合物缓释制备物，其中使用如上所述的赋形剂 和添加剂和/或辅助剂，例如崩解剂，粘合剂，涂层剂，溶胀剂， 润滑剂，调味剂，甜味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种 药物递送系统。药物递送方法的综述参见Langer R(1990) Scielzce 249：1527-1533，在此引入其全文作为参考。
核酸和任选地其它治疗和/或抗原可以进行自身(纯的)给药 或者以药学可接收的盐给药。在药物中使用的时候，所述的盐应 是药学可接收的，但是非药学可接收的盐也可以用于制备其药学 可接收的盐。这样的盐包括但不限于那些用下述酸制备的盐：盐 酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，对甲 苯磺酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，蚁酸，丙二酸，湖泊酸，萘 -2-磺酸，以及苯磺酸。而且这种盐可以制成碱金属或碱土金属盐， 例如羧酸基团的钠，钾或钙盐。
合适的缓冲试剂包括乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐 (1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；和磷酸和盐(0.8-2％ w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯代丁 醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯类(0.01-0.25％w/v)和硫 柳汞(0.004-0.02％w/v)。
所述组合物可以方便地以剂量单位形式制备，也可以用药学 领域熟知的任何方法制备。所有的方法都包括使化合物和一种由 一种或多种辅助成分组成的载体结合的步骤。通常，通过将化合 物与液体载体，细微的固体载体或两者结合，然后，如果需要的 话，使产品成形来制备组合物。液体剂量单位是小瓶或安瓿瓶。 固体剂量单位是片剂，胶囊和栓剂。
其它递送系统可以包括定时释放的，延迟释放的或持续释放 的递送系统。这样的系统可以避免重复进行化合物给药，为患者 和医师提供了方便。许多类型的释放递送系统都是可获得的，也 是本领域普通技术人员所公知的。包括聚合物基系统，例如聚(丙 交酯-乙交酯)，共聚草酸盐，聚己酸内酯，聚酰胺酯，聚原酸酯， 聚羟基丁酸，以及聚酐。
含有药物的上述聚合物的微胶囊在美国专利No.5,075,109 中有描述。递送系统还包括非聚合物系统：含有甾醇如胆固醇， 胆固醇酯和脂肪酸或中性脂如单，二，和三甘油酯的脂类；水凝 胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包被；用传统的粘 合剂和赋形剂制成的压缩丸剂；部分融合的植入物等。特定的例 子包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中本发明的制剂被包含在如 美国专利Nos.4,452,775,4,675,189和5,736，152所述的基质中， 以及(b)扩散系统，其中活性组分以可控速度从如美国专利Nos. 3,854,480,5,133,974和5,407,686所述的聚合物中释出。此外， 可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合于植入。
本发明还提供了识别免疫刺激化合物以及最佳化所识别的 化合物和试剂的有效方法。通常，筛选方法包括检测能抑制或增 强通过特定TLR的信号转导的化合物。该方法使用TLR，合适 的TLR的参考配体，以及候选免疫刺激化合物。使选定的TLR 与合适的参考化合物(TLR配体)接触，测量TLR介导的参考 信号。选定的TLR再和候选免疫刺激化合物接触，测量TLR介 导的检测信号。然后比较检测信号和参考信号。将合适的候选免 疫刺激化合物随后在检测中用作参考化合物。这种方法适用于对 候选化合物进行自动化的，高通量的筛选。这种高通量筛选方法 的例子参见美国专利Pat.No.6,103,479；6,051,380；6,051,373； 5,998,152；5,876,946；5,708,158；5,443,791；5,429,921；和 5,143,854。
这里所说的“TLR信号转导”指TLR多肽激活Toll/IL-1R (TIR)信号转导途径的能力，也指TLR信号转导途径。TLR活 性的变化可以通过检测B敏感的启动子和增强子控制下的基因 表达来测量。这种基因可以是天然存在的基因或者可以是人工引 入细胞的基因。天然存在的基因包括编码IL-1b，IL-6，IL-8，白 介素的p40亚基(IL-12p40)，以及共刺激分子CD80和CD86 的基因。其它基因也可以置于这种调控元件的控制下从而报道 TLR信号传导的水平。
检测混合物含有候选免疫刺激化合物。典型地，复杂检测混 合物同时用不同的试剂浓度进行，得到对各种浓度的不同应答。 典型地，这些浓度中的一种作为负对照，即试剂浓度为零，或者 试剂浓度在检测能发现的限度以下。候选免疫刺激化合物可以包 含数种化学物质，典型地是有机化合物。在某些实施方案中，候 选免疫刺激化合物是小的RNA或者小的有机化合物，即分子量 高于50且低于大约2500道尔顿的有机化合物。聚合的候选免疫 刺激化合物可以具有更高的分子量，例如分子量在大约2500至 大约12,500的寡核苷酸。候选免疫刺激化合物还可以是生物分子 如核酸，肽，多糖，脂肪酸，甾醇，类异戊二烯，嘌呤，嘧啶， 上述物质的衍生物或结构类似物，及其组合。其中候选免疫刺激 化合物是核酸，典型地所述候选免疫刺激化合物是DNA或RNA 分子，也可以包括具有非天然键或亚基的核酸。
候选免疫刺激化合物可以从不同来源获得，包括天然的，合 成的或半合成的化合物文库，或其任意组合。例如可以用多种方 法随机合成或定向合成各种有机化合物和生物分子，包括随机寡 核苷酸的表达，合成有机组合文库，随机肽的噬菌体展示文库， 等等。可选择地，细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化 合物文库是可获得的或者易于制备获得。
除此之外，天然的和合成的文库可以通过传统的化学，物理 和生物化学方法修饰。进一步，也可以将已知的药物制剂进行定 向或随机的化学修饰，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化等，以 得到候选免疫刺激化合物的结构类似物。
混合物中也可以包含各种其它试剂。其中包括试剂如盐，缓 冲液，中性蛋白(例如清蛋白)，去垢剂等，它们有助于实现最 佳的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸结合。这种试剂还可以还原反应组 分的非特异性或背景相互作用。还可以使用其它能提高检测效率 的试剂如蛋白酶抑制剂，核酸酶抑制剂，抗微生物制剂等等。
加入各组分的顺序，培育温度，培育时间以及检测的其它参 数都是很容易确定的。因此试验过程仅包括最优化检测参数，而 不是确定检测的基本组成。培育温度典型地是在4℃到40℃之间， 更典型地是大约37℃。培育时间优选是尽量短以实现快速，高通 量的筛选，典型地是在1分钟到10小时之间。
进行培育以后，可以使用使用者可获得的任何方法检测TLR 信号传导水平。对于不含细胞类型的检测，通常用分离步骤将结 合组分从未结合组分上分离出来。可以用多种方法实现分离步 骤。例如，可以在溶液中进行分离，或者，可以使至少一种组分 固定在固体底物上，从而使未结合组分可以很容易地被分离。固 体底物可以由多种材料制成多种形状，例如微量滴定盘，微珠， 检测条，树脂颗粒等。底物优选为可以使信噪比最大化，最小化 背景结合，同时便于分离并节约成本。
分离可以是从容器中移出微珠或检测条，倾空或稀释容器， 如微量滴定盘上的孔，漂洗微珠和颗粒，用洗脱液或溶剂进行柱 层析或过滤。分离步骤优选包括多次漂洗或洗涤。例如，当固体 底物是微量滴定盘的时候，用洗脱液将孔洗涤几次，洗脱液中一 般含有那些培育混合物中不参与特异性结合的组分，例如盐，缓 冲液，去垢剂，非特异性蛋白等。如果固体底物是磁珠，则将磁 珠用洗脱液洗涤一次或多次，然后用磁铁分离。
也可以用任何合适的方法进行基于细胞的检测，例如检测细 胞内的，或其表面的，或由细胞分泌的诱导多肽。用于基于细胞 的检测的检测方法包括荧光激活细胞分类术(FACS)，生物体发 光，荧光，酶联免疫吸附检测(ELISA)，逆转录酶-聚合酶链式 反应(RT-PCR)等等。用于不含细胞的检测的检测方法包括生 物体发光，荧光，ELISA，RT-PCR等。
实施例
实施例1 人PBMC对会有G，U的寡核苷酸的反应性。
人外周血单核细胞(PBMC)是从健康的供体中分离出来的， 数量为3×105细胞/孔，在体外用各种检测物和对照免疫刺激试剂 刺激16小时，然后用得自BD-Pharmingen的匹配的抗体对通过 酶联免疫吸附检测(ELISA)分析分泌的细胞因子IL-12p40和 TNF-，根据供应商提供的操作手册进行。其中还包括特定的负 对照，该负对照仅包括培养基以及仅包括DOTAP(10μg/200μl 培养物孔；“脂质体”)。对照免疫刺激试剂包括咪唑并硅诺酮 R-848(2μg/ml)；脂多糖(LPS；1μg/ml)，Pam3Cys(5μg/ml)， poly IC(50μg/ml)，以及CpG DNA(50μg/ml)。这些试剂分别 是TLR7，TLR4，TLR2，TLR3，和TLR9的报道配体。检测免 疫刺激试剂包括下述RNA分子，每种50μg/ml，含有或不含 DOTAP(总量为10μg，分别表示为“含有脂质体”和“不含脂 质体”)：单独的GUGUUUAC；单独的GUAGGCAC；GUGUUUAC 与GUAGGCAC的组合；GUAGGA；GAAGGCAC；CUAGGCAC； CUCGGCAC；以及CCCCCCCC。这些RNA寡核苷酸每种都在 倒数第二个和3’末端核苷之间含有硫逐磷酸酯连接。
图1显示了人PBMC对上述检测和对照试剂的反应性，通过 测量IL-12p40(pg/ml)的分泌量。如图1所示，PBMC对R-848， LPS，Pam3Cys和poly IC产生反应，但不对单独的DOTAP产生 反应。在对含有G，U的RNA寡核苷酸，单独的GUGUUUAC， 单独的GUAGGCAC，GUGUUUAC和GUAGGCAC的组合； CUAGGCAC；以及CUCGGCAC的反应中，人PBMC分泌大量 的IL-12p40(10-20ng/ml)，其中每种寡核苷酸含有DOTAP。而 且在对不含G，U的RNA寡核苷酸GAAGGCAC和CCCCCCCC 的反应中，人PBMC不分泌大量的IL-12p40。含有G，U的RNA 分子的免疫刺激效果可以通过引入DOTAP显著地提高。在这个 试验中，不论是否含有DOTAP，含有G，U的6聚体RNA GUAGGA都几乎没有显示出免疫刺激效果。
图2显示了人PBMC对上述检测和对照试剂的反应性，通过 测量的是TNF-α的分泌量。其具有与图1所示的相似的结果，在 对含有G，U的RNA寡核苷酸，单独的GUGUUUAC，单独的 GUAGGCAC，GUGUUUAC和GUAGGCAC的组合； CUAGGCAC；以及CUCGGCAC的反应中，人PBMC分泌大量 的TNF-α(40-100ng/ml)，其中每种寡核苷酸都和DOTAP组合。 而且与图1的结果类似，在对不含G，U的RNA寡核苷酸 GAAGGCAC和CCCCCCCC的反应中，或者在对含有G，U的6 聚体RNA GUAGGA的反应中，人PBMC不分泌显著量的TNF-α。 含有G，U的RNA分子的免疫刺激效果通过引入DOTAP表现出 显著地提高。
应当注意的是，在这个实施例中，下述部分自身互补的碱基 对是可能的，其中G-U不稳定碱基对用点连接，G-C和A-U碱 基对用线连接。
CUAGGCAC
|. .|
CACGGAUC
CUAGGCAC
||||
CACGGAUC
CUCGGCAC
|. .|
CACGGCUC
CUCGGCAC
.||.
CACGGCUC
实施例2 人PBMC对含有G，U的寡核糖核酸的剂量反应行为。
使用前述实施例中的试验方法，用不同浓度的RNA寡核苷 酸评价人PBMC对本发明的含有G，U的RNA寡核苷酸的剂量 反应行为。将总量为10，3或1g的RNA加入到10g DOTAP 中，然后加入到2001培养物中。16小时后如实施例1所述那 样进行IL-12p40和TNF-α的ELISA。
图3显示了人PBMC对各种RNA的剂量反应行为，通过测 量IL-12p40(ng/ml)的分泌量。从图3中可以看出，随着含有 G，U的RNA寡聚物GUGUUUAC；GUAGGCAC；CUAGGCAC； 和CUCGGCAC的量的增加，人PBMC产生反应时分泌IL-12p40 的量也增加，其中每种RNA寡聚物都含有DOTAP。相反地，图 3还显示出人PBMC在对任何检测量的不含G，U的RNA寡聚 物GAAGGCAC或CCCCCCCC的反应中不分泌IL-12p40。
相应地人PBMC对不同RNA的反应还通过分泌TNF-α的量 来测量。与图3所示结果类似，随着含有G，U的RNA寡聚物 GUGUUUAC；GUAGGCAC；CUAGGCAC；和CUCGGCAC的 量的增加，人PBMC产生反应时分泌TNF-α的量也增加，其中 每种RNA寡聚物都含有DOTAP。而且与图3的结果类似，人 PBMC在对任何检测量的不含G，U的RNA寡聚物GAAGGCAC 或CCCCCCCC的反应中也不分泌TNF-α。
实施例3 对RNA寡聚物敏感的碱基序列
对RNA寡核苷酸GUAGGCAC进行点突变，在选定位点取 代A或C。不同的寡核糖核酸包括下述核酸：GUAGGCAC； GUAGGA；GAAGGCAC；AUAAACAC；AUAGACAC； AUAAGCAC；GUAAACAC；CUAGGCAC；CUCGGCAC；和 GUGUUUAC。寡核苷酸被滴定到分离自健康供体的人PBMC上， 然后放置为3×105个细胞/孔。总量为10g的RNA加入到10g DOTAP中，然后加入到200l培养物孔中。人TNF-α通过ELISA 测量，使用得自BD-Pharmingen的匹配抗体对，根据供应商提供 的操作手册进行。结果如图4所示。
实施例4 DOTAP对于人PBMC对不同刺激的反应的影响
为了进一步鉴定DOTAP对于上述实施例中观察到的含有G， U的RNA寡聚物的免疫刺激效果的影响，从健康供体中分离人 PBMC，放置为3×105个细胞/孔，并在存在已知TLR配体的条件 下进行刺激，刺激物含有或者不含DOTAP(分别表示为“含有 脂质体”或“不含脂质体”)。已知的TLR配体是从菌丝制备的 总RNA(菌丝)，从酵母制备的总RNA(酵母)，从早幼粒细胞 细胞系HL-60制备的总RNA(HL60)，大肠杆菌Sp6的体外转 录的核糖体RNA，大肠杆菌T7的体外转录的核糖体RNA，LPS， poly IC，Pam3Cys，和R-848。单独的培养基和单独的DOTAP 都可以作为负对照。试验还包括前述实施例中的RNA 10μg/ml 以及不含DOTAP的组。
总RNA是从人早幼粒细胞系HL-60中用Trizol(Sigma)分 离的。分离前细胞先用500mM过氧化氢(H2O2)处理4小时， 在此细胞系(HL60 500)中诱导细胞凋亡。未处理的细胞作为对 照(HL600).
白色假丝酵母RNA由酵母或菌丝中分离(用10％胎牛血清 进行4小时培育来诱导)。从100ml培养基中分离细胞，漂洗并 在10ml Tris/EDTA缓冲液(10mM，1mM)中重悬。RNA的分 离是用热酸苯酚提取，方法如Ausubel FM et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons，New York所 述。
大肠杆菌16S RNA基因组片段用引物 5′-ATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACG-3′(SEQ ID NO：5)和5′-TAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCC-3′(SEQ ID NO：6)从大肠杆菌基因组DNA中扩增，并克隆到pGEM T easy vector中。用T7或Sp6 RNA聚合酶进行体外转录。转录的 RNA进一步用氯仿/苯酚提取纯化，沉淀，取10μg使用。
培育16小时以后，如前所述进行ELISA检测IL-12p40和 TNF-α的分泌。结果如图5所示。
图5显示了与或不与DOTAP共培育后DOTAP对于人PBMC 分泌IL-12p40的量的影响。如图中所看出的，下述刺激在存在 DOTAP的时候比没有DOTAP的时候其免疫刺激效果更强：菌 丝，酵母，大肠杆菌Sp6，大肠杆菌T7。下述刺激在存在DOTAP 的时候比没有DOTAP的时候免疫刺激效果降低：LPS，poly IC。 下述刺激在存在或没有DOTAP的条件下免疫刺激效果相同： HL60，Pam3Cys和R-848。
实施例5 含有G，U的RNA寡聚物的
免疫刺激效果是依赖于种属和MyD88的
下述鼠细胞经分离并与不同的RNA和其他已知的TLR配体 培育，以检测种属，细胞类型和信号传导途径的特异性：野生型 巨噬细胞与IFN-γ；J774(鼠巨噬细胞系)；和RAW 264.7(小鼠 巨噬细胞系，例如ATCC TIB-71)。将野生型或MyD88缺陷型的 C57BL/6小鼠的骨髓细胞加入50ng/ml M-CSF培养5天得到鼠骨 巨噬细胞。细胞接种为25,000个细胞/孔并用20ng/ml IFN-γ处理 16小时。鼠巨噬细胞系RAW和J774接种为10,000个细胞/孔。
对下述检测和控制试剂进行检测：R-848(2μg/ml)，ODN 1668 (CpG DNA；5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’；SEQ ID NO： 7)；LPS(1μg/ml)；poly IC(50μg/ml)；Pam3Cys(5μg/ml)； 离子霉素/TPA；下述RNA分子，每种都含有(“+脂质体”)并 且不含DOTAP(10μg/200μl培养孔)：单独的GUGUUUAC (RNA1)；单独的GUAGGCAC(RNA2)；GUGUUUAC与 GUAGGCAC的组合(RNA1/2)； UCCGCAAUGGACGAAAGUCUGACGGA(RNA6；SEQ ID NO： 8)；GAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUU(RNA9；SEQ ID NO：9)；以及下述DNA分子，分别相应于RNA1，RNA2，和 RNA1/2：单独的GTGTTTAC(DNA1)；单独的GTAGGCAC (DNA2；以及GTGTTTAC和GTAGGCAC的组合(DNA1/2)。 这些RNA和DNA寡核苷酸每种都在倒数第二个和3’端核苷之间 具有硫逐磷酸酯连接。RNA6和RNA9每种都另外在倒数第二个 和5’端核苷之间还具有硫逐磷酸酯连接。RNA6相应于单核细胞 增多性李氏菌中的核糖体RNA茎环。相应于人免疫缺陷病毒 (HIV，一种RNA逆转录病毒)中的茎环。细胞培养12小时， 收集上清。鼠IL-12 p40，IL-6，和TNF-α通过ELISA检测，检 测使用得自BD-Pharmingen的匹配抗体对，按照供应商提供的操 作手册进行。结果如图6所示。
图6中A组显示了野生型鼠巨噬细胞在对R-848；ODN 1668 (CpG DNA)；LPS；poly IC；Pam3Cys；和含有G，U的RNA 寡聚物GUGUUUAC与GUAGGCAC的组合(含有DOTAP)的 应答中，在存在IFN-γ的条件下分泌显著量的IL-12 p40。相反， 图6的B组显示了MyD88缺陷型的鼠巨噬细胞在对任何检测和 对照试剂的反应中，在存在IFN-γ的条件下几乎不分泌IL-12p40， 由此证明对这些化合物的免疫刺激反应是依赖于MyD88的。这 样的结果与TLR参与对这些化合物，特别是本发明的含有G，U 的RNA寡核苷酸的免疫刺激反应是一致的。图6的C和D组显 示了J774和RAW 264.7鼠巨噬细胞系的反应模式，即使稍微有 些减弱，它们与野生型鼠巨噬细胞在存在IFN-时的反应模式类 似，如A组所示。在IL-6和TNF-α的平行ELISA检测中也观察 到基本相似的结果。
在对MyD88野生型细胞的其他研究中，观察到bafilomycin 的加入可显著或完全消除RNA寡聚物的免疫刺激效果。这种现 象和MyD88依赖性都涉及到TLR3，TLR7，TLR8和TLR9中的 至少一个。
实施例6 用胆甾醇酯代替阳离子酸
为了研究用胆甾醇酯修饰的RNA寡聚物代替RNA寡聚物加 阳离子酸的可能性，制备了具有(R 1058)和没有(R 1006)3’ 胆甾醇酯修饰的RNA寡聚物GUGUGUGU。这两个RNA寡聚物， 其中含有或不含DOTAP，加入到不同浓度的人PBMC的过夜培 养物中。收集培养物上清，用ELISA检测人TNF-α，IL-12 p40， 和IFN-α，检测使用得自BD Pharmingen的匹配抗体对，根据供 应商的操作手册进行。包括DOTAP的试验结果如表1所示。
表1 DOTAP处的胆甾醇酯修饰 ID TNF-α +DOTAP TNF-α -DOTAP IFN-α +DOTAP IFN-α -DOTAP EC50 m max pg/ml EC50， m max pg/ml EC50 m max pg/ml EC50 m max pg/ml R 1006 2.8 40000 7.8 2200 4.5 5000 - - R 1058 0.2 75000 1.0 3000 0.5 3800 0.5 1500
结果表明不论是否含有DOTAP，具有胆甾醇酯修饰的R 1058 比具有相同碱基序列但没有胆甾醇酯修饰的R 1006的效果更好。
实施例7 寡聚物长度的效果
RNA寡聚物GUGUGUGU，GUGUGUG，GUGUGU，GUGUG， GUGU，GUG，和GU，其中含有或不含DOTAP，加入到不同浓 度的人PBMC过夜培养物中。收集培养物上清，用ELISA检测 人TNF-α，IL-12 p40，和IFN-α，检测使用得自BD Pharmingen 的匹配抗体对，根据供应商的操作手册进行。包括DOTAP的试 验结果如表2所示。
表2 RNA寡聚物长的的效果 ID SEQ TNF-α IL-12 p40 IFN-α EC50，μM max pg/ml EC50， μM max pg/ml EC50， μM max pg/ml R 1006 GUGUGU GU 2.8 40000 1.6 7000 4.5 5000 R 1048 GUGUGU G 2.2 30000 2.6 10000 4.6 2700 R 1049 GUGUGU 6.7 30000 2.1 8000 4.8 3400 R 1050 GUGUG 7.6 40000 3.9 14000 6.9 400 R 1051 GUGU - - ＞20 14000 - - R 1052 GUG - - ＞20 6000 5.5 800 R 1053 GU - - ＞20 5000 - -
实施例8 核苷间连接的稳定化效果
GUGUGUGU RNA寡聚物用特定的硫逐磷酸酯和磷酸二酯 键合成，如表2所示，其中“*”代表硫逐磷酸酯，“-”代表磷酸二 酯，RNA寡聚物，其中含有或不含DOTAP，加入到不同浓度的 人PBMC过夜培养物中。收集培养物上清，用ELISA检测人 TNF-α，IL-12p40，和IFN-α，检测使用得自BD Pharmingen的 匹配抗体对，根据供应商的操作手册进行。包括DOTAP的试验 结果如表3所示。
表3 核苷间链接的稳定化效果 ID SEQ TNF-α IFN-α EC50，μ M max，pg/ ml EC50，μ M max，pg/ml R 1006 G*U*G*U*G*U *G*U 2.8 40000 4.5 5000 R 1054 G*U_G*U*G*U *G*U 5.6 40000 6.7 3700 R 1055 G*U_G*U_G*U *G*U ＞20 20000 - - R 1056 G*U_G*U_G*U _G*U ＞20 12000 - - R 1057 G_U_G_U_G_U _G_U - - 0.1 6000
用类似的方式，合成全部都是磷酸二酯的，能形成茎环结构 的并具有5′-CACACACUGCUUAAGCGCUUGCCUGCUUAAGU AGUGUGUG-3′(R 1041；SEQ ID NO：10)的碱基序列的40 聚体，并在人PBMC的过夜培养物中检测。发现该RNA寡聚物 能够诱导IFN-α，其EC50＜0.1μM，最大值为5000pg/ml。
实施例9 DNA∶RNA结合体
制备一系列DNA∶RNA结合体，每种都含有RNA序列 GUGUGUGU和poly-dT或poly-dG序列。寡聚物如下所示，其 中仍然是“*”代表硫逐磷酸酯，“_”代表磷酸二酯：
G*U*G*U*G*U*G*U_dG_dG*dG*dG*dG*dG (R 1060；SEQ ID NO：11)
dG*dG*dG*dG_dG_G*U*G*U*G*U*G*U (R 1061；SEQ ID NO：12)
G*U*G*U*G*U*G*U*dT*dT*dT*dT*dT*dT (R 1062；SEQ ID NO：13)
dT*dT*dT*dT*dT*G*U*G*U*G*U*G*U (R 1063；SEQ ID NO：14)
加入DNA∶RNA结合体后将人PBMC过夜培养，其中含有或 不含DOTAP。收集培养物上清，用ELISA检测人TNF-α，IL-6， IL-12p40，IP10和IFN-α，检测使用得自BD Pharmingen的匹配 抗体对，根据供应商的操作手册进行。包括DOTAP的试验结果 如表4所示。
表4 免疫刺激DNA∶RNA结合体 ID TNF-α IL-6 IP-10 EC50，μ M max pg/ml EC50，μ M max pg/ml EC50，μ M max pg/ml R 1060 4.9 20000 - - - - R 1061 4.3 20000 ＞20 10000 1.1 180 R 1062 0.3 80000 0.4 28000 0.1 400 R 1063 0.3 60000 0.8 28000 0.1 250
实施例10 转移RNA
人PBMC在存在不同浓度(1，3，和10mg/ml)的来自麦芽， 牛，酵母和大肠杆菌的tRNA的条件下培养过夜，其中含有或不 含DOTAP。收集培养物上清，用ELISA检测人TNF-α和IL-12 p40，检测使用得自BD Pharmingen的匹配抗体对，根据供应商 的操作手册进行。在存在DOTAP的时候，酵母和大肠杆菌的 tRNA，以及较低程度的牛tRNA，可诱导TNF-α和IL-12p40。此 外，即使没有DOTAP，大肠杆菌浓度为3和10μg/ml的时候也 能够诱导少量的细胞因子。
实施例11 HIV RNA
人PBMC在存在两种关键的富含G，U的序列中的任一种的 条件下培养过夜，该两种序列分别为5′-GUAGUGUGUG-3′(SEQ ID NO：2)和5′-GUCUGUUGUGUG-3′(SEQ ID NO：3)，分别 相应于HIV-1菌株BH10的第99-108位核苷酸和第112-123 位核苷酸，每种都含有或不含DOTAP。收集培养物上清，用ELISA 检测人IL-12p40和TNF-α，检测使用得自BD Pharmingen的匹 配抗体对，根据供应商的操作手册进行。结果如图7所示。图中 显示了这两种RNA分子在存在DOTAP的条件下，在微摩尔浓度 均可以诱导50-100ng/ml的TNF和50-200ng/ml的IL-12p40。
实施例12 人PBMC对严谨反应因子的反应性
当细菌饥饿的时候具有程序性反应，称为严谨反应。这个过 程包括核酸alarmones的产生和核糖体的丢失。高速生长的细菌 含有70,000-80,000个核糖体，占其干重的50％之多。当生长减 缓的时候，不需要的核糖体就会被水解。设想快速生长的细胞在 其早期静止期含有大量的寡核苷酸，当细胞进入中性pH环境中 这些寡核苷酸就被释放到介质中。
图10显示了人PBMC对严谨反应因子(SRF)的反应性。 SRF是快速生长的细菌(单核细胞增多性李氏菌)在营养介质中 产生的，直至它们达到对数末期。收集细菌沉淀，在等体积的PBS 中重悬24h。将混合物离心除去细菌。将上清灭菌并通过0.2m 滤膜过滤。灭菌溶液通过截止10kDa的分子过滤器过滤。在C18 柱上分离级分，检测洗脱液。浓度为5μg/ml的SRF可诱导人 PBMC分泌TNF。如果SRF用三种RNA酶中的任一种处理则活 性被破坏。这种活性不是由RNA以外的别的物质带来的，因为 RNA酶处理的SRF具有近似的背景刺激能力。这种显现暗示活 性是由RNA带来的。
实施例13 人PBMC对核糖核苷氧钒基复合物的反应性
在SRF的研究中，惊讶地发现RNA酶抑制剂，核糖核苷氧 钒基复合物(RVC)，可以刺激人PBMC产生TNF(图11)和IL-6。
图11显示了人PBMC对核糖核苷氧钒基复合物(RVC)的 反应性。出乎意料地发现在对RNA酶抑制剂的检测中，RVC可 刺激人PBMC。2mM的RVC可诱导大量TNF的释放。还检测了 抗病毒的咪唑并喹诺酮，resiquimod(R-848)由X代表，使用浓 度为0.1μg/ml。
实施例14 人TLR7和人TLR8对核糖核苷的反应性
实施例13中观察到的结论可扩展到用TLR7和TLR8遗传重 组的293细胞，但不是未转染的293细胞(图12)。在对单个核 糖核苷氧钒基复合物的分析中，出人意料地发现核糖核苷A，U， C和G的混合物或者单个的核糖核苷G在缺乏钒酸盐的条件下 可有效刺激PBMC产生TNF和TLR7或TLR8并激活NF-B(图 12)
图12显示了人TLR7和人TLR8对核糖核苷的反应性。确定 人PBMC对RNA或RVC的反应是由TLR7或TLR8介导的，并 且进一步，所述反应可以仅由核糖核苷引发。人293细胞或者 mock转染，或者被TLR7或TLR8转染，并监测其对核糖核苷的 反应性。人TLR7(hTLR7)和人TLR8(hTLR8)的开放阅读框 用PCR并用如下引物对从人PBMC的cDNA文库中扩增：对于 TLR7，5′-CACCTCTCATGCTCTGCTCTCTTC-3′(SEQ ID NO： 15)以及5′-GCTAGACCGTTTCCTTGAACACCTG-3′(SEQ ID NO ： 16 ) ； 对 于 TLR8 ， 5′-CTGCGCTGCTGCAAGTTACGGAATG-3′(SEQ ID NO：17) 以及5′-GCGCGAAATCATGACTTAACGTCAG-3′(SEQ ID NO： 18)。用于选择引物的序列信息是得自Genbank accession numbers AF240467和AF245703。将全长TLR片段克隆到pGEM-T Easy 载体(Promega，Mannheim，Germany)中，用NotI酶切，克隆 到表达载体pcDNA 3.1(-)(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中 并测序。hTLR7和hTLR8的编码区序列分别相应于序列号 AF240467(SEQ ID NO：25)和AF245703(SEQ ID NO：29)。
为了监测NF-B的瞬间激活，在含有1μg TLR表达质粒， 20ng NF-KB荧光素酶报道子质粒和14μg of pcDNA3.1(-)质粒作 为载体的含有25％胎牛血清(FCS)的400μl RPMI介质中，在 200V和960F的条件下对3×106 293 HEK细胞(ATCC，VA， USA)进行电穿孔。细胞接种为每孔105个细胞，过夜培养后 用R-848(在图12中用X表示；商业上由GLSynthesis Inc.， Worcester，MA，USA合成)，RVC或核糖核苷进一步刺激7小 时。被刺激的细胞用报道子溶解缓冲液(Promega，Mannheim， Germany)溶解，溶解产物用Berthold光度计(Wildbad，Germany) 检测荧光酶活性。
如图12所示，TLR7转染子对R-848，RVC，核糖核苷(0.5 mM的A，G，C，U)和鸟嘌呤核糖核苷的混合物有反应。同样 地，TLR8也表现出类似的反应模式。
实施例16 TLR7和TLR8对两种核糖核苷混合物的反应性
图13显示了TLR7和TLR8对两种核糖核苷混合物的反应 性，在如图11所示的试验中，已发现TLR8对核糖核苷G和U 的反应最强，但是TLR7对单独的G的反应最强。此外还可以看 到对C和U的组合反应最弱。这些数据显示出具有正确组合的 核糖核苷可作为TLR7和TLR8的配体。TPA的非特异性刺激仅 作为对照，X代表R-848。
实施例17 人PBMC对核糖核苷G和U的混合物的反应。
图14显示了人PBMC对核糖核苷G和U的混合物的反应。 可以看到核糖核苷G和U在诱导人PBMC分泌TNF上有协同作 用。在这个实施例中，G∶U的最佳比为1∶10。
实施例18 人PBMC对富含G，U的寡核苷酸的反应
图15显示了人PBMC对富含G，U的寡核苷酸的反应。RNA 和DNA寡核苷酸5′-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3′(SEQ ID NO：I和19)都用来对人PBMC进行了检测，浓度为30μM，监 测TNF的量。人PBMC对富含G，U的RNA寡核苷酸具反应性， 但是对富含G，U的DNA寡核苷酸没有反应性。
实施例19 人PBMC对氧化性RNA的反应性
图16显示了人PBMC对氧化性RNA的反应性。从大肠杆菌 中分离核糖体16S RNA，进行化学氧化。所进行的处理为(mod A)0.2mM抗坏血酸加0.2mM CuCl2，在37℃培育30分钟，或 者(mod B)0.2mM抗坏血酸加0.02mM CuCl2，在37℃培育30 分。该处理可以诱导8个位点的鸟嘌呤核苷的氧化，还可以诱导 修饰的鸟嘌呤核苷的3’端的链的断裂。可以看到核糖体RNA诱 导人PBMC产生TNF。还可以明显看到核糖体RNA的氧化显著 增强了反应。
实施例20 人TLR7对氧化性鸟嘌呤核糖核苷的反应
图17显示了人TLR7和TLR8对氧化性鸟嘌呤核糖核苷的反 应。mock转染的细胞或者被人TLR7或TLR8转染的细胞，如实 施例14所述，用于检验对7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷(洛索立 宾)的反应性，浓度为1mM。可以明显看出TLR7对7-烯丙基-8- 氧代鸟嘌呤核苷具有反应性。因此看来氧化性核酸是TLR7的一 种配体。
实施例21 人TLR7对其它修饰的鸟嘌呤核糖核苷的反应
图18显示了人TLR7对其它修饰的鸟嘌呤核糖核苷的反应。 用人TLR7转染的细胞，如实施例14中所述，被用于检测对7- 烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷(洛索立宾)的剂量依赖型反应。除此 之外，还检验了其它修饰的鸟嘌呤核苷。可以明显看出人TLR 7 对7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷具有剂量依赖型的反应。如上所述 人TLR7对鸟嘌呤核苷具反应性；但是图18还显示出人TLR7 对鸟嘌呤核苷的脱氧形式和8-溴-鸟嘌呤核苷也具有一定的反应 性。
实施例12 人TLR的分布
图19显示了人TLR1-TLR9的分布。通过PCR检测不同的 纯化人免疫细胞中TLR1至9的表达。可以看到人淋巴CD123+ 树突状细胞(DC)对TLR9和TLR7具有强烈的反应性，但是 TLR8的反应性较弱。而骨髓CD11c+DC则相反。这两种结果 是非常相关的，因为这两种类型的DC在免疫系统中具有完全不 同的功能。值得注意的是，图19还显示出人嗜中性粒细胞对人 TLR8显示出强阳性，但是对TLR9是弱阳性，而对TLR7为阴 性。这也是彼此相关的，因为嗜中性粒细胞通常是应答感染性病 原体的第一种细胞，因而可以引发反应。
实施例23 HEK-293细胞被人TLR7或人TLR8稳定转染。
除此之外，所述细胞还可以被NF-KB-荧光素酶报道子构建 体稳定转染。所述细胞用不同数量的RNA寡核苷酸滴定然后培 养6h。用标准方法测量荧光素酶活性，并对mock刺激转染子归 一化。将mock刺激转染子的荧光素酶活性设定为1倍NF-κB诱 导的值。结果如图20所示，图为已有的被刺激RNA寡核苷酸诱 导的NF-κB相对于检测核苷酸的浓度。GUGUGUGU刺激人 TLR8。GUAGUCAC刺激人TLR7和人TLR8。
等同情况
上述描述足以使本领域技术人员实施本发明。本发明的保护 范围不受实施例的限制，实施例仅是对本发明的某个方面所举的 例子，其它功能上等同的实施方案也在本发明的保护范围之内。 除了上述内容之外对，根据上述的描述对本发明作各种修改对本 领域技术人员来说是显而易见的，也落在权利要求的保护范围之 内。本发明的优点和目的不一定包括在本发明的每个实施方案 中。
本申请中引用的所有参考文献，专利和专利出版物在此都引 入其全文作为参考。
序 列 表
<110>科勒制药股份公司
<120>含有G，U的免疫刺激寡核糖核苷酸
<130>C01041.70037
<140>PCT/US03/10406
<141>2003-04-04
<150>US 60/421,966
<151>2002-10-29
<150>US 60/370，515
<151>2002-04-04
<160>39
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
guugugguug ugguugug 18
<210>2
<211>10
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
guagugugug 10
<210>3
<211>12
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
gucuguugug ug 12
<210>4
<211>27
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
gccgaguagu guugggucgc gaaaggc 27
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
attgaagat ttgatcatgg ctcagattga acg 33
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>6
taaggaggtg atccaaccgc aggttcc 27
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210>8
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8
uccgcaaugg acgaaagucu gacgga 26
<210>9
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
gagaugggug cgagagcguc aguauu 26
<210>10
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>10
cacacacugc uuaagcgcuu gccugcuuaa guagugugug 40
<210>11
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(14)
<223>combined DNA/RNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>RNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(14)
<223>DNA sequence
<400>11
gugugugugg gggg 14
<210>12
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<212>DNA
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<223>RNA sequence
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ggggggugug ugu 13
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(14)
<223>combined DNA/RNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>RNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(14)
<223>DNA sequence
<400>13
gugugugutt tttt 14
<210>14
<211>13
<212>DNA
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(13)
<223>combined DNA/RNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5)
<223>DNA sequence
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(13)
<223>RNA sequence
<400>14
tttttgugug ugu 13
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
cacctctcat gctctgctct cttc 24
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
gctagaccgt ttccttgaac acctg 25
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>17
ctgcgctgct gcaagttacg gaatg 25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>18
gcgcgaaatc atgacttaac gtcag 25
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>all deoxyribonucleic acid nucleotides
<400>19
guugugguug ugguugug 18
<210>20
<211>904
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro
1 5 10 15
Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His
20 25 30
Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp
35 40 45
Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu
65 70 75 80
Asp Val Gly Phe Asn THr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln
85 90 95
Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser
100 105 110
Gln Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu
115 120 125
His Leu Met Ser Asn Ser Ile Gln Lys Ile Lys Asn Asn Pro Phe Val
130 135 140
Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser
145 150 155 160
Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu
165 170 175
Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp
180 185 190
Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln
195 200 205
Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe His Ala Ile Gly Arg Leu Phe
210 215 220
Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys
225 230 235 240
Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser
245 250 255
Asn Ser Gln Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys
260 265 270
Trp Thr Asn Leu Yhr Met Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val
275 280 285
Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu Pro Gln Leu Glu Tyr Phe Phe
290 295 300
Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe Ser His Ser Leu His Gly
305 310 315 320
Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gln
325 330 335
Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gln
340 345 350
Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro
355 360 365
Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu
370 375 380
Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr
385 390 395 400
Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His ile Leu Asn Leu Thr Lys
405 410 415
Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Phe Ser Trp Leu Gly His
420 425 430
Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ile Gly Gln Glu Leu Thr
435 440 445
Gly Gln Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser
450 455 460
Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Thr Arg Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro
465 470 475 480
Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp
485 490 495
Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gln Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp
500 505 510
Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly
515 520 525
Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gln His Asn Asn Leu Ala Arg
530 535 540
Leu Irp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly
545 550 555 560
Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu
565 570 575
Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp
580 585 590
Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ser
610 615 620
Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu
625 630 635 640
Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp
645 650 655
Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser
660 665 670
Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val
675 680 685
Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu Leu
690 695 700
Phe Phe Met Ile Asn Thr Ser Ile Leu Leu Ile Phe Ile Phe Ile Val
705 710 715 720
Leu Leu Ile His Phe Glu Gly Trp Arg Ile Ser Phe Tyr Trp Asn Val
725 730 735
Ser Val His Arg Val Leu Gly Phe Lys Glu Ile Asp Arg Gln Thr Glu
740 745 750
Gln Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp
755 760 765
Trp Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gln Ser Leu
770 775 780
Lys Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu
785 790 795 800
Glu Ala Ile Val Asn Ser Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val
805 810 815
Ile Thr His His Leu Leu Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val
820 825 830
His His Ala Val Gln Gln Ala Ile Glu Gln Asn Leu Asp Ser Ile Ile
835 840 845
Leu Val Phe Leu Glu Glu Ile Pro Asp Tyr Lys Leu Asn His Ala Leu
850 855 860
Cys Leu Arg Arg Gly Met Phe Lys Ser His Cys Ile Leu Asn Trp Pro
865 870 875 880
Val Gln Lys Glu Arg Ile Gly Ala Phe Arg His Lys Leu Gln Val Ala
885 890 895
Leu Gly Ser Lys Asn Ser Val His
900
<210>21
<211>3057
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>21
cactttcgag agtgccgtct atttgccaca cacttccctg atgaaatgtc tggatttgga 60
ctaaagaaaa aaggaaaggc tagcagtcat ccaacagaat catgagacag actttgcctt 120
gtatctactt ttgggggggc cttttgccct ttgggatgct gtgtgcatcc tccaccacca 180
agtgcactgt tagccatgaa gttgctgact gcagccacct gaagttgact caggtacccg 240
atgatctacc cacaaacata acagtgttga accttaccca taatcaactc agaagattac 300
cagccgccaa cttcacaagg tatagccagc taactagctt ggatgtagga tttaacacca 360
tctcaaaact ggagccagaa ttgtgccaga aacttcccat gttaaaagtt ttgaacctcc 420
agcacaatga gctatctcaa ctttctgata aaacctttgc cttctgcacg aatttgactg 480
aactccatct catgtccaac tcaatccaga aaattaaaaa taatcccttt gtcaagcaga 540
agaatttaat cacattagat ctgtctcata atggcttgtc atctacaaaa ttaggaactc 600
aggttcagct ggaaaatctc caagagcttc tattatcaaa caataaaatt caagcgctaa 660
aaagtgaaga actggatatc tttgccaatt catctttaaa aaaattagag ttgtcatcga 720
atcaaattaa agagttttct ccagggtgtt ttcacgcaat tggaagatta tttggcctct 780
ttctgaacaa tgtccagctg ggtcccagcc ttacagagaa gctatgtttg gaattagcaa 840
acacaagcat tcggaatctg tctctgagta acagccagct gtccaccacc agcaatacaa 900
ctttcttggg actaaagtgg acaaatctca ctatgctcga tctttcctac aacaacttaa 960
atgtggttgg taacgattcc tttgcttggc ttccacaact agaatatttc ttcctagagt 1020
ataataatat acagcatttg ttttctcact ctttgcacgg gcttttcaat gtgaggtacc 1080
tgaatttgaa acggtctttt actaaacaaa gtatttccct tgcctcactc cccaagattg 1140
atgatttttc ttttcagtgg ctaaaatgtt tggagcacct taacatggaa gataatgata 1200
ttccaggcat aaaaagcaat atgttcacag gattgataaa cctgaaatac ttaagtctat 1260
ccaactcctt tacaagtttg cgaactttga caaatgaaac atttgtatca cttgctcatt 1320
ctcccttaca catactcaac ctaaccaaga ataaaatctc aaaaatagag agtgatgctt 1380
tctcttggtt gggccaccta gaagtacttg acctgggcct taatgaaatt gggcaagaac 1440
tcacaggcca ggaatggaga ggtctagaaa atattttcga aatctatctt tcctacaaca 1500
agtacctgca gctgactagg aactcctttg ccttggtccc aagccttcaa cgactgatgc 1560
tccgaagggt ggcccttaaa aatgtggata gctctccttc accattccag cctcttcgta 1620
acttgaccat tctggatcta agcaacaaca acatagccaa cataaatgat gacatgttgg 1680
agggtcttga gaaactagaa attctcgatt tgcagcataa caacttagca cggctctgga 1740
aacacgcaaa ccctggtggt cccatttatt tcctaaaggg tctgtctcac ctccacatcc 1800
ttaacttgga gtccaacggc tttgacgaga tcccagttga ggtcttcaag gatttatttg 1860
aactaaagat catcgattta ggattgaata atttaaacac acttccagca tctgtcttta 1920
ataatcaggt gtctctaaag tcattgaacc ttcagaagaa tctcataaca tccgttgaga 1980
agaaggtttt cgggccagct ttcaggaacc tgactgagtt agatatgcgc tttaatccct 2040
ttgattgcac gtgtgaaagt attgcctggt ttgttaattg gattaacgag acccatacca 2100
acatccctga gctgtcaagc cactaccttt gcaacactcc acctcactat catgggttcc 2160
cagtgagact ttttgataca tcatcttgca aagacagtgc cccctttgaa ctctttttca 2220
tgatcaatac cagtatcctg ttgattttta tctttattgt acttctcatc cactttgagg 2280
gctggaggat atctttttat tggaatgttt cagtacatcg agttcttggt ttcaaagaaa 2340
tagacagaca gacagaacag tttgaatatg cagcatatat aattcatgcc tataaagata 2400
aggattgggt ctgggaacat ttctcttcaa tggaaaagga agaccaatct ctcaaatttt 2460
gtctggaaga aagggacttt gaggcgggtg tttttgaact agaagcaatt gttaacagca 2520
tcaaaagaag cagaaaaatt atttttgtta taacacacca tctattaaaa gacccattat 2580
gcaaaagatt caaggtacat catgcagttc aacaagctat tgaacaaaat ctggattcca 2640
ttatattggt tttccttgag gagattccag attataaact gaaccatgca ctctgtttgc 2700
gaagaggaat gtttaaatct cactgcatct tgaactggcc agttcagaaa gaacggatag 2760
gtgcctttcg tcataaattg caagtagcac ttggatccaa aaactctgta cattaaattt 2820
atttaaatat tcaattagca aaggagaaac tttctcaatt taaaaagttc tatggcaaat 2880
ttaagttttc cataaaggtg ttataatttg tttattcata tttgtaaatg attatattct 2940
atcacaatta catctcttct aggaaaatgt gtctccttat ttcaggccta tttttgacaa 3000
ttgacttaat tttacccaaa ataaaacata taagcacgta aaaaaaaaaa aaaaaaa 3057
<210>22
<211>905
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Met Lys Gly Cys Ser Ser Tyr Leu Met Tyr Ser Phe Gly Gly Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Trp Ile Leu Leu Val Ser Ser Thr Asn Gln Cys Thr Val Arg
20 25 30
Tyr Asn Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr His Ile Pro Asp
35 40 45
Asp Leu Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu
50 55 60
Arg Arg Leu Pro Pro Thr Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Ala Ile
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Leu Asp Ala Gly Phe Asn Ser Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys
85 90 95
Gln Ile Leu Pro Leu Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu
100 105 110
Ser Gln Ile Ser Asp Gln Thr Phe Val Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu
115 120 125
Leu Asp Leu Met Ser Asn Ser Ile His Lys Ile Lys Ser Asn Pro Phe
130 135 140
Lys Asn Gln Lys Asn Leu Ile Lys Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu
145 150 155 160
Ser Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gly Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu
165 170 175
Leu Leu Leu Ala Lys Asn Lys Ile Leu Ala Leu Arg Ser Glu Glu Leu
180 185 190
Glu Phe Leu Gly Asn Ser Ser Leu Arg Lys Leu Asp Leu Ser Ser Asn
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210 215 220
Phe Ala Leu Leu Leu Asn Asn Ala Gln Leu Asn Pro His Leu Thr Glu
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Lys Leu Cys Trp Glu Leu Ser Asn Thr Ser Ile Gln Asn Leu Ser Leu
245 250 255
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260 265 270
Lys Trp Thr Asn Leu Thr Gln Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu His
275 280 285
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385 390 395 400
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465 470 475 480
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Ser Val Glu Lys Asp Val Phe Gly Pro Pro Phe Gln Asn Leu Asn Ser
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675 680 685
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Val Ser Val His Arg Ile Leu Gly Phe Lys Glu Ile Asp Thr Gln Ala
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<210>23
<211>3310
<212>DNA
<213>小鼠
<400>23
tagaatatga tacagggatt gcacccataa tctgggctga atcatgaaag ggtgttcctc 60
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ccagaagaat ctaatcaaat tagatttgtc tcataatggt ttatcatcta caaagttggg 540
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tagcatcaaa agaagccgaa aaatcatttt cgttatcaca caccatttat taaaagaccc 2520
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<210>24
<211>1049
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Met Val Phe Pro Met Trp Thr Leu Lys Arg Gln Ile Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Asn Ile Ile Leu Ile Ser Lys Leu Leu Gly Ala Arg Trp Phe Pro Lys
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Thr Asn Thr Thr Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn His Ile Pro Asp Ile
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Phe His Arg Leu Asp His Leu Val Glu Ile Asp Phe
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Gly Leu Pro Pro Ser Leu Gln Leu Leu Ser Leu Glu Ala Asn Asn Ile
145 150 155 160
Phe Ser Ile Arg Lys Glu Asn Leu Thr Glu Leu Ala Asn Ile Glu Ile
165 170 175
Leu Tyr Leu Gly Gln Asn Cys Tyr Tyr Arg Asn Pro Cys Tyr Val Ser
180 185 190
Tyr Ser Ile Glu Lys Asp Ala Phe Leu Asn Leu Thr Lys Leu Lys Val
195 200 205
Leu Ser Leu Lys Asp Asn Asn Val Thr Ala Val Pro Thr Val Leu Pro
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Ser Thr Leu Thr Glu Leu Tyr Leu Tyr Asn Asn Met Ile Ala Lys Ile
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Gln Glu Asp Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gln Leu Gln Ile Leu Asp Leu
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Val Pro Pro Arg Trp Phe Lys Asn Ile Asn Lys Leu Gln Glu Leu Asp
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Leu Ser Gln Asn Phe Leu Ala Lys Glu Ile Gly Asp Ala Lys Phe Leu
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Val Leu Asp Leu Gly Thr Asn Phe Ile Lys Ile Ala Asn Leu Ser Met
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Trp Asp Val Trp Tyr Ile Tyr His Phe Cys Lys Ala Lys Ile Lys Gly
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885 890 895
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cgtctacaca gtaactctct tcagcatgtg cccccaagat ggtttaagaa catcaacaaa 1080
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ccgtgtcatc cagggcccca ttctgtgcag attgagtgtg ggcaccacac aggtggttgc 4140
tgcttcagtg cttcctgctc tttttccttg ggcctgcttc tgggttccat agggaaacag 4200
taagaaagaa agacacatcc ttaccataaa tgcatatggt ccacctacaa atagaaaaat 4260
atttaaatga tctgccttta tacaaagtga tattctctac ctttgataat ttacctgctt 4320
aaatgttttt atctgcactg caaagtactg tatccaaagt aaaatttcct catccaatat 4380
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gcaacgttag atggttttga tggtaaaccc taaaggagga ctccaagagt gtgtatttat 4500
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<210>26
<211>1050
<212>PRT
<213>小鼠
<400>26
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tctatgttgg aactacacgg aaaccccttt gaatgcacct gtgacattgg agatttccga 2400
agatggatgg atgaacatct gaatgtcaaa attcccagac tggtagatgt catttgtgcc 2460
agtcctgggg atcaaagagg gaagagtatt gtgagtctgg agctgacaac ttgtgtttca 2520
gatgtcactg cagtgatatt atttttcttc acgttcttta tcaccaccat ggttatgttg 2580
gctgccctgg ctcaccattt gttttactgg gatgtttggt ttatatataa tgtgtgttta 2640
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<210>30
<211>1059
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>30
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Leu Ala His His Leu Phe Tyr Trp Asp Val Trp Phe Ile Tyr Asn Val
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<212>DNA
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tgcacattcc ctggagacac tgctactgag ccataatcat ttctctcacc taccctctgg 2220
cttcctctcc gaagccagga atctggtgca cctggatcta agtttcaaca caataaagat 2280
gatcaataaa tcctccctgc aaaccaagat gaaaacgaac ttgtctattc tggagctaca 2340
tgggaactat tttgactgca cgtgtgacat aagtgatttt cgaagctggc tagatgaaaa 2400
tctgaatatc acaattccta aattggtaaa tgttatatgt tccaatcctg gggatcaaaa 2460
atcaaagagt atcatgagcc tagatctcac gacttgtgta tcggatacca ctgcagctgt 2520
cctgtttttc ctcacattcc ttaccacctc catggttatg ttggctgctc tggttcacca 2580
cctgttttac tgggatgttt ggtttatcta tcacatgtgc tctgctaagt taaaaggcta 2640
caggacttca tccacatccc aaactttcta tgatgcttat atttcttatg acaccaaaga 2700
tgcatctgtt actgactggg taatcaatga actgcgctac caccttgaag agagtgaaga 2760
caaaagtgtc ctcctttgtt tagaggagag ggattgggat ccaggattac ccatcattga 2820
taacctcatg cagagcataa accagagcaa gaaaacaatc tttgttttaa ccaagaaata 2880
tgccaagagc tggaacttta aaacagcttt ctacttggcc ttgcagaggc taatggatga 2940
gaacatggat gtgattattt tcatcctcct ggaaccagtg ttacagtact cacagtacct 3000
gaggcttcgg cagaggatct gtaagagctc catcctccag tggcccaaca atcccaaagc 3060
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tgacgatttg tacattgatt ccattaggca atactagtga tgggaagtca cgactctgcc 3180
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<210>34
<211>1032
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>34
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1 5 10 15
Ala Ile Met Leu Ala Met Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe
20 25 30
Leu Pro Cys Glu Leu Gln Pro His Gly Leu Val Asn Cys Asn Trp Leu
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Val Pro His Phe Ser Met Ala Ala Pro Arg Gly Asn
50 55 60
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65 70 7 80
Ser Asp Phe Ala His Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Trp
85 90 95
Asn Cys Pro Pro Val Gly Leu Ser Pro Met His Phe Pro Cys His Met
100 105 110
Thr Ile Glu Pro Ser Thr Phe Leu Ala Val Pro Thr Leu Glu Glu Leu
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130 135 140
Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Met Leu Asp Ser
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Ala Ser Leu Ala Gly Leu His Ala Leu Arg Phe Leu Phe Met Asp Gly
165 170 175
Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Arg Gln Ala Leu Glu Val Ala Pro
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Asn Asn Leu Thr Val Val Pro Arg Asn Leu Pro Ser Ser Leu Glu Tyr
210 215 220
Leu Leu Leu Ser Tyr Asn Arg Ile Val Lys Leu Ala Pro Glu Asp Leu
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245 250 255
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Leu Asp Met His Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asp Glu Thr Thr Leu
370 375 380
Arg Pro Leu Ala Arg Leu Pro Met Leu Gln Thr Leu Arg Leu Gln Met
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405 410 415
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<212>DNA
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
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Pro Leu Ser Leu Leu Val Gln Ala Ile Met Leu Ala Met Thr Leu Ala
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50 55 60
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Met Ala Ala Pro Arg Gly Asn Val Thr Ser Leu Ser Leu Ser Ser Asn
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Arg His Leu Asn Leu Lys Trp Asn Cys Pro Pro Val Gly Leu Ser Pro
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Val Pro Ala Leu Pro Lys Ser Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ser His Thr
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Asn Ile Leu Met Leu Asp Ser Ala Ser Leu Ala Gly Leu His Ala Leu
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Arg Phe Leu Phe Met Asp Gly Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Arg
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Leu Pro Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Leu Leu Ser Tyr Asn Arg Ile Val
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Leu Asp Leu Ala Gly Asn Gln Leu Lys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Leu
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Pro Ala Gly Thr Arg Leu Arg Arg Leu Asp Val Ser Cys Asn Ser Ile
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Ser Phe Val Ala Pro Gly Phe Phe Ser Lys Ala Lys Glu Leu Arg Glu
740 745 750
Leu Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Lys Thr Val Asp His Ser Trp Phe
755 760 765
Gly Pro Leu Ala Ser Ala Leu Gln Ile Leu Asp Val Ser Ala Asn Pro
770 775 780
Leu His Cys Ala Cys Gly Ala Ala Phe Met Asp Phe Leu Leu Glu Val
785 790 795 800
Gln Ala Ala Val Pro Gly Leu Pro Ser Arg Val Lys Cys Gly Ser Pro
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Gly Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ile Phe Ala Gln Asp Leu Arg Leu Cys
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Leu Asp Glu Ala Leu Ser Trp Asp Cys Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala
835 840 845
Val Ala Leu Gly Leu Gly Val Pro Met Leu His His Leu Cys Gly Trp
850 855 860
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965 970 975
Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val
980 985 990
Ile Leu Ser Pro Asp Gly Arg Arg Ser Arg Tyr Val Arg Leu Arg Gln
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Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val Leu Leu Trp Pro His Gln Pro Ser
1010 1015 1020
Gly Gln Arg Ser Phe Trp Ala Gln Leu Gly Met Ala Leu Thr Arg
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Ala Glu
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgcgtctcc gtgacaatta cctggccttc tttaagtggt ggagcctcca cttcctgccc 2100
aaactggaag tcctcgacct ggcaggaaac cagctgaagg ccctgaccaa tggcagcctg 2160
cctgctggca cccggctccg gaggctggat gtcagctgca acagcatcag cttcgtggcc 2220
cccggcttct tttccaaggc caaggagctg cgagagctca accttagcgc caacgccctc 2280
aagacagtgg accactcctg gtttgggccc ctggcgagtg ccctgcaaat actagatgta 2340
agcgccaacc ctctgcactg cgcctgtggg gcggccttta tggacttcct gctggaggtg 2400
caggctgccg tgcccggtct gcccagccgg gtgaagtgtg gcagtccggg ccagctccag 2460
ggcctcagca tctttgcaca ggaactgcgc ctctgcctgg atgaggccct ctcctgggac 2520
tgtttcgccc tctcgctgct ggctgtggct ctgggcctgg gtgtgcccat gctgcatcac 2580
ctctgtggct gggacctctg gtactgcttc cacctgtgcc tggcctggct tccctggcgg 2640
gggcggcaaa gtgggcgaga tgaggatgcc ctgccctacg atgccttcgt ggtcttcgac 2700
aaaacgcaga gcgcagtggc agactgggtg tacaacgagc ttcgggggca gctggaggag 2760
tgccgtgggc gctgggcact ccgcctgtgc ctggaggaac gcgactggct gcctggcaaa 2820
accctctttg agaacctgtg ggcctcggtc tatggcagcc gcaagacgct gtttgtgctg 2880
gcccagacgg accgggtcag tggtctcttg cgcgccagct tcctgctggc ccagcagcgc 2940
ctgctggagg accgcaagga cgtcgtggtg ctggtgatcc tgagccctga cggccgccgc 3000
tcccgctatg tgcggctgcg ccagcgcctc tgccgccaga gtgtcctcct ctggccccac 3060
cagcccagtg gtcagcgcag cttctgggcc cagctgggca tggccctgac cagggacaac 3120
caccacttct ataaccggaa cttctgccag ggacccacgg ccgaa 3165
<210>38
<211>1032
<212>PRT
<213>小鼠
<400>38
Met Val Leu Arg Arg Arg Thr Leu His Pro Leu Ser Leu Leu Val Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Leu Ala Glu Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe
20 25 30
Leu Pro Cys Glu Leu Lys Pro His Gly Leu Val Asp Cys Asn Trp Leu
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Val Pro Arg Phe Ser Ala Ala Ala Ser Cys Ser Asn
50 55 60
Ile Thr Arg Leu Ser Leu Ile Ser Asn Arg Ile His His Leu His Asn
65 70 75 80
Ser Asp Phe Val His Leu Ser Asn Leu Arg Gln Leu Asn Leu Lys Trp
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Asn Cys Pro Pro Thr Gly Leu Ser Pro Leu His Phe Ser Cys His Met
100 105 110
Thr Ile Glu Pro Arg Thr Phe Leu Ala Met Arg Thr Leu Glu Glu Leu
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Asn Leu Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Thr Val Pro Arg Leu Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Val Asn Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Val Leu Asp Ala
145 150 155 160
Asn Ser Leu Ala Gly Leu Tyr Ser Leu Arg Val Leu Phe Met Asp Gly
165 170 175
Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Thr Gly Ala Val Lys Val Thr Pro
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Leu Ser Leu Lys Tyr
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Asn Asn Leu Thr Lys Val Pro Arg Gln Leu Pro Pro Ser Leu Glu Tyr
210 215 220
Leu Leu Val Ser Tyr Asn Leu Ile Val Lys Leu Gly Pro Glu Asp Leu
225 230 235 240
Ala Asn Leu Thr Ser Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg
245 250 255
Arg Cys Asp His Ala Pro Asn Pro Cys Ile Glu Cys Gly Gln Lys Ser
260 265 270
Leu His Leu His Pro Glu Thr Phe His His Leu Ser His Leu Glu Gly
275 280 285
Leu Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu His Thr Leu Asn Ser Ser Trp Phe
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Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn Phe Leu
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Tyr Glu Ser Ile Asn His Thr Asn Ala Phe Gln Asn Leu Thr Arg Leu
325 330 335
Arg Lys Leu Asn Leu Ser Phe Asn Tyr Arg Lys Lys Val Ser Phe Ala
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Arg Leu His Leu Ala Ser Ser Phe Lys Asn Leu Val Ser Leu Gln Glu
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Leu Asn Met Asn Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Leu
370 375 380
Arg Trp Leu Ala Asp Leu Pro Lys Leu His Thr Leu His Leu Gln Met
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Asn Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu Ser Ile Phe Gly Thr Phe Arg Ala
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Leu Arg Phe Val Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Ser Gly Pro Ser Thr
420 425 430
Leu Ser Glu Ala Thr Pro Glu Glu Ala Asp Asp Ala Glu Gln Glu Glu
435 440 445
Leu Leu Ser Ala Asp Pro His Pro Ala Pro Leu Ser Thr Pro Ala Ser
450 455 460
Lys Asn Phe Met Asp Asp Cys Lys Asn Phe Lys Phe Thr Met Asp Leu
465 470 475 480
Ser Arg Asn Asn Leu Val Thr Ile Lys Pro Glu Met Phe Val Asn Leu
485 490 495
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Val Asn Gly Ser Gln Phe Leu Pro Leu Thr Asn Leu Gln Val Leu Asp
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Leu Ser His Asn Lys Leu Asp Leu Tyr His Trp Lys Ser Phe Ser Glu
530 535 540
Leu Pro Gln Leu Gln Ala Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Ser Gln Pro Phe
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Ser Met Lys Gly Ile Gly His Asn Phe Ser Phe Val Ala His Leu Ser
565 570 575
Met Leu His Ser Leu Ser Leu Ala His Asn Asp Ile His Thr Arg Val
580 585 590
Ser Ser His Leu Asn Ser Asn Ser Val Arg Phe Leu Asp Phe Sre Gly
595 600 605
Asn Gly Met Gly Arg Met Trp Asp Glu Gly Gly Leu Tyr Leu His Phe
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Leu His Ile Leu Arg Pro Gln Asn Leu Asp Asn Leu Pro Lys Ser Leu
645 650 655
Lys Leu Leu Ser Leu Arg Asp Asn Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Trp Thr
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Ser Leu Ser Phe Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Asp Leu Ala Gly Asn
675 680 685
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Gln Lys Leu Asp Val Ser Ser Asn Ser Ile Val Ser Val Val Pro Ala
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Phe Phe Ala Leu Ala Val Glu Leu Lys Glu Val Asn Leu Ser His Asn
725 730 735
Ile Leu Lys Thr Val Asp Arg Ser Trp Phe Gly Pro Ile Val Met Asn
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Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr Asn Glu Leu Arg Val Arg Leu Glu
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<400>39
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ggggcagcct tcgtagactt actgttggag gtgcagacca aggtgcctgg cctggctaat 2400
ggtgtgaagt gtggcagccc cggccagctg cagggccgta gcatcttcgc acaggacctg 2460
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gccgtgggca tggtggtgcc tatactgcac catctctgcg gctgggacgt ctggtactgt 2580
tttcatctgt gcctggcatg gctacctttg ctggcccgca gccgacgcag cgcccaagct 2640
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tataacgagc tgcgggtgcg gctggaggag cggcgcggtc gccgagccct acgcttgtgt 2760
ctggaggacc gagattggct gcctggccag acgctcttcg agaacctctg ggcttccatc 2820
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