技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种聚合物胶束及其应用。
背景技术
透皮给药系统(transdermal therapeutic system，TTS)是指在皮肤表面给药，药物以恒定速度依次穿透角质层、表皮层、真皮层，最终进入体循环，产生全身或局部治疗作用的新兴制剂。透皮给药有以下4个优势：
(1)透皮给药系统可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响.减少用药的个体差异。
(2)维持恒定有效血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应。
(3)减少给药次数，提高治疗效能，延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受。
(4)使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。
皮肤是人体的天然屏障，能够阻碍药物进入体内；大多数药物，即使是剂量低、疗效高的一些药物，透皮速率也难以满足治疗需要，这成为研究开发TTS的最大障碍。如何保证足够量的药物透过皮肤进入体内达到治疗剂量，是TTS研究的重点，高新技术及方法的应用是解决问题的重要途径。
目前，用于促进皮肤渗透的技术可分为化学法和物理法。
化学法包括月桂氮卓酮、有机酸及其酯类化合物、吡咯烷酮类衍生物等化学试剂，其作用机理为溶解皮肤脂质或使皮肤蛋白变性，增加类脂质骨架的无序性，从而促进药物在角质层扩散，增加药物在皮肤中的溶解度，使药物透皮吸收增加。
物理方法包括离子电渗促透方法、超声波促透方法、电致孔促透方法等，主要是通过电磁场、超声波、激光等物理手段来促进药物的透皮吸收，物理促透技术最适宜于蛋白质、肽类和某些大分子药物的透皮吸收。
但是，上述两种方法都有它们的局限性，化学法由于会破坏皮肤的表面结构，所以会导致一些皮肤的刺激性反应；而物理法主要依赖外界的作用，一般需要一些特殊的设备，所以限制了这类方法的应用。
近年来，纳米药物载体在经皮给药领域的研究迅速增加。一些纳米药物制剂已进入临床研究阶段，部分制剂产品如肝素脂质体、双氯芬酸脂质体、聚维酮碘脂质体、雌二醇纳米乳、吲哚美辛纳米乳等已上市应用。纳米药物载体可有效促进小分子药物的透皮吸收，而在大分子药物经皮给药研究方面也展现了良好的前景。
胶束材料作为一种纳米级别的结构，其表面的可修饰性，生物相容性使其成为了一种倍受关注的药物载体，被广泛运用在药物递送，抗肿瘤和靶向治疗等方面，但是目前为止，胶束的设计基本是基于肿瘤微环境，而将胶束运用在透皮方面还未见报道。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种聚合物胶束及其应用，该聚合物胶束能够携载药物，促进药物进入皮肤真皮层，且在皮肤的酸性pH环境具有良好的稳定性和生物相容性，可以结合药物进行皮肤的局部靶向给药。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种聚合物胶束，为核-壳结构，由两亲性的嵌段共聚物在水中自组装形成，所述嵌段共聚物的结构通式如式(I)所示，
其中，R1为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氨基酯、聚氧基丙烯酸烷酯或它们的衍生物；R2为透皮肽，其氨基酸序列为ACTGSTQHQCG、RRRRRRR、ACSSSPSKHCG、ACKTGSHNQCG或HIITDPNMAEYL；m、n、z均为大于2的整数。
上述聚合物胶束中，R1部分为疏水段；透明质酸和R2部分为亲水段；m是指聚合物胶束中连接有R1的透明质酸结构单元的单元数；n是指聚合物胶束中连接有的透明质酸结构单元的单元数；z是指未连接R1和R2的透明质酸结构单元的单元数。
R1接枝率的高低以及R1的分子量大小对药物的靶向性均有影响，作为优选，所述R1在所在单体中的接枝率为1～20％。
作为优选，聚合物胶束中，所述R1的总分子量为1000～50000。
R2接枝率的高低对整个聚合物胶束的透皮效果有影响，作为优选，所述R2在所在单体中的接枝率为1～20％。
作为优选，所述R1为聚氨基酯，R2的氨基酸序列为ACTGSTQHQCG，m:n＝1:1，该方案不仅药物靶向性好，透皮效果也最佳，能够更好地发挥药物的作用。
本发明还提供了所述的聚合物胶束在作为皮肤药物载体中的应用。
本发明还提供了一种携载药物的聚合物胶束复合物，包括药物和载体，所述载体为所述的聚合物胶束。
具体地，所述药物为DNA、siRNA、miRNA或疏水类化学药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以透明质酸为主链，通过在主链上连接疏水的聚合物R1和亲水的多肽R2制备获得具有载药功能的聚合物胶束，能够促进药物进入皮肤真皮层，且在皮肤的酸性pH环境下，具有良好的稳定性和生物相容性，可以结合基因药物进行皮肤的局部靶向给药。
(2)本发明聚合物胶束能够高效携载基因药物，并作用于皮肤，实现皮肤的局部靶向给药。
附图说明
图1为聚合物胶束/FITC-DNA复合物中透明质酸的1H-NMR图谱(溶剂为D2O)；
图2为聚合物胶束/FITC-DNA复合物中透皮肽(ACTGSTQHQCG)的1H-NMR图谱(溶剂为D2O)；
图3为聚合物胶束/FITC-DNA复合物中聚合物R1的1H-NMR图谱(溶剂为CDCL3)；
图4为聚合物胶束/FITC-DNA复合物中透明质酸-多肽的1H-NMR图谱(溶剂为D2O)；
图5为聚合物胶束/FITC-DNA复合物的1H-NMR图谱(溶剂为D2O)；
图6为聚合物胶束/FITC-DNA复合物的TEM电镜图；
图7为聚合物胶束/FITC-DNA复合物的DLS粒径测量结果示意图；
图8为聚合物胶束/FITC-DNA复合物携载基因后的TEM电镜图；
图9为聚合物胶束/FITC-DNA复合物携载基因FITC-DNA后的入胞图；图中A为胶束/FITC-DNA组；B为裸FITC-DNA组；
图10为聚合物胶束/FITC-DNA复合物携载基因FITC-DNA后在激光共聚焦下的透皮效果图；图中A为胶束/FITC-DNA；B为裸FITC-DNA组；
具体实施方式
本发明实施例中透明质酸来源于山东福瑞达医药集团，合成后的多肽经纯化，其纯度为95％，取5mg透明质酸或多肽样品，溶解于D2O中，使用核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)进行分析，两者的13H NMR图谱如图1、图2所示。
实施例1
聚合物胶束和聚合物胶束/FITC-DNA复合物的制备：
1、高分子聚合物R1(聚氨基酯)的合成
取3.73g三氨基丙醇和10g二丙烯酸-1,4-丁二酯，置于90℃下搅拌并加热回流，进行均聚反应3小时；反应完毕后，将产物溶解于20ml三氯甲烷中，加入10倍体积的经过预冷的乙醚溶液，使产物沉淀；重复过滤沉淀的产物三次，将过滤后的产物真空干燥24小时，得到纯度较高的聚合物聚氨基酯，核磁共振结果如图3所示。
2、透明质酸-多肽的合成
取100mg透明质酸(MW＝17000)，置于20ml超纯水中搅拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明质酸1小时后，加入1mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，继续搅拌0.5小时～5小时至反应完全进行；将反应后的反应液装入分子量为3500的透析袋中，透析24小时，除去未反应上的杂质和多肽，再加入冻干保护剂进行冻干24小时，得到干燥的透明质酸-多肽固体，核磁共振结果如图4所示。
3、聚合物胶束的合成方法
将50mg透明质酸-多肽溶于20ml水中，搅拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，搅拌1h使透明质酸上剩余的部分羧基活化。
取0.1g聚合物R1，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，搅拌12h后，倒入预冷过的乙醚溶液中，取出沉淀将其置于室温下的真空干燥箱中，得到经过氨基修饰的聚合物R1。
将0.1g经过修饰的聚合物R1溶于pH＝3的水中，随后加入活化后的透明质酸-多肽溶液，继续搅拌6小时，将终产物透析24小时，除去杂质和未反应的原料；再加入冻干保护剂，并冻干24小时，得到干燥的最终产物聚合物胶束，核磁共振结果如图5所示。
4、聚合物胶束负载基因的方法
取10mg聚合物胶束，溶解于1ml水中，调节pH至3，使聚合物胶束完全溶解于水中。取2μg FITC-DNA，向其中加入10μl的聚合物胶束溶液，随后稀释至30μl，在37℃下孵育15分钟制得聚合物胶束/FITC-DNA复合物。
实施例2
聚合物胶束和聚合物胶束/FITC-DNA复合物的制备：
1、高分子聚合物R1(聚氨基酯)的合成
取3.73g三氨基丙醇和10g二丙烯酸-1,4-丁二酯，置于90℃下搅拌并加热回流，进行均聚反应3小时；反应完毕后，将产物溶解于20ml三氯甲烷中，加入10倍体积的经过预冷的乙醚溶液，使产物沉淀；重复过滤沉淀的产物三次，将过滤后的产物真空干燥24小时，得到纯度较高的聚合物聚氨基酯，核磁共振结果如图3所示。
2、透明质酸-多肽的合成
取100mg透明质酸(MW＝17000)，置于20ml超纯水中搅拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明质酸1小时后，加入50mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，继续搅拌0.5小时～5小时至反应完全进行；将反应后的反应液装入分子量为3500的透析袋中，透析24小时，除去未反应上的杂质和多肽，再加入冻干保护剂进行冻干24小时，得到干燥的透明质酸-多肽固体，核磁共振结果如图4所示。
3、聚合物胶束的合成方法
将50mg透明质酸-多肽溶于20ml水中，搅拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，搅拌1h使透明质酸上剩余的部分羧基活化。
取1g聚合物R1，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，搅拌12h后，倒入预冷过的乙醚溶液中，取出沉淀将其置于室温下的真空干燥箱中，得到经过氨基修饰的聚合物R1。
将1g经过修饰的聚合物R1溶于pH＝3的水中，随后加入活化后的透明质酸-多肽溶液，继续搅拌6小时，将终产物透析24小时，除去杂质和未反应的原料；再加入冻干保护剂，并冻干24小时，得到干燥的最终产物聚合物胶束，核磁共振结果如图5所示。
4、聚合物胶束负载基因的方法
取10mg聚合物胶束，溶解于1ml水中，调节pH至3，使聚合物胶束完全溶解于水中。取2μg FITC-DNA，向其中加入10μl的聚合物胶束溶液，随后稀释至30μl，在37℃下孵育15分钟制得聚合物胶束/FITC-DNA复合物。
实施例3
取100mg透明质酸(MW＝17000)，置于20ml超纯水中搅拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明质酸1小时后，加入10mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，继续搅拌4小时至反应完全进行；将反应后的反应液装入分子量为3500的透析袋中，透析24小时，除去未反应上的杂质和多肽，再加入冻干保护剂进行冻干24小时，得到干燥的透明质酸-多肽固体。
将50mg透明质酸-多肽溶于20ml水中，搅拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，搅拌1h使透明质酸上剩余的部分羧基活化。
取0.5g聚合物R1，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，搅拌12h后，倒入预冷过的乙醚溶液中，取出沉淀将其置于室温下的真空干燥箱中，得到经过氨基修饰的聚合物R1。
将0.5g经过修饰的聚合物R1溶于pH＝3的水中，随后加入活化后的透明质酸-多肽溶液，继续搅拌6小时，将终产物透析24小时，除去杂质和未反应的原料；再加入冻干保护剂，并冻干24小时，得到干燥的最终产物聚合物胶束，此产物即为最优实验条件下所得的胶束。
聚合物胶束/FITC-DNA复合物的验证：
(1)对空载的聚合物胶束和携载DNA后的聚合物胶束/FITC-DNA复合物进行形态观察
取空载的聚合物胶束和携载DNA后的聚合物胶束/FITC-DNA复合物，分别加在专用铜网上，直接在透射电镜下观察粒子的大小和形态，结果如图6和图8所示。
(2)聚合物胶束/FITC-DNA复合物在黑色素瘤细胞内的摄取实验
将B16F10细胞(1×105/孔)接种于12孔板，过夜培养，分别加入聚合物胶束/FITC-DNA复合物和空白FITC-DNA溶液，在孵箱中培养3h之后，使用PBS(PH＝7.4)洗细胞三次，终止细胞对加入复合物或溶液的摄取，收集细胞，并将细胞置于流式细胞仪中检测细胞的阳性率，结果如图9所示。
结果显示，通过胶束携载FITC-DNA后可以明显提高复合物的入胞效率，仅3小时后就可以将胶束/FITC-DNA复合物进入接近80％的细胞内，而单独的裸FITC-DNA几乎无法进入细胞。
(3)聚合物胶束/FITC-DNA复合物
取大鼠皮，脱脂棉小心去除皮肤的皮下组织和脂肪，用生理盐水洗净皮肤，将皮肤固定在Franz透皮扩散池的供给室和接受室之间，角质层朝上，接受室注满PBS溶液(PH＝7.4)，供给室加入1ml制备好的含有聚合物胶束和FITC-DNA的混合溶液，用封口膜封口，避免供给室液体蒸发。扩散池放在32℃恒温水浴中持续搅拌，转速为300rmp，经过24小时后停止实验，拆除扩散池装置，用棉签轻轻将皮肤擦拭干净，置于载玻片上，立刻置于共聚焦显微镜下观察聚合物胶束/FITC-DNA复合物在皮肤内的分布。
以垂直皮肤角质层为z轴，以皮肤角质层为扫描起点，沿着z轴进行皮肤的逐层扫描，每间隔10μm扫描一次。以488为FITC激发波长，以空白的FITC-DNA溶液为对照组，观察皮肤内荧光，结果如图10所示。